应用微生物学实验.doc

实验一、酸奶生产菌的分离纯化及应用一、实验目的和内容 学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料的方法，了解乳酸菌的生长特性。内容包括：1.从新鲜酸乳中进行乳酸菌的分离纯化；2.乳酸发酵及检测；3.乳酸菌饮料制作；4.自制乳酸质量品尝。二、原理酸奶是鲜奶经过乳酸菌发酵而制成的乳制品，具备鲜奶的全部营养成分。酸奶含有人体必需的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、乳糖酶和活性乳酸菌等。酸奶是采用优质纯鲜牛奶加入白糖均质，经超高温灭菌后接入乳酸菌发酵后制成的一种发酵型乳制品。在发酵过程中，鲜牛奶中的酪蛋白遇酸凝固，成为有弹性的凝块，颜色乳白、气味清香、酸甜可口，别具一番风味。乳酸菌具有把奶类中的乳糖，分解成乳酸的功能，称为乳酸发酵。在形成乳酸的同时也产生其他一些酸类物质，从而导致了PH 值的下降，当达到乳类蛋白质的等电点时（如牛奶蛋白质的等电点约在PH4.5 左右），引起蛋白质的沉淀，使原来流动性较大的乳类，因凝固作用而变成类似果冻的胶状物，称之为“凝乳”。不管是何种酸奶，其共同的特点都是含有乳酸菌。这些乳酸菌在人体的肠道内繁殖时会分泌对人体健康有益的物质，因此酸奶对人体有较多的好处：一是能将牛奶中的乳糖和蛋白质分解，使人体更易消化和吸收；二是酸奶有促进胃液分泌、提高食欲、加强消化的功效；三是乳酸菌能减少某些致癌物质的产生，因而有防癌作用；四是能抑制肠道内腐败菌的繁殖，并减弱腐败菌在肠道内产生的毒素；五是有降低胆固醇的作用，特别适宜高血脂的人饮用。和普通牛奶相比，酸奶的最大特点是含有大量活着的微生物，是具有生命力“活”着的特殊食品。酸奶中的微生物根据它们功能分为2大类：1发酵用乳酸菌：是指那些起源于奶制品长期用于酸奶制造的乳酸菌。2生物活性用乳酸菌：是近年从人体分离、驯化而成具有特定生物活性的乳酸菌，基本都是后述的益生菌。发酵用乳酸菌主要用途是决定酸奶风味及口感，关系到酸奶本身的商品价值。生物活性用乳酸菌是用于强化酸奶营养价值，使它具有某些传统酸奶所不具备的生理功能，满足人们健康上的特殊需要。由于现存的生物活性用乳酸菌(益生菌)的大多数因是来自人体，在牛奶里生长发育缓慢，代谢产物除了乳酸以外还有其他多种挥发性物质，风味上差强人意。因此多数情况下，都是同时混合利用这2类乳酸菌。在实验室中可以用“稀释涂布平板法”“平板划线法”来分离细菌。通常培养后通过观察细菌的菌落可以辨别是哪种细菌，也可以在培养基中加入特定的染色试剂使特定的细菌染色来观察。三、实验材料和用具 嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)，保加利亚乳酸杆菌(Lactobacillus bulgaricus)，乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离。 BCG牛乳培养基，乳酸菌培养基，脱脂乳试管，脱脂乳粉或全脂乳粉，鲜牛奶，蔗糖，碳酸钙。恒温水溶锅，酸度计，高压蒸汽灭菌锅，超净工作台，培养箱，酸乳瓶(200280mL,)，培养皿，试管，300mL三角瓶。BCG牛乳培养基：（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500ml，加入1.6%溴甲酚绿（B. C. G）乙醇溶液1mL，80灭菌20min。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH 6.8，121湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将（A)、（B）溶液混合均匀后倒平板。乳酸菌培养基（CMRS）：蛋白胨 5g； 牛肉膏 5 g ； 酵母浸膏 2.5 g ； 乳糖 7.5 g； 土温80 0.5ml； 磷酸氢二钾 1g ； 乙酸钠2.5g ； 柠檬酸二铵1g ； 七水硫酸镁0.1g ； 四水硫酸锰0.1g ； 番茄汁 50ml； 琼脂条9g； 加入500ml蒸馏水中加热溶解，调pH值为 6.8，115，灭菌15分钟。 脱脂乳试管：直接选用脱脂乳液或按脱脂乳粉与5%蔗糖水为1:10的比例配制，装量以试管的1/3为宜,115灭菌15min 。三、操作步聚 (一)乳酸菌的分离纯化 1.分离 取市售新鲜酸乳或泡制酸菜的酸液稀释至10-5,取其中的10-4,10-52个稀释度的稀释液各0.10.2mL，分别接入BCG 牛乳培养基琼脂平板上，用无菌涂布器依次涂布，或者直接用接种环蘸取原液平板划线分离，置40培养48h，如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基变为黄色者初步定为乳酸菌。 2.鉴别 选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40培养824h，若牛乳出现凝固、无气泡、呈酸性，涂片镜检细胞杆状或链球状(两种形状的菌种均分别选入)，革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代46次，最终选择出在36h能凝固的牛乳管，作菌种待用。(二)乳酸发酵及检测 1.发酵 在无菌操作下将分离的1株乳酸菌接种于装有300mL 乳酸菌培养液的500mL三角瓶中，4042静止培养。 2.检测 为了便于测定乳酸发酵情况，实验分2组：一组在接种培养后，每68h取样分析，测定pH值；另一组在接种培养24h后每瓶加入CaCO3 3g(以防止发酵液过酸使菌种死亡)，每68h取样，测定乳酸含量(方法见注)，记录测定结果。 (三)乳酸菌饮料的制作 1.将脱脂乳和水以1:710(W/W)的比例，同时加入5%-6%蔗糖，充分混合，于8085灭菌105min，然后冷却至3540，作为制作饮料的培养基质。 2.将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂，均以2%5%的接种量分别接入以上培养基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂，接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装35瓶，随后将瓶盖拧紧密封。 3. 把接种后的酸乳瓶置于40-42恒温箱中培养34h，培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。然后转入45的低温下冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(pH44.5)，凝块均匀致密，无乳清析出、无气泡、获得较好的口感和特有风味。 4.以品尝为标准评定酸乳质量：采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。比较项目按表1. 四 注意事项 1. 采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。 2.制作乳酸菌饮料，应选用优良的乳酸菌。采用乳酸球菌与乳酸杆菌等量混合发酵，使其具有独特风味和良好口感。 3.牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间，防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。 4.作为卫生合格标准还应按卫生部规定进行检测，如大肠菌群检测等。经品尝和检验，合格的酸乳应在4条件下冷藏，可保存67d。 五,实验报告 1. 乳酸发酵过程，检测结果及结果分析。 2. 将发酵的酸乳品评结果记录于表1中; 表1 乳酸菌单菌及混合菌发酵的酸乳品评结果品评项目球菌杆菌球菌杆菌混合(1:1)凝乳情况口感香味异味pH值结论六 问题和思考 1、发酵酸乳为什么能引起凝乳？ 2、为什么采用乳酸菌混合发酵的酸乳比单菌发酵的酸乳口感和风味更佳？ 3、试设计一个从市售鲜酸乳中分离纯化乳酸菌的制作乳酸菌饮料的程序。附录：1、乳酸检测方法 定性测定：取酸乳上清液的10mL于试管中，加入10% H2SO4 1mL,再加2% KMnO4 1mL，此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸溶液中浸泡的滤纸条搭在试管口上，微火加热试管至沸，若滤纸变黑，则说明有乳酸存在，这里因为加热使乙醛挥发的结果。定量测定：(1)测定方法：取稀释10倍的酸乳上清液0.2mL，加至3mL pH9.0的缓冲液中，再加入0.2mL NAD溶液，混匀后测定OD340nm值为A1，然后加入0.02mL L(+)LDH，0.02 D(一)LDH，25保温lh后测定OD340nm值为A2。同时用蒸馏水代替酸乳上清液作对照，测定步骤及条件完全相同，测出的相应值为Bl和B2。 (2)计算公式: 乳酸/g(100mL)-1=(VMD)10001Vs V：比色液最终体积(3.44mL) M：乳酸的克分子重量(lmol/l=90g) ：(A2-A1)-(B2-B1) D：稀释倍数(10) ：NADH在340nm吸光系数(6.3103lmol-1cm-l) 1：比色皿的厚度(0.1cm) Vs：取样体积(0.2mL) (3)测定乳酸试剂的配制(见附录) 3.酸乳的检查指标 感观指标：酸乳凝块均匀细腻，色泽均匀无气泡，有乳酸特有的悦味合格的理化指标：如脂肪3%，乳总干物质11.5%，蔗糖5.00%，酸度70110T，Hg0.0110-6mg/mL等；无致病菌，大肠菌群40个/100m L。实验二 食用菌的组织分离一、目的和要求 掌握了解食用菌组织分离的方法和实际操作技术，明确食用菌组织分离在食用菌生产中的重要性。 二、原理 用子实体的某一部分来分离菌种的方法，称为组织分离法。组织分离法简便，后代不易发生变异，能保持原菌株的优良特性。组织分离法是利用菇类组织块能再生成菌丝的特性获得纯种的一种简捷方法，是野外采集菌种和食用菌栽培中防止品性退化，保持优良品种特性常用的一种手段。此法适宜多数食用菌，是野外工作者和种菇专业户必须掌握的一种方法。组织分离最好采用正处于旺盛生长中的幼嫩子实体或菇蕾作为分离材料，采取菌盖与菌柄交接处的组织进行分离，效果最好，对于那些有内或外菌幕保护的菇类来说,取在菌幕保护下的幼嫩菌褶接种，生活力更加旺盛。对于某些菌根菌，则取用靠近基部的菌柄组织才能成活。在食用菌生产中，采用组织分离的方法繁殖母种是大多数菌类普遍采用的方法。而组织分离成功与否是与种菇子实体的选择、分离过程中的操作方法等分不开的，这直接关系到所繁菌种的优劣。因此食用菌组织分离是食用菌生产中的重要环节之一。三、材料和用具 培养皿；试管斜面培养基；平菇、金针菇或蘑菇较成熟的子实体；酒精灯，接种针，75%酒精，甲醛；高锰酸钾；新洁尔灭消毒液以及温箱；冰箱等。PDA培养基：Slice potatoes thin. Add 1000ml of water, immediately to prevent Oxidtion of juice and boil until soft. (approximately 30min.). Filter through cotton-cloth. Autoclave at 115 for 20 minutes.（注：取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟。）四、实验步骤 选用的子实体先经0.1开汞水或70酒精表面消毒后。用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。如分离香菇时用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，再用手将子实体掰开为二，在菌盖与菌褶交界处，切取0.30.4立方厘米的一小块菌肉，移放在斜面培养基中央。如已开伞的种菇、则选菌盖与菌柄交界处的菌肉。分离草菇时，用无菌解剖刀把菌蕾纵切少许；再用手把菌盖轻轻剥开，在菌柄上方和菌盖交界处，切取15毫米的细块，接在斜面培养基中。如种菇已受雨淋，吸水较多，应取菌褶作为接种材料。组织分离后将试管外面放在恒温箱中培养。待组织块周围萌发出菌丝，并向 培养基蔓延生长后，再挑取生长健壮的菌丝进行转管培养。组织分离法操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。但对银耳、黑木耳等胶质菌；因其子实体中菌丝的含量极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。五、实验结果 根据观察结果比较两菌种间菌丝生长情况和同一菌种不同部位组织分离后菌丝生长情况，评价何种部位更适宜该菌种的组织分离繁殖，并对操作的各个环节提出改进建议。六、注意事项（1）此法对于胶质的耳类及菇体较小较薄的菇类，如金针菇等不太适宜。（2） 此法应严格遵循无菌操作。（3）子实体在升汞溶液中消毒时间应严格按规定时间进行，漂洗要迅速，否则子实体受损太大，影响效果。七、思考题如何避免因污染而造成的组织分离的失败？实验三、菌种的液体石蜡保藏一、 目的学习掌握液体石蜡法保藏菌种的原理和方法。二、 原理微生物个体微小、代谢活跃、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异，被其他杂菌污染，甚至导致细胞死亡，这种现象屡见不鲜。菌种的长期保藏对任何微生物学工作者都是很重要的，也是非常必要的。自从19世纪末F.Kral开始尝试微生物菌种保藏以来已建立了许多长期保藏菌种的方法。虽不同的保藏方法其原理各异，但基本原则是使微生物的新陈代谢处于最低或几乎停止的状态。保藏方法通常基于温度、水分、通气、营养成分和渗透压等方面考虑。液体石蜡法保藏菌种方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡,达到菌体与空气隔绝,使菌处于生长和代谢停止状态,同时石蜡油还防止水分蒸发,在低温下达到较长期的保藏菌种的目的.保藏温度要求在-44下此法实用且效果较好，产孢子的霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏2年以上，有些酵母菌可保12年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。方便但必须直立存放。三、 实验步骤1、液体石蜡灭菌：在250mL三角烧瓶中装入100mL液体石蜡，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，12l湿热灭菌30min，然后于40温箱中