[毕业设计精品]稻曲病菌对戊唑醇的室内抗性筛选.doc

本科毕业论文 题 目稻曲病菌对戊唑醇的室内抗性筛选in vitro adaptation to tebuconazole in ustilaginoidea virence strains姓 名学 号专 业动植物检疫指导教师职 称教授 中国二一年六月分类号 密级本科毕业论文 稻曲病菌对戊唑醇的室内抗性筛选in vitro adaptation to tebuconazole in ustilaginoidea virence strains学生姓名：学生学号：学生专业：动植物检疫指导教师： 教 授植物科学技术学院二一年六月目录摘要.iiabstract.iii关键字.iii1 前言.11.1 稻曲病菌.11.2 戊唑醇.31.3 病原菌室内抗性筛选.52 材料与方法.5 2.1 试验材料.52.2 实验内容.52.3实验结果与分析.52.4 讨论.8参考文献.9致谢.9附录.10摘 要稻曲病的发病面积逐年增加，为害日益加重，已成为水稻主要三大病害之一。 戊唑醇通过抑制真菌中麦角甾醇的生物合成对稻曲病有很好的防治效果。本文主要是用戊唑醇对稻曲病菌的两种生理小种进行了室内抑菌活性测定。将两种生理小种在不断提高浓度梯度的戊唑醇pda培养皿中培养，直到其抗性无法得到增强。然后在pda培养皿中继续转接5代，测量原始菌株、转接16代的对照菌株、驯化菌株以及再度转接5代的菌株的ec50，看其抗性是否得到保持。关键词戊唑醇；水稻稻曲病；抗性abstractas the area of rice incidenced by ustilaginoidea oryzae (patou.) bref increased year by year，and the damage is increasing，it has become one of the three major diseases of rice.tebuconazole effects on inhibiting biosynthesis of ergosterol that has great control effect on ustilaginoidea oryzae (patou.) bref. we mainly have indoor antifungal activities on two races of ustilaginoidea oryzae (patou.) bref with tebuconazole.two races were rasied concentration gradient in pda plate with tebuconazole in rasing concentration gradient，until their resistance can not be enhanced.then continue to divert for 5 generations in pda plate，measure the ec50 of original strain、control strain and domesticated strains treated after16 generations、the strain re-switched for 5 generations to see whether the resistance have been maintainedkey wordstebuconazole；ustilaginoidea oryzae (patou.) bref ；resistance1 前言杀菌剂对植物病原菌的抑菌活性测定是研究杀菌剂的基础。通过室内活性测定可以明确杀菌剂的作用效果及抑菌谱。戊唑醇由于杀菌活性高等特点,目前已经在市场上大量使用。但是抗药性问题的出现影响着杀菌剂的发展。室内对病原真菌进行抗性筛选,可以模拟出田间病原菌对杀菌剂的抗药性发展动态,对杀菌剂进行抗药性风险评估,为田间科学合理的用药提供理论指导。1.1 稻曲病菌稻曲病又称伪黑穗病、绿黑穗病、谷花病、青粉病,是一种由病原真菌引起的后期谷粒病害,通常在晚稻上发生,多发生在水稻收成好的年份,使农民误以为是丰收的象征,俗称“丰产果”,在全国各稻区均有发生。20世纪80年代之前,该病零星发生,属次要病害;90年代以来,由于密粒直立型超级稻和优质水稻品种的大面积推广,单季稻熟制的扩大,施肥水平偏高和不合理,尤其是单季稻孕穗期多雨适温的频率较高,稻曲病的发病面积逐年增加,为害日益加重,已成为水稻主要三大病害之一。稻曲病的发生,会造成水稻大面积空秠率增高,既不利于晚稻高产,又严重影响稻米的质量,且稻曲病病菌还会产生毒素,对人畜有不良影响。该病只发生于穗部,为害部分谷粒。受害谷粒发病初期外观与健康谷粒误明显区别,在水稻齐穗35d内可显症,病菌早期侵害子房,花柱及柱头,后期侵入幼嫩颖里的外表皮,蔓延到配孔中,然后大量繁殖并形成子座。发病时,病菌首先在谷粒内部生成小菌核,形成菌丝块并逐渐膨大,内外颖裂开,露出淡黄色块状物,即孢子座,后包于内外颖两侧,比健康谷粒大34倍,形成近球形病粒,呈黑绿色,初外包一层薄膜表面光滑,后显粗糙龟裂,散发生墨绿色粉末,即病菌的厚垣孢子,使水稻结实率和干粒重下降,俗称“灰包”。一般每穂有病粒15粒,严重的可达2030粒。有的两侧生黑色扁平菌核,风吹雨打易脱落。（吴格娥,2000；杨洵,2007；章方海,2006）病原ustilaginoideavirens(cooke)tak.称稻绿核菌,属半知菌亚门真菌。分生孢子座6-124-6(m),表面墨绿色,内层橙黄色,中心白色。分生孢子梗直径2-2.5(m)。分生孢子单胞厚壁,表面有瘤突,近球形,大小4-5(m)。菌核从分生孢子座生出,长椭圆形,长2-20mm,在土表萌发产生子座,橙黄色,头部近球形,大小1-3mm,有长柄,头部外围生子囊壳,子囊壳瓶形,子囊无色,圆筒形,大小180-22m,子囊孢子无色,单胞,线形,大小120-1800.5-1(m)。厚垣孢子墨绿色,球形,表面有瘤状突起,大小3-54-6(m)。有性态为clavicepsvirenssakurai称稻麦角,属子囊菌亚门真菌。（王云川,2006）1.2.1传播途径和发病条件(1) 大量病原菌存在病菌主要以菌核在土壤中越冬,也可以厚垣孢子在被害谷物内或健康谷粒颍壳上越冬。翌年78月份,当菌核和厚坦孢子遇到适宜条件时,即可萌发产生子囊孢子和分生孢子,随气流和水流传播,落到水稻植株上,在水稻破口时倾入花器和幼颖,由厚垣孢子再生小孢子及子囊孢子进行初侵染。连作地块时间长,有效菌原积累多,发病率高。(2) 品种抗性差杂交稻重于常规稻,粳稻重于糯稻,大穗型,破口抽穗期长的品种发病重。(3) 气候原因气温24-32病菌发育良好,26-28最适,低于12或高于36不能生长。抽穗扬花期遇雨及高温,特别是在阴雨天发病重。(4) 栽培原因 抽穗早的品种发病较轻。(5) 施肥随施氮量的增加,稻曲病发病程度加重,尤其是后期重施穗肥有利于发病。另施肥不当或施肥太迟,容易造成贪青,剑叶偏长,形成穗部小气候相对湿度较高,受阳光直射较少,一直延迟抽穗。钾肥有壮杆作用,可使叶直,叶厚,穗部受光良好,减少病害滋生条件。(6) 长期深水漫灌,不晒田。(7) 破口前后为及时用药预防。(8) 重视不够,防治信息不能及时传达。（张业金,2006,王琴,2005）1.2.2防治方法(1) 合理安排种植期,避开发病高峰时节。适时早播早植,加强管理,错开穗期雨季以减轻病害。健生栽培,提高逆抗水平。(2) 选用抗（耐）病品种。(3) 避免病田留种,深耕翻埋菌核。发病时摘除并销毁病粒。(4) 科学管水。(5) 改进施肥技术基肥要足,追肥要早,慎用穗肥,增强稻株抗病能力。(6) 合理密植每公顷栽225000穴左右为宜。过于密植,易导致田间荫蔽,湿度大,利于发病。(7) 确定重点防治对象田感病品种种植区,山区及偏施,迟施氮肥的田块,均应列入重点防治对象田。(8) 抓住防治适期施药抓住水稻分蘖末期,破口前3d-7d,始穗期三个关键时期施药（可有效兼治纹枯病等病害）。(9) 药剂防治。(10) 清除病源,减少初次侵染来源。(11) 加强测报,及时用药防治。（段宗云,2007）1.2 戊唑醇戊唑醇是一种羟乙基三唑衍生物,属三唑类内吸杀菌剂。毒性分类属低毒杀菌剂。该化合物由德国拜耳公司于1986年最先开发成功,英文通用名,化学名称为1-（4-氯苯基）-4,4-二甲基-3（1h-1,2,4-三唑-1-基甲基）戊-3-醇与其它所有三唑类杀菌剂一样,戊唑醇抑制真菌中麦角甾醇的生物合成,可用作种子处理剂和叶面喷雾剂,不仅活性高,而且持效期长,对防治许多作物包括单子叶植物和双子叶植物病害安全有效。甾醇类化合物是生物维持生命及生长发育不可缺少的物质。在真菌和细菌中,主要是合成麦角甾醇,它是构成细胞膜的重要成分,对细胞膜的渗透性起重要作用。麦角甾醇的生物合成已成为新型杀菌剂的重要靶标之一,其抑制剂由于活性高、不易产生抗药性等特点,在生产上受到普遍重视。1.2.1作用特点从作用方式看,戊唑醇对稻曲病病菌表现为抑菌作用,对植物则表现为治疗作用。从作用机理看,主要是对病原真菌的麦角甾醇生物合成起抑制作用。一般认为三唑类麦角甾醇抑制剂的主要机理是抑制麦角甾醇中间体的氧化脱甲基反应,特别是对2,4-亚甲基-二氢羊毛甾醇结构中14位碳原子上脱甲基反应的抑制。生化机制研究表明,与传统的三唑类杀菌剂相比,戊唑醇还存在其它作用位点,但同样存在于麦角甾醇生物合成过程中。除了三唑类杀菌剂的典型特征,即由于抑制脱甲基反应引起的麦角甾醇中间产物积累以外,在用戊唑醇处理后,在菌丝中出现了三种5甾醇(符号表示双键位于第5位碳原子,下同),即5-麦角甾醇、5-豆固醇和5,22-豆固二烯醇。这可能有两种原因,即戊唑醇干扰反应进行顺序最后导致87异构化不能正常进行或直接对细胞膜产生影响,而间接地对甾醇混合物的组成产生了影响。与传统三唑类杀菌剂相比,戊唑醇的活性谱扩大的机理正在于此。（李富根,2001）1.2.2生物活性植物病害防治中的应用戊唑醇具有优良的生物活性,用量低,内吸性较强,适用范围广,对白粉菌属、柄锈菌属、喙孢属、核腔菌属和壳针孢属菌引起的病害均能有效地防治。戊唑醇可作种子处理或叶面喷雾用。作种子处理用时,加工成拌种剂(ws、ds),由于其内吸作用,所以能有效防治吸附在种子表面以及内部的病原菌,被广泛应用于小麦、玉米、高粱等旱地作物,防治某些种传和土传病害,特别是用于防治黑穗病。作喷雾用时,可加工成乳油、可湿性粉剂、悬浮剂、水乳剂等。戊唑醇被植物吸收后,在植物组织中向顶转移,能防治各种作物中的多种稻曲病病菌,目前主要应用在控制禾谷类及花生病害、香蕉叶斑病、油菜白粉病和茶饼病等病害。1.2.3合成机理（谭成侠,2001）1.3 病原菌室内抗性筛选室内抗性筛选的方法大多有两种：一种是紫外线诱变；另外一种是药剂诱导筛选。通过诱变处理或药剂选择探测抗药菌株产生的可能性,再通过抗药菌株的致病力、遗传稳定性及竞争性,可以推测优势菌株导致抗药性发生的可能性。为这种杀菌剂的抗药性风险进行评估,从而延缓抗性的发生、科学合理的用药提供理论指导（赵建江,2008）2 材料和方法2.1试验材料2.1.1供试药剂及其配制戊唑醇,用无菌水稀释成8000g/ml母液,置于4摄氏度冰箱内保存,备用。2.1.2供试菌株稻曲病ustilaginoideavirens由植物病理教研室博士研究生吕博提供。2.2实验内容在预培养的真菌菌落边缘,打取直径7mm的菌碟于含系列浓度的pda培养皿上,27摄氏度培养14天,测量菌落直径。转接16代后,将ck和驯化的菌株在pda培养皿中继续转接五代,测量驯化菌株,ck以及亲本的ec50,做对比。2.3实验结果与分析表1u-12转接16代菌落直径平均数据记录（浓度单位：g/ml：菌落直径单位：cm）浓度转接代数ck0.030.060.100.301.00122.723.1233.432.482.3144.572.802.2554.632.532.2264.632.532.2275.153.272.2885.171.750.7194.371.110.76103.971.480.96114.772.391.78124.372.151.22134.101.971.40144.401.521.480.5154.430.971.230.5164.431.931.230.5图表 1 data of u-12 after switching for 16 generations u-12转接16代数据表2u-32转接16代菌落直径平均数据记录（浓度单位：g/ml,菌落直径单位：cm）浓度转接代数ck0.030.060.100.301.00124.083.8034.962.873.6444.313.633.0854.172.782.2064.172.782.2075.303.231.3784.962.610.8694.902.332.00104.022.792.32115.062.771.92124.952.751.76134.952.832.23144.732.131.240.5154.582.341.010.5164.282.221.590.5图表 2 data of u-32 after switching for 16 generationsu-32转接16代数据根据图表中数据可以看出,菌株在在不断提高浓度的pda培养基中能生长,且菌落直径在不断增大,表明抗性在不断上升。表3不同浓度戊唑醇下u-12菌株的ec50值（浓度单位：g/ml,表格中数据单位：%）菌株种类浓度u-12d12-0d12-1d12-2ck0.0187.7197.6444.4133.980.0395.9098.0356.2543.200.197.27100.0052.3054.850.3100.00100.0057.2466.021100.00100.0084.2188.833100.00100.00100.00100.0010100.00100.00100.00100.00ec500.110.06注：u-12表示亲本,d12-0表示培养16代的ck组,d12-1表示培养16代的驯化菌株,d12-2为驯化菌株继续转接5代的菌株。图表 3 ec50 of u-12 virens strainsu-32菌株ec50图表数据表明u-12在16代的转接之后其对戊唑醇的抗性得到了提高,并且d12-1菌株在保存了一个月之后再转接5代,其抗性只得到了部分保持。2.4讨论这个课题的提出是基于这样一个假设,稻曲病病菌在不断提高的药剂浓度下其抗性能不断得到增长,即突变体数目的增加。但是其抗性不可能无限增加,对药剂浓度有个最高的适应浓度,高于这个浓度下无论如何都不可能生长。这个实验大概做了一年时间,由于稻曲病病菌的菌丝生长速率较慢,所以两个星期转接。开始的时候我们选择了用一系列的浓度梯度来培养稻曲病病菌（0.01ppm,0.03ppm,0.1ppm,0.3ppm,1ppm,3ppm,10ppm）,根据培养出来的结果进行对比选择了一个初始浓度,0.03ppm。在0.03ppm的戊唑醇pda培养基中病菌生长能得到一定的抑制。后来我们不断的转接,病菌在含药的培养基中培养两个星期后,如果直径能生长到一定大小就可以选用更高浓度的含药培养皿进行培养转接。顺着这个过程我们将菌株培养了16代,直到其达到了最高适应浓度,0.3ppm。然后我们将转接16代的ck和能适应0.3ppm戊唑醇浓度的病菌在pda培养基上转接5代。最后我们将亲本,16代的驯化菌株,16代的ck及驯化菌株继续转接5代的菌株在一些列浓度的戊唑醇pda培养基中培养,得到ec50值,看转接16代的驯化菌株抗性能否得到提高,并且其突变并不能稳定保持。在相同浓度下,稻曲病病菌的抗性直接表现为菌落直径的大小,即菌落直径越大,其对相同浓度戊唑醇的抗性越高。同时,能在高浓度上生长也体现其抗性的增长。数据表明,u-12与u-32对戊唑醇的适应浓度极限为0.3ppm,在1ppm浓度戊唑醇的pda培养基上就无法生长。转接16代的驯化菌株,其抗性得到了很大的提高,说明实验的预期假设是正确的,但是病菌对戊唑醇的抗性并不能得到很好的保持。根据图表数据能看出,相同浓度下菌株的菌落直径并不是直线上升,ec50的图表中,d12-1的数据也不是直线上升,说明实验数据存在一定误差。参考文献1. 段宗云,喻凌治,袁灵芝等.杂交稻稻曲病的发生及防治措施j.湖南农业科学,2007(5):128-129,1322. 李富根,吴新平,刘乃炽等.戊唑醇的作用特点及其应用概况.农药科学与管理,2001,22(3)3. 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