同时分离和培养兔外周血平滑肌祖细胞和内皮祖细胞.pdf

第4 6 卷第1 期 2 0 1 0 年1 月 南京大学学报 自然科学 j o u r n a i 0 fn a n j i n gu n i v e r s i t y n a t u r a ls c i e n c e s v 0 1 4 6 n o 1 j a n 2 0 1 0 同时分离和培养兔外周血平滑肌祖细胞和内皮祖细胞 杨斌 陈簧 周六化 孙则禹 戴玉田 南京大学医学院附属鼓楼医院泌尿外科 南京 2 1 0 0 0 8 摘要 同时分离和培养兔外周血平滑肌祖细胞 s p c 和内皮祖细胞 e p c 为组织工程膀胱的构建 和血管化提供种子细胞 分离新西兰兔外周血中的单个核细胞 分别进行s p c 和e p c 的分离和培养 同 时 培养兔膀胱平滑肌细胞 b s m c 作为对照 细胞爬片 观察细胞摄取d i l a c l d i 和结合f i t c u e a i 的能力 间接免疫荧光染色观察平滑肌肌动蛋白 s m a 结蛋白 d e s m i n k d r e n o s 和v w f 的表达 情况 进行细胞增殖实验 观察p d g f b b v e g f 对s p c 和e p c 的增殖作用 结果发现 培养l 周后出 现s p c 克隆和e p c 克隆 s p c 呈梭形 长短不一 e p c 形态均一 呈典型的鹅卵石形 培养的b s m c 形 态均一 为长梭形 呈峰谷样形态 利用克隆环分离s p c 和e p c 克隆 继续培养可得到高纯度的s p c 和 e p c s p c 不摄取d i l a e l d i 不结合f i t c u e a 1 s p c 表达s m a d e s m i n 和k d r 不表达e n o s 和 v w f e p c 同时摄取d i l a c l d i 和结合f i t c u e a 1 e p c 表达e n o s v w f 和k d r 不表达s m a 和 d e s m i n b s m c 仅表达s m a 和d e s m i n p d g f b b 仅能促进s p c 增殖 v e g f 仅能促进e p c 增殖 均具 有剂量依赖效应 本研究建立了同时分离和培养外周血s p c 和e p c 的技术 所培养的细胞具有较高的 纯度 可以作为种子细胞进行组织工程膀胱及其i i l l 管化的研究和应用 关键词 平滑肌祖细胞 内皮祖细胞 平滑肌细胞 组织工程 再生医学 生长因子 血管化 中图分类号 r6 9 4 q8 1 3 1 s i m u l t a n e o u si s o l a t i o na n dc u l t u r eo fs m o o t hm u s c l ep r o g e n i t o rc e l la n d e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l lf r o mr a b b i tp e r i p h e r a lb l o o d y a n gb i n c h e ny u n z h o ul i u h u a s u nz e 一玩 d a iy u t i a n d e p a r t m e n to fu r o l o g y a f f i l i a t e dd r u mt o w e rh o s p i t a lo fn a n j i n gu n i v e r s i t ym e d i c a ls c h o o l n a n j i n g 2 1 0 0 0 8 c h i n a a b s t r a c t t h eo b j e c t i v eo ft h i ss t u d yw a st os i m u l t a n e o u s l yi s o l a t ea n dc u l t u r es m o o t hm u s c l ep r o g e n i t o rc e l l s p c a n de n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l e p c f r o mr a b b i tp e r i p h e r a lb l o o df o ru s ea sc e l ls o u r c e si nt i s s u ee n g i n e e r i n g o fb l a d d e ra n dv a s c u l a r i z a t i o n i nt h i ss t u d y s p ca n de p cw e r es i m u l t a n e o u s l yi s o l a t e da n dc u l t u r e df r o mt h e p e r i p h e r a lb l o o do fn e wz e a l a n dr a b b i t a n dr a b b i tb l a d d e rs m o o t hm u s c l e b s m c w e r ec u l t u r e da n du s e da s s m o o t hm u s c l ec e l lp o s i t i v ec o n t r 0 1 t h ec e l l sw e r ec u l t u r e do ne o v e r s l i p sa n da p p l i e df o ru p t a k eo fd i l a c l d la n d b i n d i n go ff i t c u e a 一1 i n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n ts t a i n i n gw a sp e r f o r m e dt oc h a r a c t e r i z et h ec u l t u r e dc e l l su s i n g 基金项目 南京市卫生局医学科技发展重点资助项目 z k x 0 7 0 0 8 收稿f 1 期 2 0 0 9 0 4 0 5 通讯联系人 e m a i l y t d a i h o t m a i l c o r n 万方数据 第1 期杨斌等 同时分离和培养兔外周m 平滑肌祖细胞和内皮祖细胞 9 3 m o n o c l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s ts m o o t hm u s c l ea c t i n s m a d e s m i n k d r e n o sa n dv w f e e l lp r o l i f e r a t i o na s s a y w a sa l s ou s e dt oi n v e s t i g a t et h em i t o g e n i ce f f e c to fp d g f b ba n dv e g fo nb o t ht h es p ca n de p c b o t ht h es p c a n de p cc l o n e se m e r g e da f t e ro n ew e e ko fc u l t u r e t h es p cd i s p l a y e df u s i f o r ms h a p ew i t hd i f f e r e n ts i z e t h ee p c s h o w e dt h ec o b b l e s t o n em o r p h o l o g yt y p i c a lo fe n d o t h e l i a lc e l l s t h eb s m cc u l t u r e df r o mr a b b i te x h i b i t e dt h e e l o n g a t e ds h a p ea n dh i l la n dv a l l e y sp a t t e r nb e f o r ec o n f l u e n c e t h ec l u s t e ro fs p ca n de p cw e r ei s o l a t e da n d s u b c u h u r e du s i n gc l o n i n gc y l i n d e r s a f t e rw h i c ht h eh i g h l yp u r i f i e ds p ca n de p ch a db e e no b t a i n e d t h es p c d i s p l a yn oa b i l i t yo fu p t a k eo fd i l a c l d la n db i n d i n go ff i t u e a 一1 w h i l et h ee p ct o o k u pd i l a c l d la n d s h o w e df l t u e a 一1b i n d i n ga f f i n i t y i ni n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n ts t a i n i n g t h es p cd e m o n s t r a t e dp o s i t i v e s t a i n i n gf o rs m a d e s m i na n dk d r w h i l en e g a t i v es t a i n i n gf o re n o sa n dv w f t h ee p cs h o w e dp o s i t i v es t a i n i n g f o rk d r e n o sa n dv w f w h i l en e g a t i v es t a i n i n gf o rs m aa n dd e s m i n t h eb s m cs t a i n e do n l yp o s i t i v ef o rs m a a n dd e s m i n p d g f b bh a dd o s e d e p e n d e n tm i t o g e n i ce f f e c to ns p c a n dv e g fh a dd o s e d e p e n d e n tm i t o g e n i ce f f e c t o ne p c i nc o n c l u s i o n t h eh i g h l yp u r i f i e ds p ca n de p ch a db e e ns i m u l t a n e o u s l yi s o l a t e da n dc u l t u r e df r o mr a b b i t p e r i p h e r a lb l o o d a n dc a nb eu s e da sc e l ls o u r c e sf o rt i s s u ee n g i n e e r i n go fb l a d d e ra n dv a s c u l a r i z a t i o n k e yw o r d s s m o o t hm u s c l ep r o g e n i t o rc e l l e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o rc e l l s m o o t hm u s c l ec e l l t i s s u ee n g i n e e r i n g r e g e n e r a t i v em e d i c i n e g r o w t hf a c t o r v a s c u l a r i z a t i o n 平滑肌细胞和内皮细胞是组织工程膀胱的 构建和血管化的重要的种子细胞 其分离和培 养需要满足如下的要求 能够利用自体细胞 避 免免疫排斥反应 容易获取 将给患者带来的伤 害减少到最低 具有与正常细胞类似的结构和 功能 具有快速增殖能力 短期内即能获得数量 足够的种子细胞 1 在以往的研究中 利用活检 的膀胱和血管组织进行细胞的分离和培养是获 得种子细胞的主要途径 2 但是 组织活检本身 会给患者带来伤害 并有加重原发疾病的可能 而且患者的病变部位可能也不适合进行种子细 胞的分离和培养 另一方面 从活检组织培养的 膀胱平滑肌细胞和内皮细胞为完全分化的细 胞 经多次传代后往往会去分化 失去正常细胞 的结构和功能1 3 目前 种子细胞来源受限是制约组织工程 膀胱的研究和应用的关键因素之一 因此 寻找 理想的种子细胞来源是组织工程膀胱研究的重 要内容 4 j 本研究建立了一种新的种子细胞的 分离和培养技术 能同时从兔外周血分离和培 养平滑肌祖细胞 s p c 和内皮祖细胞 e p c 可望为组织工程膀胱的构建和血管化提供种子 细胞 1 实验方法 1 1 主要试剂与仪器淋巴细胞分离液 f i c o i l p a q u ep i u s g eh e a l t h c a r e 瑞典 e g m 一2 培养基 i o n z a 美国 d m e m f 一1 2 培养基 胎牛血清 f b s 和0 2 5 o 0 3 8 的 胰酶 e d t a 消化液 g i b c o 美国 重组人 p d g f b b p e p r o t e c h 美困 纤维连接蛋白和 克隆环 c h e m i c o n 美国 d i i a c l d l b i o m e d i c a lt e c h n o l o g i e s 公司 美国 f i t c u l e x e u r o p a e u sa g g l u t i n i ni f i t c u e a 一1 v e c t o r l a b o r a t o r i e s 英国 小鼠抗平滑肌肌动蛋白 s m a 和结蛋白 d e s m i n s i g m a a l d r i c h 美 国 e n o s b dp h a r m i n g e n 美国 v w f a b c a m 美国 和k d r 单抗 结合有p e r d s y s t e m d a p i 与a l e x af l u o r6 3 3 标记的兔抗 小鼠二抗 m o l e c u l a rp r o b e 美国 c c k 一8 d o j i n d o 日本 细胞培养板 培养皿和培养瓶 c o r n i n g 美国 细胞培养箱 t h e r m o 美国 酶标仪 t e c a n 奥地利 荧光显微镜 z e i s s 德 国 s p c 的培养基为含1 0 f b s 4 0n g m l p d g f b b 不含v e g f 的e b m 一2 全培养基 e p c 的培养基为内含1 0 f b s 的e g m 一2 全 万方数据 9 4 南京大学学报 自然科学 第4 6 卷 培养基 s p c 和e p c 的基础培养基为不含生长 因子 含0 50 af b s 的e b m 一2 培养基 本研究 在南京大学医学院附属鼓楼医院江苏省医学分 子技术重点实验室完成 1 2 兔外周血s p c 和e p c 的分离 培养和纯 化实验动物为健康新西兰大白兔 咒 5 雄性 2 5 3 5k g 购自金陵种兔场 分别在5 只白兔 进行了外周血s p c 和e p c 的分离 培养和纯化 将兔成功麻醉 氟哌利多2m g k g 氯胺酮3 0 m g k g 肌肉注射 后 心脏穿刺抽取外周血2 0 m l 肝素抗凝 然后将外周血与p i g s 等比稀释 5 0m l 离心管中先加入1 0m l 淋巴细胞分离液 再加入1 2m i 稀释的外周血 离心3 0r a i n 离心 条件为4 0 0g 1 8 b r e a ko f f 然后吸取含单个 核细胞的f l j 膜层 离心5m i n 离心条件为4 0 0g 将细胞沉淀用p b s 洗涤l 遍 各取一半细胞 分 别重选于s p c 培养基和e p c 培养基中 接种到 预包被了纤维连接蛋白的培养l l l i 接种密度约为 1 1 0 6 个细胞 e m 2 将细胞置于3 7 5 c o z 9 5 湿度的培养箱中进行培养 第二日更换培养 基 此后每日更换培养基 连续7d 然后隔日更 换培养基 待s p c 和e p c 克隆长至约1 0 0 2 0 0 个细胞后 利用克隆环罩住细胞克隆 然后用胰 酶 e d t a 将细胞消化下来 接种到培养基中继 续培养 1 3兔b s m c 的分离和培养 分别在5 只白 兔进行了b s m c 的分离和培养 将兔麻醉满意 后 经下腹部正中切口进腹 取一小块膀胱肌层 组织 置入p b s 中 然后逐层关闭腹壁 将兔膀 胱组织用p b s 洗涤3 遍 用胰酶 e d t a 3 7 消化1 0m i n 然后用剪刀将其剪成肉糜并置于 0 1 的i 型胶原酶中 3 7 消化1 0r a i n 收集 消化下来的细胞 接种到含1 0 f b s 的 d m e m f 1 2 全培养中进行原代培养和传代 培养 1 4细胞摄取d i l a c l d l 和结合f i t c u e a 1 实验将细胞接种到包被了纤维连接蛋白的 盖玻片上培养 待细胞长至8 0 融合时 更换 含d i l a c i d l 2 5l u g m l 的全培养基 3 7 培养3h 然后吸弃培养基 用p b s 洗涤三遍 再经4 多聚甲醛室温固定1 0m i n 然后在盖 玻片上滴加f i t c u e a 一1 2 0b t g m i 3 7 孵 育1h 然后用p b s 洗涤3 遍 滴加d a p i 0 5 b t g m l 室温孵育5r a i n 用p b s 洗去d a p i 在 荧光显微镜下观察细胞摄取d i l a c l d l 和结 合f i t c u e a 一1 的情况 每1 只白兔所培养的 s p c 和e p c 均进行了本实验 1 5 细胞免疫荧光染色进行细胞鉴定每1 只白兔所培养的细胞均进行了细胞免疫荧光染 色 将细胞接种到包被了纤维连接蛋白的盖玻 片上培养 待细胞长至8 0 融合时 吸弃培养 基 用预冷的丙酮固定细胞1 0m i n 然后用p b s 洗涤三遍 滴加小鼠抗s m a d e s m i n 单抗 均 1 4 0 0 稀释 e n o s 和v w f 均1 2 0 0 稀释 4 过夜孵育 然后用p b s 洗涤三遍 滴加a 1 e x af l u o r6 3 3 标记的兔抗小鼠二抗 1 5 0 0 稀 释 3 7 孵育0 5h 然后用p b s 洗涤三遍 滴 加d a p i 0 5t g m l 室温孵育5m i n 然后用 p b s 洗去d a p i 在荧光显微镜下观察细胞表 达s m a d e s m i n e n o s 和v w f 的表达情况 免疫荧光染色观察k d r 表达时 细胞用4 多 聚甲醛室温固定1 0m i n 其余步骤同前 不用二 抗 用p b s 代替一抗作为阴性对照 1 6 细胞增殖实验将s p c 每孑l4 1 0 3 和 e p c 每孔5 1 0 3 分别接种于9 6 孑l 板 同时设 立对应的不含细胞只有培养基的空白孔 每组 设5 个复孔 培养过夜 待细胞贴壁后 更换含 0 5 f b s 的e b m 一2 基础培养基培养2 4h 使 细胞周期同步化 然后加入1 0 0m l 的含 p d g f b b 或v e g f 生长因子浓度依次为8 0 4 0 2 0 1 0 5n g m l 的基础培养基 作为实验 孔 不含生长因子的基础培养基作为对照孔 培 养4 8h 培养结束后 每孑l j j n 入1 0 肚l 的c c k 一8 溶液 s p c 继续培养3h e p c 继续培养4h 最 后读取4 5 0a m 的0 d 值 参考波长为6 2 0n m 实验孔和对照孔的0 d 值分别减去空白孔的 o d 值 结果用平均值 标准差表示 用 s p s s l 3 0 软件进行单因素方差分析 组间比 较采用l s d 法 p 0 0 5 即认为有显著性差 异 细胞增殖实验重复了4 次 万方数据 第1 期杨斌等 同时分离和培养兔外周血平滑肌祖细胞和内皮祖细胞 9 5 2实验结果 2 1s p c e p c 和b s m c 的形态观察在5 只 白兔进行细胞的分离和培养均获得了成功 将兔 外周血单个核细胞在s p c 全培养基中培养l 周 后 在培养皿中出现s p c 克隆 细胞形态呈梭 形 长短不一 用克隆环将细胞分离传代后继续 诱导培养 细胞逐渐变成长梭形 图1 a 将兔外 周血单个核细胞接种到e p c 全培养基中培养1 周后 在培养皿中出现e p c 克隆 细胞呈均一的 鹅卵石形 图1 b 所培养的s p c 和e p c 均能稳 定传代 并保持快速增长 兔膀胱平滑肌细胞为 长梭形 呈典型的峰谷样形态 图1 c 2 2 细胞摄取d i l a c l d l 和结合f i t c u e a 1 所培养的e p c 具备摄取d i l a c l d l 的能 力 在荧光显微镜下观察呈红色 图2 a 也能 结合f 1 t c u e a 一1 呈绿色荧光 图2 b 两者 双阳性的细胞旱黄色 图2 c s p c 既不能摄取 d i l a c l d l 也不能结合f i t c u e a 一1 图2 同时摄取d i i a c l d l a 和结合f i t c u e a i b 图1s p c a e p c b 和b s m c c 形态学特征 x 2 0 0 的双阳性的细胞是e p c 呈黄色i c x 2 0 0 f i g 1 t h ei i 唧h o l o g i c a ic h 躺c t 嘶s t i 俗o fs p c a e p c f i g 2 t h ec e d e m o n s t r a t dd u b i p o s i t i v f o d i l b a i db s m ci t x 2 0 0 a c l d l a u p t a k ea n df i t c u e a ib i n d i n g b w 嬲 c h a r a c t e r i z e da se p c c 2 0 0 图3s p c 细胞表达s m a i a 和d e s m i ni b 和k d r c 不表达e n o s d 和v w f e 2 0 0 f i g 3 t h es p cd e m o n s t r a t e dp o s i t i v es t a i n i n gf o rs m a a d e s m i n b a n dk d r c w h i l en e g a t i v es t a i n i n gf o re n o s d a n dv w f e 2 0 0 图4e p c 不表达s m a a 和d e s m i n b 表达k d r c e n o s d 和v w f e 2 0 0 f i g 4t h ee p cs h o w e dn e g a t i v es t a i n i n gf o rs m a a a n dd e s m i n b w h i l ep o s i t i v es t a i n i n gf o rk d r c e n o s d a n dv w f e i 2 0 0 图5b s m c 表达s m a a 和d e s m i n b 而不表达k d r c e n o s d 和v w f e 2 0 0 f i g 5 t h eb s m cs h o w e dp o s i t i v es t a i n i n gf o rs m a a a n dd e s m i n b w h i l en e g a t i v es t a i n i n gf o rk d r c e n o s d a n dv w f e 2 0 0 万方数据 9 6 南京大学学报 自然科学 第4 6 卷 2 3s p c e p c 和b s m c 的免疫荧光鉴定 s p c 细胞表达s m a 图3 a 和d e s m i n 图 3 b 还表达k i r 图3 c 在荧光显微镜下呈 红色 不表达e n o s 图3 d 和v w f 图3 e 仅 见蓝染的细胞核 e p c 不表达s m a 图4 a 和 d e s m i n 图4 b 仅见蓝染的细胞核 e p c 表达 k d r 图4 c e n o s 图4 d 和v w f 图4 e 在荧光显微镜下呈红色 b s m c 表达s m a 图 5 a 和d e s m i n 图5 b 而不表达k i r 图 5 c e n o s 图5 d 和v w f 图5 e 2 4 生长因子对s p c 和e p c 的增殖作用 p d g f b b 能促进s p c 增殖 p d g f b b 在5 n g m i 的浓度时即能促进s p c 的增殖 与对 照组相比具有显著性的差异 o d4 5 0 6 2 0n m 5n g m lp d g f b b0 8 0 0 0 2v s c o n t r o l 0 5 5 0 0 3 p 0 0 5 随着p d g f b b 浓度 的升高 其促进s p c 增殖的作用增强 当 p d g f b b 的浓度为8 0n g m l 时 其促进s p c 增殖的作用达到对照组的2 6 4 倍 v s c o n t r o l p 0 0 5 图6 a v e g f 能促进e p c 增殖 v e g f 在5n g m l 的浓度时即能促进e p c 的 增殖 与对照组相比具有显著性的差异 o d 4 5 0 6 2 0a m 5n g m lv e g f0 6 9 0 0 2v s c o n t r o l0 5 2 0 0 4 p 0 0 5 随着v e g f 浓度的升高 其促进e p c 的作用增强 当 v e g f 的浓度为2 0n g m i 时 其促进e p c 增 殖的作用最强 为对照组的1 8 8 倍 v s c o n t r o l p o 0 5 图6b 图6p d g f b b 促进s p c 增殖 具有剂量依赖效应 v e g f 不能促进s p c 增殖 a v e g f 促进e p c 增殖 具有剂量依赖效应 p d g f b b 不能促进e p c 的增殖i b f i g 6 p d g f b bh a dd o s e d e p e n d e n tm i t o g e n i ce f f e c to ns p c w h i l ev e g fh a dn om i t o g e n i ce f f e c to ns p c a v e g fh a dd o s e d e p e n d e n tm i t o g e n i ce f f e c to ne p c w h i l ep d g f b bh a dn om i t o g e n i ce f f e c to ne p c b 3讨论 组织工程膀胱的基本原理就是将体外培养 的种子细胞 接种到支架材料上 形成细胞一支 架材料的复合体 再将其用于膀胱替代 j 构建 膀胱平滑肌组织是组织工程膀胱的关键 这就 需要有大量的结构和功能良好的平滑肌细胞作 为种子细胞l 5 在临床上 需要行膀胱替代的患 者往往合并有膀胱疾病 如神经源性膀胱和膀 胱癌 自体的膀胱平滑肌细胞受病变的影响 可 能并不适合作为构建组织工程膀胱的种子细 胞 l i n 等比较了正常人和神经源性膀胱患者 所培养的膀胱平滑肌细胞 结果发现 神经源性 膀胱疾病患者的平滑肌细胞的收缩能力明显弱 于来自正常人的膀胱平滑肌细胞 6 而且 成熟 的平滑肌细胞在体外培养时会逐渐去分化 失 万方数据 第1 期杨斌等 同时分离和培养兔外周血平滑肌祖细胞和内皮祖细胞 9 7 去正常乎滑肌细胞的结构和功能 研究发现 膀 胱平滑肌细胞每传代一次 平滑肌细胞的标记 如肌球蛋白重链和平滑肌特异性抗原的表达会 减少2 0 士c 副 我们研究也发现 培养的第2 代人膀胱平滑肌细胞 表达s m a 和d e s m i n 的 细胞占9 8 以上 当传代至第7 代时 s m a 和 d e s m i n 的阳性细胞率会降至5 0 左右 因此 我们需要进一步探寻合适的种子细胞用于构建 膀胱平滑肌组织 s p c 被认为是平滑肌细胞的前体细胞 能 直接分化为平滑肌细胞 这为组织工程膀胱提 供了新的种子细胞来源 7 s i m p e r 等首次证实 人外周血中存在s p c 将人外周血单个核细胞 接种到含p d g f b b 的e g m 一2 培养基中 所培 养出的s p c 为梭形 这类细胞表达成熟平滑肌 细胞特异性标记如肌动蛋白 肌球蛋白重链等 与成熟平滑肌细胞不同 这类细胞还表达祖细 胞的标记c d 3 4 和v e g f 的受体k i r 旧 s i m p e r 等进一步利用免疫磁珠技术分选出外周血 中的c d 3 4 阳性细胞 将其接种到含p d g f b b 的培养基中培养 也能得到s p c 这证实了 s p c 可能起源于c d 3 4 阳性的细胞哺 y a m a s h i t a 等还证实 k d r 阳性的胚胎千细胞在 v e g f 的诱导下能分化为内皮细胞 而在 p d g f b b 的诱导下则会向平滑肌细胞分化 这 进一步证实了k d r 可能是s p c 的标记之 一 9 本研究中所培养的s p c 呈梭形 表达 s m a 和d e s m i n 等平滑肌细胞的特异标记 与 成熟平滑肌细胞不同的是 s p c 还表达祖细胞 标记k d r 而与e p c 不同是 s p c 又不表达内 皮特异性标记e n o s 和v w f 这表明 兔外周 血s p c 是不同于成熟平滑肌细胞和e p c 的一 类细胞 复合平滑肌的前体细胞的特征 细胞增 殖实验表明 予以p d g f b b 刺激后 s p c 的增 殖活性明显增强 具有剂量依赖效应 而v e g f 不能促进s p c 的增殖 因此 在培养基中添加 p d g f b b 能促进s p c 的快速增殖 可在短期 内获得大量的s p c 作为种子细胞 如何促进体外构建的膀胱组织植入体内后 的充分快速血管化是目前组织工程膀胱所面临 的主要问题之一 1 l e v e n b e r g 等将人脐静脉 内皮细胞用于骨骼肌组织的体外预血管化 在 体外观察到微血管网络的形成 为了避免免疫 排斥反应 l e v e n b e r g 等将这种体外预血管化 的肌组织种植入到免疫缺失的大鼠背部皮下 后 观察到体外预先形成的微血管网络与宿主 自身的微血管吻合起来 使肌肉组织建立了良 好的血液循环r 10 1 o t t 等先将体外培养的大鼠 心肌细胞接种到支架材料上构建组织工程心 脏 再利用大鼠主动脉内皮细胞进行预血管化 也取得了的成功 1 1 这些研究提示 利用内皮 细胞将体外构建的组织工程膀胱平滑肌进行预 血管化 使其预先形成血管结构 以使植入体内 后能与宿主自身的血管吻合 从而迅速建立血 液循环 因此 组织工程膀胱的血管化 还需要 合适的内皮细胞作为种子细胞 e p c 是内皮细胞的前体细胞 其存在于脐 带血 成体骨髓和外周血中 体内和体外实验证 实 e p c 能够分化为内皮细胞 同时还分泌促 进血管新生的生长因子 能够促进新生血管的 形成 e p c 移植能促进糖尿病所致的肢体缺血 区和心肌梗死区的新生血管形成 改善缺血区 的血液供应 从而改善组织和器官的功能 l 2 1 在组织t 程的研究方面 e p c 也有极大的研究 和应用价值 w u 等报道了e p c 和平滑肌细胞 在多孑l 性支架材料上的生血管潜能l l3 s h e p h e r d 等利用e p c 对组织工程皮肤进行预血管 化 将e p c 联合角质化上皮细胞种植于人真皮 无细胞基质上 体外孵育进行预血管化后再植 入大鼠体内 观察到由e p c 所形成的血管网络 和大鼠自身的血管网络的长入 14 国内也有学 者将e p c 用于组织工程皮肤的预血管化研 究 1 5 e p c 在治疗性新生血管形成中的应用和 在体外构建的组织中的生血管潜能 提示我们 将其用于组织工程膀胱血管化的可能 本研究 中 将兔外周m 分离得到的单个核细胞 接种于 e g m 一2 全培养基中 约1 周后即会出现e p c 克隆 利用克隆环对细胞克隆进行分离和纯化 继续培养 所培养的祖细胞具有典型的鹅卵石 样的形态 既具备摄取d i l a c l d l 的能力 又 万方数据 9 8 南京大学学报 自然科学 第4 6 卷 能结合f i t c u e a 一1 二者双阳性 这类细胞被 认为是正在分化的e p c l6 进一步研究发现 e p c 表达内皮细胞特异性的e n o s 和v w f 还 表达k d r c d 3 4 和k d r 被认为是e p c 的标 记 这也提示我们 s p c 和e p c 可能有共同的 起源f l 引 细胞增殖实验表明 v e g f 能促进兔 外周血e p c 增殖 具有剂量依赖效应 e p c 在 v e g f 的作用下会快速增殖 很快达到接触抑 制n i f 需要进行传代培养 p d g f b b 不能促进 e p c 增殖 反而会抑制e p c 增殖 这可能是因 为e p c 在p d g f b b 的作用下发生了转分化 有文献报道 长期予以p i g f b b 刺激 会促进 e p c 向平滑肌细胞分化l l 7 获得高纯度的种子细胞是组织工程膀胱的 构建和体内移植的重要条件 种子细胞的分离 和纯化是组织工程学研究的重要内容 种子细 胞的分离和纯化技术的选择需要结合种子细胞 自身的特征 本研究中 s p c 和e p c 都具有干 祖细胞的克隆样生长的特征 因此 我们利用了 克隆环进种子细胞的分离和纯化口8 1 待原代培 养的s p c 和e p c 克隆长至约1 0 0 2 0 0 个细 胞后 利用克隆环将细胞克隆罩住 然后用消化 液将克隆环内的种子细胞消化下来 接种到培 养基中继续培养 这样就能获得高纯度的s p c 和e p c 克隆环法是一种简单 实用和经济的 干 祖细胞分离和纯化技术 具有效率高 操作 方便的优点 目前已被广泛地用于细胞克隆的 挑选和纯化n 引 综上所述 本研究建立了同时从兔外周血 分离和培养s p c 和e p c 的技术 所培养的 s p c 和e p c 具有较高的纯度 具有成熟平滑肌 细胞和内皮细胞的特征 又具有祖细胞的特征 可以作为组织1 程膀胱的构建及血管化研究和 应用的种子细胞 外周血来源的组织工程膀胱 的种子细胞 不仅容易获取 仅须极小的创伤即 能同时完成两种细胞的分离和培养 而且利用 同源自体细胞 还能避免免疫排斥反应 是较理 想的组织工程膀胱的种子细胞 这类种子细胞 在组织丁程膀胱构建和血管化方面的效应还需 要进一步研究 1 0 1 1 3 r e f e f e n c e s g r i f f i t hlg n a u g h t o ng t i s s u ee n g i n e e r i n g c u r r e n tc h a l l e n g e sa n de x p a n d i n go p p o r t u n i t i e s s c i e n e e 2 0 0 2 2 9 5 5 5 5 7 1 0 0 9 1 0 1 4 a t a l aa b a u e rsb s o k e rs e ta 1 t i s s u e e n g i n e e r e da u t o l o g o u sb l a d d e r sf o rp a t i e n t sn e e d i n gc y s t o p l a s t y l a n c e t 2 0 0 6 3 6 7 9 5 1 8 1 2 4 1 1 2 4 6 b a k e rsc s o u t h g a t ej t o w a r d sc o n t r o lo f s m o o t hm u s c l ee e l ld i f f e r e n t i a t i o ni ns y n t h e t i c 3 ds c a f f o l d s b i o m a t e r i a l s 2 0 0 8 2 9 2 3 3 3 5 7 3 3 6 6 f r i m b e r g e rd l i nhk k r o p pbp t h eu s e o ft i s s u ee n g i n e e r i n ga n ds t e mc e l l si nb l a d d e r r e g e n e r a t i o n r e g e n e r a t i v em e d i c i n e 2 0 0 6 1 4 4 2 5 4 3 5 k a n e m a t s ua y a m a m o t os o g a w ao c h a n g i n gc o n c e p t so fb l a d d e rr e g e n e r a t i o n i n t e r n a t i o n a lj o u r n a lo fu r o l o g y 2 0 0 7 1 4 8 6 7 3 6 7 8 l i nhk c o w a nr m o o r ep e ta 1 c h a r a e t e r i z a t i o no fn e u r o p a t h i cb l a d d e rs m o o t hm u s c l e c e l l si nc u l t u r e t h ej o u r n a lo fu r o l o g y 2 0 0 4 1 7 1 3 1 3 4 8 1 3 5 2 m ant g a opj r e s e a r c ha d v a n c e m e n to f s m o o t hm u s c l e p r o g e n i t o rc e l l p r o g r e s s i n p h y s i o l o g i c a ls c i e n c e s 2 0 0 8 3 9 1 8 7 9 0 马宁涛 高平进 平滑肌祖细胞研究进展 生 理科学进展 3 9 1 8 7 9 0 s i m p e rd s t a l b o e r g e rpg p a n e t t acj e ta 1 s m o o t hm u s c l ep r o g e n i t o rc e l l si nh u m a nb l o o d c i r c u l a t i o n 2 0 0 2 1 0 6 1 0 1 1 9 9 1 2 0 4 y a m a s h i t aj i t o hh h i r a s h i m am e ta 1 f l k l p o s i t i v ec e l l sd e r i v e df r o me m b r y o n i cs t e m c e l l ss e r v ea sv a s c u l a rp r o g e n i t o r s n a t u r e 2 0 0 0 4 0 8 6 8 0 8 9 2 9 6 l e v e n b e r gs r o u w k e m aj m a c d o n a l dm e t a 1 e n g i n e e r i n gv a s c u l a r i z e ds k e l e t a lm u s c l et i s s u e n a t u r eb i o t e e h n o l o g y 2 0 0 5 2 3 7 8 7 9 8 8 4 0 t thc m a t t h i e s e nts g o hsk e t a l p e r f u s i o n d e c e l l u l a r i z e dm a t r i x u s i n g n a t u r e s 1 2 3 4 5 6 7 8 9 万方数据 第1 期杨斌等 同时分离和培养兔外周血平滑肌祖细胞和内皮祖细胞 9 9 p l a t f o r mt oe n g i n e e rab i o a r t i f i c i a lh e a r t n a t u r e m e d i c i n e 2 0 0 8 1 4 2 2 1 3 2 2 1 12 k h a k o oay f i n k e lt e n d o t h e l i a lp r o g e n i t o r c e l l s a n n u a lr e v i e wo fm e d i c i n e 2 0 0 5 5 6 7 9 1 0 l 1 3 3 w ux r a b k i n a i k a w ae g u l e s e r i a