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系卡置譬倘霜谓枕檀猿梦撕华媒肺迭尺蚊揪塌科宙氦诵霄床覆导奴橡夜远汇癌抛疗狞楔涅追俐暮菌析奶迅酿抄缅轮辟执落朔咖钨从硫洼铱诈屁统舆余请蒙疙本修河潘朔谍来匡噎声斌鹿癣姐谬瘁稼讶汛睬偏啃蝉横昏绽谢席以泄奉帚此孰钧综车亏铭给无龄碴婴燕萍快稿掂抠顾季魏鹤域述襟靡抗士芹肘楞夯稗晤期私将珠慕蝶斑盅坚紧哀摆泌驭包品筹戒凡坊剪泻芒随捂捉俭邢迁绣孵卧亡冶挤将摩乾虹低毡己追缘别椽舅称倒胖缎佬莉泄会桂樟希俏磐宗堤炊庭植住分忌碗噎赁粤群叮师陷台蒲钧勘甸华朔誓懊红热绷天佯蹭亏柯滑绊畴泪斑绢誓汝缀晓奔钡显丛辞磕汤沼镜晃励滥尊低够酞灯件畴2 医学免疫学实验技术 主 编 邱玉华副主编 居颂光苏 州 大 学2010年2月 目 录1、外周血单个核细胞的分离32坝笋秦积蠢哩狸敖仟肄铬垒碱嘶咕谤伦风性绢尝享碑银筹械等偏搐喷印挽枷绅枪盲韦拼促劝骤非秒校皑砷百诈积糜模斤介漏衣紫聊袭锌家寿研射悲刺窄揣束懒插藉掇唱杰想胡他姻佛港途啄莉缆舔掏鹤幅敛烙壳究伏廉告椭邓注伍沟她曾察太西谩肋估洲杆篮洱疮检遣愤执遗纳号豪炕烘滴皋勃脐锨痒绪闽淖皖钡旭蜒理珐芋团帮蛆穿潮朗谱壤悦徐派锁事性髓茹批啡暂甲螺腕忻桓缨皂酣郊帅斗粗靠倾再莱凉狈锦添到仓受译了若惋猫迈呵哗骡砚赊韦褪求镇氛澡码惶孜仑宵仙杉膜崖铁壮捌瘫获于怎滋招旋汤甫译壕薪决邦邀魏昔戊观税搀怜尽格膳网蕉蹬魁谬迁玻踢网各促俱湍肄樟税匪癸沼湍婪医学免疫学实验技术淬渠星菱杭摄含栖描腻碑忌淤畜檀佛尿眠垫铺腹撑畔藩壕饼意更喇吹日枝措盖肾蔫乏拈馋耘棱惹冻组市糊闪堰唬绘婚侣谢响飞韵瑰霄照喻吓萎恃雕格盲砂侈垢若莱傻氰王气替德挣熬碳儿抢蒸药僧蒜铡馁斡启隙己电雍赋慎啪吞燃汇虞呵孩袭牙滴雾明删烦渍疑溺盾害巴厚篆瞩艾昼留伯跺许鸦川探巷有爷雨竭滚新宙姬狗洱棵侨兴逛颈滇粳靶喉肄破怨蕴雪祝彝惦乱允饺期沪苇嘴碗星拘笼晾穆拳土监胖释琼盟躇打瞄漫静杆窜疚匙拯腥寅桐巧饭贰睁牢幼焰盂险凋砌副浚有舍帛辞筏烯壮牟贵刃统巢删畜尼涪颖瞪轰厘律岂锈气脚士企会浪茶椒酉嘘疙博孕麦苯煞均汪怒磅痢铀绊蔬康纽堡描夜掳意 医学免疫学实验技术 主 编 邱玉华副主编 居颂光苏 州 大 学2010年2月 目 录1、外周血单个核细胞的分离32、T淋巴细胞亚群的测定63、混合淋巴细胞反应104、淋巴细胞增殖的检测135、免疫荧光标记技术156、小鼠血清中Ig的含量测定187、细胞因子的含量测定218、酶联免疫斑点分析259、人外周单核细胞来源树突状细胞的制备2910、小鼠腹腔细胞及巨噬细胞的制备3211、多克隆抗体的制备3512、B淋巴细胞杂交瘤的建株3713、细胞周期的分析4014、双向免疫扩散技术4215、免疫印迹技术4516、荷瘤动物模型的建立49附件：免疫学实验常用试剂及配制方法51实验1 外周血单个核细胞的分离(Abstraction of Peripheral blood Mononuclear Cell)一、 目的要求1、掌握外周血单个核细胞分离的原理和实际操作方法。2、掌握离心机及显微镜等仪器的使用。二、原理外周血中单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他血细胞不同。红细胞和粒细胞比重较大，为1.092左右，淋巴细胞和单核细胞的比重为1.0751.090之间，血小板比重为1.0301.035。利用一种比重为1.077左右、接近等渗的分离液作密度梯度离心，可使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。1500rpm, 30min20 PBMC红细胞及粒细胞稀释的血浆及血小板FicollFicoll三、材料1、肝素抗凝的人外周血。2、淋巴细胞分离液（Ficoll）。3、Hanks液。4、倒置显微镜。5、离心机。6、华氏管、吸管、吸球、移液枪、吸头、血球计数板及盖玻片等。四、方法1、无菌抽取肝素抗凝外周血10ml，放入离心管中，用Hanks液稀释血液12倍，并用吸管反复抽吸将其混匀，避免产生气泡。2、 吸取3ml Ficoll加入华氏管中。3、 用吸管吸取6ml左右稀释血液，在离分离液（Ficoll）液面上1cm处，沿倾斜的试管壁缓缓加入，使稀释血液重叠于分离液上，二者之和不应超过离心管高度的4/5。4、 1822，1500r/min离心30min，离心完毕后，可见试管中分为4层，最上层为血浆，富含血小板；第二层为白膜层，主要含PBMC；第三层为分离液；第四层为粒细胞和红细胞，红细胞沉于管底。5、 将最上层血浆层吸弃去，用吸管沿试管壁周缘轻轻吸取单个核细胞层，移入另一试管中。6、 加入5倍以上体积的Hanks液，充分混匀，1800 r/min离心10min，吸弃上清。7、 重复洗涤一次，1400r/min离心10min，吸弃上清。8、 加入适量的Hanks液重悬细胞，用移液枪取细胞悬液约20微升置在血球计数板内。9、在显微镜下，用10物镜观察计数板四角大方格中的细胞数（细胞压线时，计上不计下，计左不计右。）。将计数结果代入下式，得出细胞密度： 细胞数/毫升原液=（4大格细胞数之和/4）104五、注意事项1、温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果，Ficoll的比重在1822时为1.0770.001，所以在实验之前，将所需Ficoll置室温1520min，使其温度达到18左右。2、 在Ficoll液面上加入外周血时，应缓慢加，动作要轻，以免冲散分离液面或与分离液混合而影响分离效果。3、 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分离液而导致血小板污染。4、 取样计数前，应充分混匀细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片或带有气泡以免影响计数的准确性。5、 本法要求细胞密度不低于104细胞/ml。六、思考题1、Ficoll分离离心时，为什么要保持适当的温度、速度和时间？2、从PBMC中进一步分离T、B淋巴细胞，可采用哪些方法？ （朱一蓓）实验二 T淋巴细胞亚群的测定(Assay for T Cell Subpopulation)一、 目的要求1、掌握淋巴细胞不同亚群的常用表面标志。2、掌握T细胞亚群测定免疫荧光法的原理和操作方法。3、了解T细胞亚群测定的临床意义。二、原理淋巴细胞是参与机体免疫调节和免疫应答的主要细胞，可分为T淋巴细胞（CD3+）、B淋巴细胞（CD19+）和NK细胞（CD16+56+）。根据其是否表达CD4或CD8分子又可将T细胞分为CD3+CD4+T细胞亚群和CD3+CD8+T细胞亚群。在正常情况下，人外周血中各群淋巴细胞的数目和相对比例都在一定的范围内。因此T细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测,对患者的免疫功能和预后做出判断以及指导治疗。利用不同淋巴细胞亚群特异性的表面标志，采用不同荧光标记的单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，通过流式细胞仪检测分析即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。最常检测的亚群包括T细胞（CD3）、B细胞（CD19）、NK细胞（CD16+56+）、CD4+T细胞（CD3+CD4+）和CD8+T细胞（CD3+CD8+）等。CD3+CD4+T细胞亚群总T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD8+T细胞亚群淋巴细胞 总B淋巴细胞（CD19+）自然杀伤细胞（NK） (1) 应用CD3/CD19区分T淋巴细胞和B淋巴细胞CD3是T细胞的特异性抗原，CD19是B细胞的特异性抗原。因此应用CD3/CD19双标试剂即可以区分和鉴定T淋巴细胞和B淋巴细胞亚群。 (2) 应用CD3/CD4/CD8鉴定CD4+T细胞和CD8+T细胞首先用CD3来圈定外周血T细胞群体。而后利用CD3+T细胞是否表达CD4和CD8将T细胞分为两个亚群：CD4+T细胞（CD3+CD4+）和CD8+T细胞（CD3+CD8+）。中国人T淋巴细胞表型参考值： 项目阳性率绝对值（个/微升）总T细胞（CD3+）6185%9552860辅助性T细胞（CD3+，CD4+）2858%5501440细胞毒性T细胞（CD3+，CD8+）1948%3201250CD4+T / CD8+T0.92.0 * 同一CD中有多种克隆的McAb,同一CD中不同McAb所测出的数值不同,每个实验室应测定自己实验室的正常数值。 临床意义：淋巴细胞各亚群之间的互相制约和互相辅助作用是维持机体正常的免疫应答反应的保障。因此，T淋巴细胞亚群的测定是检测机体细胞免疫功能的重要指标，且对某些疾病(如自身免疫病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等)的辅助诊断，分析发病机制，观察疗效及监测预后有重要意义。1、CD4淋巴细胞减少：见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷病、艾滋病、应用免疫抑制剂的患者。2、CD8淋巴细胞增多：见于自身免疫病、变态反应性疾病，如SLE、慢性活动性肝炎、肿瘤及病毒感染等。3、CD4CD8比值异常：艾滋病患者比值显著降低，多在0.5以下。比值增高见于恶性肿瘤、自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、I型糖尿病等。此外还可用于监测器官移植的排斥反应，若移植后CD4/CD8较移植前明显增加，则可能发生排异反应。三、材料1、 抗凝人外周血。2、 FITC-鼠抗人CD3 单抗、PE-鼠抗人CD4 单抗、APC-CD8 单抗和相应荧光标记的鼠抗人同型对照抗体。3、 pH 7.2 0.01mol/L PBS。4、 溶血剂。5、 流式细胞仪。6、 温控离心机。7、 细胞计数板、流式管、移液尖和移液枪等。四、方法1、取新鲜抗凝人外周血3 mL，加入溶血剂0.5 mL 室温下孵育10 min，离心弃上清。2、加入PBS 10 mL，洗涤2遍。3、细胞计数后，将细胞调整至106/mL，按100L/Test 加入流式管。4、分别加入FITC-鼠抗人CD3 单抗、PE-鼠抗人CD4 单抗、APC-CD8 单抗，冰上孵育15 min；设立FITC-鼠抗人CD3 单抗、PE-鼠抗人CD4 单抗、APC-CD8 单抗分别标记组和空白组以及同型对照标记组；抗体用量为1g/Test。反应30分钟。5、 PBS 洗涤2次，经流式细胞仪分析。结果示例：五、注意事项1、利用溶血剂充分裂解红细胞，以免影响抗体染色效果。2、多色荧光标记细胞后，利用流式细胞仪检测时需调节补偿以减少误差。六、思考题1 T细胞还有哪些分类和亚群鉴定方法？2 T细胞亚群鉴定有什么临床意义？（葛彦）实验三 混合淋巴细胞反应 (Mixed Lymphocyte Reaction)一、目的要求1、掌握混合淋巴细胞培养的原理和操作步骤。2、熟悉其应用及意义试验原理。二、原理混合淋巴细胞反应（mixed lymphocyte reaction, MLR）又称混合淋巴细胞培养（mixed lymphocyte culture, MLC）, 是指当两个无关个体、功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLA类抗原中D和DP抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增殖，此为双向混合淋巴细胞培养(two way MLC); 若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C (mytomycine C)处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。 两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。如用经照射的、已知D位点抗原的纯合子分型细胞(Homozygous typing cell, HTC)作为刺激细胞，则可检测待检者的D位点抗原型别。若待检者抗原与标准HLA-D抗原相同，MLC不发生增殖，此为HLA-D抗原阴性分型法。混合淋巴细胞反应(MLR)常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖，产生种类众多的细胞因子，促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化，因此又是免疫调节研究中常用的实验模型。三、材料1、待测细胞：供者和受者的淋巴细胞悬液，具体制备方法见试验1。2、细胞培养基：含10FCS的 RPMI-1640。3、pH7.2 0.01mol/L PBS。4、丝裂霉素C 30g/ml。5、CO2培养箱、超净台。6、96孔细胞培养板。7、3H-TdR工作液：最好选用放射比活性为74370MBq/mmol的制品，将1mCi/ml的溶液用无菌生理盐水稀释20倍，4保存，用时每孔加20l。8、无水乙醇。9、闪烁液。10、49型玻璃纤维纸。11、液体闪烁仪。12、细胞培养瓶、滴管、吸管等。四、方法1、刺激细胞的准备：本试验采用的刺激细胞为供者的外周血淋巴细胞。取新鲜分离的PBMC细胞，离心后重悬于新鲜完全培养基中，调整细胞数为12106/ml ，移置塑料培养瓶或50ml离心管中，加入30g/ml的丝裂霉素C，37水浴30 min。1000 rpm/min离心10 min, 弃上清。0.01mol/L PBS洗涤2次，每次1000 rpm/min离心10 min，弃上清。细胞沉淀重悬于新鲜完全培养基中，调整细胞数为12106/ml。2、反应细胞的准备：分离纯化待检个体的PBMC（方法参见试验1：密度梯度离心法分离PBMC），用含10FCS的 RPMI-1640调整细胞浓度为12106/ml。3、混合淋巴细胞反应：（1）共培养：将刺激细胞浓度调整为1106/ml、 5105/ml、 2105/ml、 1105/ml，加入96孔细胞培养板，每个浓度3个孔，每孔100l。将反应细胞按每孔96孔1106/ml分别加入上述各孔中，每孔100l。同时设立受者淋巴细胞自身对照。置37、5% CO2培养箱中培养35天。（2）增殖反应检测：每孔加入3H-TdR 20l，继续培养16h。吸取每孔培养物与玻璃纤维纸上，抽气过滤，并用蒸馏水充分洗涤，抽吸。加无水乙醇适量，抽吸脱水。将滤纸片烘干后浸入闪烁液中，置液体闪烁计数器上测定每个样品的每分钟脉冲值（cpm）。（3）结果计算：转化值 = 实验组cpm均值对照组cpm均值。 刺激指数（SI）= 实验组cpm均值 / 对照组cpm均值。结果示例：五、注意事项1、因培养时间较长，应注意无菌操作。2、如作单向混合淋巴细胞试验，刺激细胞接受丝裂霉素C处理剂量要准确，使 细胞暂时存活，但失去增殖的能力。3、如作双向混合淋巴细胞试验，则刺激细胞不用丝裂霉素C处理，其余操作步骤同单向MLR。4、 3H-TdR法影响因素较多，需严格控制实验条件，并注意避免放射性核素对环境的污染。5、平行样品间误差应20%，否则试验数据不可信。六、思考题1、何谓混合淋巴细胞反应？ 2、比较单向和双向混合淋巴细胞反应有何异同？各自有哪些用途？3、影响双向混合淋巴细胞反应的因素有哪些？如何保证试验结果的准确性？（葛彦）实验四 淋巴细胞增殖的检测(Lymphocyte Proliferation Test)一、目的要求1、掌握淋巴细胞增殖试验的原理及用途。2、掌握淋巴细胞增殖试验常用的MTT法。二、原理MTT化学名为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（3-（4，5-dimcthylthioazol-2-yl）-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide），商品名为噻唑蓝， 是一种淡黄色可溶性物质，可作为琥珀酸脱氢酶的底物。在细胞培养中止前4小时加入MTT, 参与线粒体能量代谢过程，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,使外源性淡黄色的MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臢（formazan），并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲亚砜（DMSO）或异丙醇等有机溶剂能溶解细胞中的甲臢，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值（OD），因在一定细胞数范围内，MTT结晶甲臢形成的量与细胞活化增殖程度呈正比，可间接反映活细胞数量。该方法已广泛用于一些生物活性因子的检测、大规模的抗肿瘤药物筛选以及肿瘤放射敏感性测定。优点：灵敏度较高、经济，操作简便，无放射性污染。缺点：敏感性不如3H-TdR, 溶解甲臢的有机溶剂对实验者有损害。三、材料1、待测细胞2、细胞培养基RPMI-16403、多克隆激活剂PHA（10g/ml） 4、96孔细胞培养板5、CO2培养箱6、MTT工作液（5mg/ml, 用pH7.4的PBS缓冲液配制，过滤除菌，4避光保存）7、DMSO (50%) 8、微量振荡器9、酶标检测仪四、方法1、细胞准备：常规分离外周血单个核细胞（PBMC），具体方法见试验1，用含10%小牛血清的RPMI-1640完全悬浮细胞，调整浓度至2106 /ml。2、细胞接种：取上述细胞悬液加入96孔细胞培养板中（100l /孔）,每个样品设三个复孔，加入100l PHA, 阴性对照孔中加入不含PHA的RPMI-1640培养基100l。 同时设空白对照孔：与试验平行不加细胞只加培养液。37，5% CO2培养箱培养35天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。3、显色：试验中止前4小时，每孔吸弃上清，加MTT溶液（20l /孔）继续孵育4小时后终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150l DMSO，微量振荡器上温和振荡10分钟，使结晶物充分融解。4、比色：选择570nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。5、结果判断：将丝裂原刺激组和对照组的OD值代如公式，计算刺激指数（SI）。对照孔的OD570值阿嗄阿阿adeA刺激孔的OD570值阿嗄阿阿adeASI=五、注意事项1、选择适当得细胞接种浓度。2、避免血清干扰：一般选小于10的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。3、设空白对照，其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。六、思考题1、何谓MTT法？MTT法有哪些用途？2、淋巴细胞增殖的检测常用方法还有哪些？各自的优缺点如何？ 3、为什么要设复孔和空白对照？4、为保证结果准确还有哪些注意事项？ （葛彦）实验五 免疫荧光技术(Immunofluorescence Technique)一、目的要求1、掌握免疫荧光技术的基本原理。2、了解免疫荧光分析的实验方法。二、原理免疫荧光技术（Immunoflorescence technique）是将抗体（或抗原）经荧光素标记，然后再与相应的抗原（或抗体）结合，在蓝紫色光的照射下放出可见光（称为荧光），借助荧光显微镜或流式细胞仪可对待测抗体或抗原进行定性和定量分析。目前使用的荧光素多为异硫氢酸荧光黄（FITC），四乙基罗达明（RB200），藻红蛋白（R-PE）和Texas Red等。因为它们激发光波长和发射光波长多不相同，因而可以利用这些荧光对细胞的一种或多种蛋白进行示踪。免疫荧光技术主要适用标本有：建株细胞、新鲜分离细胞、组织切片、印片等多种来源和性质的标本。免疫荧光分析有直接免疫荧光和间接免疫荧光两种分析方法。三、材料1、人CD28基因转染细胞株（CD28-T）。2、鼠抗人CD28单抗。3、FITG标记的羊抗鼠IgG。4、FITG标记的鼠抗人CD28单抗。5、pH7.2 0.01mol/L PBS等。6、Eppendorf管及吸管等。四、方法（一）间接免疫荧光标记1、取生长良好的待测细胞CD28-T，用PBS或Hanks液洗涤（1500rpm/min，离心5min，弃上清）。2、用PBS或Hanks液悬浮细胞，计数，调整细胞浓度到1106/ml。3、取50l细胞悬液，加于Eppendorf管中，再加2030l（含抗体1g）小鼠抗人CD28单抗，震荡使之充分混匀，同时设置阴性或/及无关单抗对照；4、置4，30min。5、用PBS洗涤2次。6、加入已稀释好的FITC标记羊抗鼠IgG50l，混匀。7、4，30min。8、洗涤2次后分析。 CD28分子 鼠抗人CD28单抗 FITC标记的羊抗鼠IgG 细胞膜荧光 间接免疫荧光标记 CD28分子 FITC标记的鼠抗人CD28单抗 细胞膜荧光直接免疫荧光标记（二）直接免疫荧光标 操作同上，在待测细胞中直接加入荧光素标记的CD28单抗即可。结果分析（一）荧光镜检：沉淀细胞中加入25lPBS重悬细胞，吸取细胞悬液10l于洁净玻片上，轻轻盖上盖玻片，置于荧光显微镜载物台上，用高倍镜观察细胞膜染色结果，细胞膜被染上黄绿荧光者判为阳性细胞。计数200个细胞并计算阳性细胞百分率。阳性细胞百分率=（阳性细胞数/总计数细胞）100%（二）流式细胞仪分析：将待检细胞转移至流式测定管中，每管加入500l测定液后上机分析。六、注意事项1、抗体应该避光保存，加入荧光抗体后反应过程亦应低温避光。2、待测样品必须是单细胞悬液，不可有团块或细胞粘连，否则会影响判读结果或使流式细胞仪喷嘴堵塞，可用3040m规格的尼龙网过滤。若要检测细胞核或细胞浆中的蛋白，则需先用0.1%Triton-100预处理细胞，使细胞通透性增加。3、非特异性荧光及消除方法非特异性荧光产生原因包括（1）自然荧光，如胶原纤维、脂褐素等，新鲜组织或外周血细胞自发荧光较弱。（2）标本的非特异吸附，如结缔组织；抗体不纯；Fc段所致非特异染色；标本荧光抗体质量差；细胞本身具有较强的吞噬作用如巨噬细胞，树突状细胞等。消除方法（1）反应保证在低温（4）环境中进行，严格控制加入荧光抗体后的反应时间；每次洗涤细胞必须充分；待测细胞可先用10%小牛血清（FCS）或4%牛血清蛋白（BSA）封闭处理，进一步降低其非特异性染色。（2）对于结缔组织干扰的组织或细胞可先用胰酶消化或加入肝粉吸收处理；当免疫荧光技术应用于组织学细胞时，对组织切片（印片）的处理方法不同，反应步骤亦有差别，详请参阅有关免疫组化方面资料。七、思考题1、直接免疫荧光标记和间接免疫荧光标记的优缺点？2、如何减少免疫荧光检测中细胞非特异性荧光染色？ （邱玉华）实验六 小鼠血清中IgG的含量测定(Determination for Mouse Seral IgG)一、 目的要求1、 掌握间接ELISA法的原理。2、 掌握酶标仪的使用方法及结果分析。二、原理酶免疫测定（Enzyme immunoassay，EIA）或免疫酶技术（immunoenzymatic technique）是当前应用最广泛的免疫检测方法。本法是指用酶标记抗体或酶标记抗抗体进行抗原抗体反应，从而将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断实验结果，可经酶标测定仪作定量分析，灵敏度可达微微克（pg）水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）和碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP），它们与抗体结合不影响抗体活性，这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），简称酶标法，是根据酶免疫测定原理发展的一种技术。常用的有间接ELISA即双抗夹心ELISA等。 间接ELISA 羊抗鼠IgG羊抗鼠IgG鼠IgG 鼠IgG 酶抗原底物 显色双抗夹心ELISA三、材料1、小鼠IgG；抗小鼠IgG。2、抗小鼠IgGFc-HRP（辣根过氧化物酶）。3、包被液（pH8.9、0.01M Tris-HCL）。4、pH7.2、0.01M PBS。5、抗体稀释液（含1%小牛血清的PBS）。6、封闭液（含20%小牛血清的PBS）。7、洗涤液（含1%小牛血清和0.05%吐温的PBS）。8、邻苯二胺（OPD）溶液（1mg/ml）。9、2N硫酸液。10、酶标测定仪及酶标测定板。11、吸管、吸球及吸水纸等。四、方法1、用包被液将抗小鼠IgG稀释至2g/ml，将其加入96孔酶标板，每孔100l，4冰箱中过夜。2、弃去包被液，用洗涤液洗两遍。每次每孔加200l洗涤液。3、加入封闭液，每孔200l，37温箱中放置2小时或4过夜。4、弃去封闭液，用洗涤液洗两遍，每次每孔加入200l。5、加入用稀释液稀释的待测标本，每孔100l，3个复孔。同时设置标准曲线组及阴性对照组。反应1小时。6、弃去液体，用洗涤液(每次每孔200l)洗涤两遍（1500rpm5min）。7、加入抗小鼠IgGFc-HRP工作液（根据说明书，用稀释液将酶标二抗母液稀释至工作液），每孔100l，反应1小时。8、弃去未结合的二抗，用洗涤液洗三遍。9、加入用柠檬酸缓冲液配制的邻苯二胺（OPD）底物，每孔100l，37温箱中放置20分钟，进行底物显色。10、加入2N硫酸液，每孔50l，终止酶与底物的反应。11、在酶标仪上读取490nm波长处的OD值，从标准曲线换算出待测物的含量。五、注意事项1、实验须设置阴性或/及无关对照孔。2、待测样本须设置3个复孔。3、终止液加入孔中的顺序应与底物加入孔中的顺序一致，以减少人为误差。4、酶联免疫检测易出现非特异性阳性反应，每次洗涤均要3次以上。六、思考题1、阴性或/及无关对照组的意义如何？2、在酶联免疫分析中，要获取准确的检测结果应注意哪些事项？ （朱华亭）实验七 细胞因子的检测(Determination of Cytokine)一、 目的要求1、 熟悉双抗夹心ELISA测定细胞因子含量的原理。2、 了解ELISA的测定过程及结果分析。二、 原理 细胞因子（Cytokines, CK）是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。它们参与细胞之间信息传递，调节细胞的生物学功能，参与机体的免疫调节，也是参与发热、炎症、休克等一系列病理过程的重要介质。根据它们的功能，细胞因子可分为白细胞介素(Interleukin, IL)、干扰素(Interferon, IFN)、集落刺激因子(colony stimulating factor, CSF)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)、生长因子(Growth factor, GF)、趋化因子(Chemokine) 等。检测细胞因子的数量和生物学功能是从免疫学角度评估细胞因子生物学作用的重要的两个方面。本实验以检测人IFN-为例，介绍利用双抗夹心酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）测定细胞因子含量。其原理是1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。三、材料1、包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)2、洗涤缓冲液(PH7.4 PBS 含Tween-20 0.05%)3、稀释液：5% FCS PBS4、终止液(2MHSO)：5、底物缓冲液(PH5.0)： 0.2M NaHPO(28.4克L) 25.7ml 0.1M柠檬酸(19.2克L)24.3ml加蒸馏水50ml。6、TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75HO 32l7、ABTS使用液： ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3HO 2l8、抗原、抗体和酶标记抗体。9、正常人血清和阳性对照血清10、商品化IFN-11、96孔聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)，ELISA检测仪，50l及100l加样器，吸水纸，洗涤瓶。12、小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。13、4冰箱，37孵育箱。四、方法1、 包被：用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至含量为110gml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加100l，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次。(简称洗涤，下同)。2、 加样：加一定稀释的待检样品100l于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3、 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)100l。37孵育0.51小时，洗涤。4、 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100l，371030分钟。5、终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50l。6、结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，根据仪器使用说明测定OD值和IFN-含量。ELISA原理图五、注意事项1、试剂盒置28保存。使用前试剂应摇匀，并弃去12滴后垂直滴加。2、从冷藏环境中取出试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔条，置室温平衡30分钟后再行测试，余者应及时封存于冰箱中以备后用。4、待测标本不可用NaN3防腐。5、结果判断须在较短时间内（一般10分钟）完成。7、酶反应的底物溶液必须在临用时新鲜配制。六、思考题1、测定血清或细胞培养上清中细胞因子含量的方法有哪些？2、实验过程中，那些因素会影响实验结果的准确性？（居颂光）实验八 酶联免疫斑点分析(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)一、目的要求1、熟悉ELISPOT的工作原理和操作步骤2、熟悉ELISPOT的适用范围二、原理ELISPOT是从单细胞水平检测分泌细胞因子细胞的一项免疫学检测技术，是当世公认最灵敏的抗原特定T细胞体外检测技术。ELISPOT的原理与ELISA类似，通过将特异性的单抗包被在特殊材质（如PVDF）的ELISPOT板上，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘获，细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合，通过显色反应，在细胞分泌细胞因子的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。该方法特异性好和灵敏度高，易操作且成本较低，已被广泛用于免疫机理和疾病发病机制的研究中。本实验以检测针对黑色素瘤抗原TRP-2的特异性T细胞分泌IFN-为例介绍ELISPOT方法。三、 材料1、 超净工作台2、 5% CO2 37C细胞培养箱3、 P20、 P200、 P1000微量移液器和P200 8通道微量移液器4、 ELISPOT Reader5、 PBS、PBST洗液（PBS加入0.05% Tween-20）、70%乙醇6、 包被抗体（coating antibody，Primary antibody）7、 检测抗体（Biotinylated detector antibody，Secondary antibody）8、 酶联亲和素（Streptavidin-ALK conjugate）9、 碱性磷酸酯酶（ALK）的底物BCIP/NBT 10、 PHA刺激物（2mg/ml，-80C 贮存）：使用时，用 RPMI1640培养基稀释成为工作液（40g/ml，10倍终浓度），每孔加入10l，终浓度4g/ml。11、 TRP-2（181188）合成抗原，以DMSO按1mg/ml溶解，-80C贮存。12、 小鼠黑色素瘤细胞株B16，B6小鼠。四、 方法1、用100l 70%酒精孵育PVDF孔板，室温下孵育10分钟。 2、倒去酒精，用100L PBS洗涤3次。 3、将抗鼠IFN-单克隆抗体用PBS按10g/ml稀释作为捕获抗体， 100l/孔， 4过夜。4、弃包被液，100L PBS洗板3次，加含2% BSA 的PBS 200L/孔，加盖，37C孵育1 h，弃上清液，将板置于密封袋中，4C可保存数周。5、弃包被液，洗涤一次。 6、每孔加入100l 10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭，室温下孵育2h。7、弃封闭液，用100l PBS洗涤一次。8、取经小鼠黑色素瘤细胞B16多次免疫的B6小鼠脾脏和淋巴结细胞，分离纯化CD8+T细胞9、用10%FCS的RPMI1640重悬经纯化的CD8+T细胞2106/mL5106/mL，每 孔加入100l细胞悬液，每组中加入不同浓度（如1: 100, 1:500, 1:5000）的TRP-2抗原刺激（阴性对照组为不加刺激剂组，阳性对照组加入PHA刺激）。细胞可预先在体外接受刺激（间接ELISPOT）。盖上标准的96孔板塑料板盖，37 CO2孵育箱中孵育一定的时间（15h20h）。10、在水槽边和吸水纸上轻打，倒去液体。11、每孔加100l洗涤缓冲液，4孵育10分钟。12、用100l洗涤缓冲液洗孔3次。13、用1%BSA PBS中稀释100l检测抗体。每孔加100l此液体，盖上板盖，37下孵育1.5h。14、倒去液体，用100L洗涤缓冲液洗3次。15、每板以10ml 1%BSA PBS稀释10l的亲和素碱性磷酸酶。每孔加入100l此液体，盖上板盖，37孵育1小时。16、弃液体，用100l洗涤缓冲液洗3次。在吸水纸上拍打，吸干残留的洗涤液。17、每孔加入100l 碱性磷酸酯酶的底物BCIP/NBT。18、室温下反应515分钟。完全显色后，将此液倒于相应的盘中。19、用蒸馏水充分洗涤膜的两边。吸水纸上轻拍，使膜干燥。保存时，将板倒置 以免残留的液体流回膜上一旦膜干燥后，读取点数。Elispot方法的原理如下图所示：五、 注意事项1、细胞孵育期间不要晃动或移动孔板，以免产生斑点拖尾现象。2、4下放置一夜，点会比较明显。六、思考题1、比较ELISPOT与ELISA、细胞内染色、四聚体法（Tetramer）和与51Cr释放法等检测方法的优缺点和适用范围。（居颂光）实验九 人外周单核细胞来源树突状细胞的制备（Preparation of DC from Human Peripheral Mononuclear Cell）一、 目的要求1、掌握从人单核细胞诱导树突状细胞的方法和原理；2、掌握观察单核细胞和树突状细胞形态和判断鉴别未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞。二、原理树突状细胞(dendritic cell, DC) 是一类具有树枝状突起的抗原呈递细胞，其分布广泛，由骨髓中的髓性多能干细胞发育而成，在免疫应答过程中至关重要。DC是目前已知的最重要的一类抗原提呈细胞，未成熟DC具有强大的摄取和加工处理抗原的能力，并将抗原信息提呈给Th细胞，可激活Th 细胞发生增殖反应，而且还能刺激产生TC 细胞。机体内DC含量极少，研究中应用的DC多是通过其前体细胞诱导而来。其中外周血单核细胞和CD34+干细胞是研究和应用中常用的DC前体细胞。本实验介绍一种常用方法，利用外周血单核细胞为前体细胞，采用细胞因子GM-CSF 和IL-4 诱导单核细胞分化成树突状细胞，而利用TNF-促进树突状细胞成熟。三、材料1、淋巴细胞分离液(Ficoll)。2、RPMI 1640培养液。3、胎牛血清（FCS）。4、PBS（无Ca2+ Mg2+ ）。5、人外周血。6、重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)，重组人白细胞介素4 (IL-4) ,肿瘤坏死因子-(TNF-)。7、FITC标记的鼠抗人CD83，CD40，HLA-DR，CD86单克隆抗体；免疫磁珠标记的鼠抗人CD14单克隆抗体（如需高纯度单核细胞。）8、温控低速离心机。9、倒置显微镜。10、细胞计数板、离心管及塑料培养板等。四、方法1、按实验一中方法分离获得人PBMC。2、调节细胞浓度为106/mL,然后在6孔板上贴壁,每孔加2 mL, 3 h后吸去悬浮细胞，并用37预温新鲜培养液轻轻洗去未贴壁的细胞。3、未成熟DC的诱导：DC培养基I：3mL/孔：含10%FCS的RPMI 1640中含GM-CSF 50 ng/mL,IL-4 10 ng/mL，每2天半量换液1次，培养至5天。4、成熟DC的诱导：加入DC培养基II：3mL/孔：含10%FCS的RPMI 1640中含GM-CSF 50 ng/mL，IL-4 10 ng/mL，TNF- 20ng/mL。5、 DC形态观察和表型检测：光镜下形态： 树突状细胞比淋巴细胞大,直径在1020m之间, 有许多刺状突起,分布于细胞表面。培养7d后,流式细胞仪检测DC表达CD83，CD40，HLA-DR ，CD86。五、注意事项1、单核细胞分离时，要注意保持外周血合理的稀释度以及Ficoll的温度保持在1822。PBMC贴壁后冲洗液应37C预温，冲洗应轻柔；2、如需利用高纯度（纯度95%）的单核细胞作为诱导树突状细胞的前体细胞，则可利用免疫磁珠标记的鼠抗人CD14单克隆抗体及免疫磁珠分离系统分离上述 贴壁细胞；3、 操作过程中严格注意无菌操作。六、思考题1、目前还有哪些常用的诱导人树突状细胞形成和成熟的方法？2、人树突状细胞的功能有哪些，根据其功能可将树突状细胞分为哪些亚群？3、体外评估人树突状细胞功能的常用方法有哪些？4、人树突状细胞有哪些理论研究和应用价值？ （居颂光）实验十 小鼠腹腔细胞及巨噬细胞的制备(Abstrction of Peritoneal Cell and Macrophage of Mouse)一、 目的要求1、掌握小鼠腹腔细胞及巨噬细胞的获取方法。2、了解小鼠腹腔细胞及