分子肿瘤概论(研究生)两次总结ppt课件.ppt

分子肿瘤概论 重庆医科大学病理教研室王娅兰教授 博士生导师 一 有关肿瘤的基本概念 复习 肿瘤 tumor neoplasm 基因水平调控失常异常增生新生物肿瘤生物学行为 浸润 转移能力浸润 invasion 起源处迁移侵入周围邻近组织 转移 metastasis 从原发部位血管 淋巴管 体腔它处继续生长与原发瘤同样类型肿瘤 转移瘤或继发瘤 转移的途径 浸润生长是恶性肿瘤生长的特点 也是肿瘤转移过程必经的第一步 肿瘤的组织结构实质 parenchyma 间质 mesenchyma stroma 肿瘤间质的主要成分1血管毛细血管 小动 静脉血窦样血管血管球样增生血管内皮增生肿胀 新的肿瘤血供模式 血管生成拟态 vasculogenicmimicry VM 1999年 美国学者Maniotis等一种完全不同于经典血管生成的微循环模式 管壁主要由基底膜 PAS阳性 围成 外衬以肿瘤细胞 腔内有血浆和红细胞流动 管道与内皮性血管相多存在于高度恶性肿瘤 2结缔组织间质 1 纤维和基质胶原纤维常规HE 红特殊化学染色VG改良法 红Masson 兰色 构成成分IIIIII型胶原原纤维又由相应原纤维分子构成免疫组化或分子生物学方法可区别 弹力纤维常规HE 淡红色特殊化学染色Weigert或Verhceff 暗兰或黑色 弹力酶消化后阴性 网状纤维银染 黑色 故也称嗜银纤维 PAS 强阳性成分胶原蛋白为主要成分细胞间质网状纤维 型胶原蛋白基底膜网状纤维 型胶原蛋白 层黏连蛋白 laminin 纤维黏连蛋白Fibronectin FN 作用A 连接基质中各种成分B 介导细胞外基质成分与细胞表面连接黏蛋白又称蛋白多糖 proteoglycan 如透明质酸 硫酸肝素等骨黏素 osteonectin 2 基底膜 basementmembrane BM 多种成分与肿瘤浸润关系密切 型胶原层黏连蛋白 laminin LM 3 细胞成分固有的细胞成分 成纤维细胞和纤维细胞 肌成纤维细胞 间充质细胞 巨噬细胞 树突状细胞 反应性细胞成分各种细胞浸润 淋巴细胞最常见 浆细胞 巨噬细胞都属免疫活性细胞 二 肿瘤浸润 转移的分子机制 一 肿瘤细胞的浸润转移1 肿瘤细胞增殖和扩展浸润转移的前提和基础2 肿瘤血管生成 tumorangiogenesis 肿瘤浸润转移的必要条件 3 肿瘤细胞分离脱落 与细胞外基质黏附 1 瘤细胞表面负电荷增加 2 瘤细胞黏附力的改变 瘤细胞自身结构异常 瘤细胞同质黏附力下降指同种瘤细胞之间的黏附力 瘤细胞异质黏附力增加指肿瘤细胞与其它不同细胞及间质的黏附力细胞表面的黏附分子介导通过配 受体之间的识别和结合实现 3 肿瘤黏附因子 adhesionmolecules 细胞表面结构 钙黏蛋白 cadherin 又称为钙连接素 钙黏素据分布不同E 钙黏蛋白P 钙黏蛋白N 钙黏蛋白H cad 整合素 integrin 细胞表面糖蛋白 约有20多个亚型 各种肿瘤细胞表面整合素种类不同 肿瘤生长各个阶段表达水平也不同 作用a 介导细胞与细胞外基质的黏附b 参与不同细胞之间的黏附连接C 扮演细胞信号传递的角色 免疫球蛋白超基因家族 immunoglobulinsuperfamily 主要参与细胞与细胞间的连接ICAM 1 细胞间黏附分子 1 VCAM 1 血管黏附因子 NCAM 神经细胞黏附因子 其它包括CEA DCC 选择素 selectin 内源性植物凝血素 凝集素 作用介导内皮细胞 血小板与瘤细胞黏附选择素家族包括 P selectinE selectinL selectin CD44及其它CD44 透明质酸受体 路易斯寡糖 SLEX s LewisX 跨膜超级家族基因蛋白 TM4ST 4 瘤细胞的迁移 migration 及化学趋向性 1 瘤细胞的运动黏附 肌动蛋白 微管 中间丝 2 瘤细胞运动的调节据其作用 大致可分为两大类 既影响运动又影响生长的因子仅影响运动的因子 肿瘤细胞运动和增殖AMF 自分泌运动因子 1986年Liotta等首先发现并命名它源于肿瘤细胞本身且作用于肿瘤细胞 HGF SF 肝细胞生长因子 分散因子 生物学作用存在多态性HGF和AMF是近期发现的最强大的动力因子 3 瘤细胞的化学趋向性21KD的蛋白质骨吸收因子 5 细胞外基质的降解 1 肿瘤浸润细胞外基质的步骤Liotta1986年提出第一步黏附于基底膜或其他间质成分第二步分泌蛋白酶并激活 降解瘤细胞邻近的细胞外基质第三步进入受蛋白酶降解的基质区域内 2 肿瘤细胞产生的蛋白水解酶 丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子纤溶酶 纤维蛋白溶解酶 纤溶酶原a 降解基质b 激活胶原酶胶原降解 尿激酶型纤溶酶原激活剂 urokinase typeplasminogenactivator u PA 系统A u PA 介导细胞周围基质蛋白的降解B u PA受体 u PAR 及纤溶酶原受体活化u PA原酶形式的u PA纤溶酶原 纤溶酶原受体纤溶酶 uPA与u PAR还能激活信号传导系统 C PAI PA抑制剂 PAI1是u PA的主要抑制剂PAI2不同肿瘤表达意义不一PAI3功能不清 基质金属蛋白酶 matrixmetalloproteinases MMP 需钙 锌离子作辅助因子MMP分类胶原酶 如间质胶原酶 Collagenase 明胶酶 如明胶酶A gelatinaseA 间质溶素 如间质溶素1 2膜型基质金属蛋白酶 型 可分别降解ECM中各种不同成分ECM降解的主要蛋白水解酶类金属蛋白酶抑制物TIMP 1 TIMP 2浸润与否取决于MMP与TIMP的对比 胱氨酸蛋白酶类CathepsinB作用降解ECM中各种胶原 LM FN 黏蛋白激活间质胶原酶和IV型胶原酶 天 门 冬氨酸蛋白酶包括组织蛋白酶D E cathepsinD E CD 在肿瘤浸润转移中的作用CD表达的调节不同组织调节因素不完全一致CE在肿瘤 6 瘤细胞以主动方式入循环管道并形成栓子微小淋巴管 微小静脉壁缝隙瘤细胞存在形式单个成团同类癌栓异类癌栓黏附分子对其发挥调节作用 7 在特定器官的毛细血管滞留并黏着 再次穿过血管壁并定居 增殖器关特异性 选择性 机制 1 黏附分子的作用 2 化学趋化因子 3 微环境不适合 4 与免疫状态有关 二 机体免疫状态与肿瘤浸润转移参与控制转移的免疫细胞主要有NK细胞巨噬细胞T淋巴细胞 三 肿瘤浸润转移相关基因转移相关基因 四 肿瘤表观遗传改变与肿瘤浸润转移表观遗传学 Epigenetics 与遗传学 genetic 相对应的概念 表型状态改变 基因型不改变 没有DNA序列变化的情况下 可遗传的基因表达改变 导致的基因产物的变化 DNA的 后天性 修饰 如甲基化修饰 组蛋白的各种修饰等 五 肿瘤干细胞 tumorstemcell TSC 2001年由Reya等提出2006年美国癌症研究协会 AACR 定义存在于肿瘤组织中具有无限自我更新能力并能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞 特征 1 无限增殖和多向分化 2 存在自我更新的信号传导途径 3 具不同表型 异质性 对放化疗不敏感 4 具有端粒酶活性 5 能转移到各种不同的组织 六 肿瘤微环境与肿瘤浸润转移肿瘤细胞间质细胞细胞外基质间质细胞所分泌的活性介质 细胞因子 共同构成的局部内环境 微环境改变肿瘤细胞 自分泌和旁分泌全身和局部组织 代谢 分泌 免疫结果 限制或促进肿瘤的发生和发展 三 肿瘤学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用 一 基因扩增的检测1 过量的蛋白表达 免疫组化 荧光 定位 ELISA和Westernblot定量 抗原 抗体 标记 标记 抗原 标记 标记 抗原 标记 2 基因拷贝数的增加 转录产物mRNA的增加 核酸分子生物学方法进行检测核酸变性 复性基本性质常用方法 1 核酸分子杂交 nucleicacidmolecularhybridisation 技术最常用的基本技术基本原理 标记的已知碱基序列 DNA或RNA单链片段 探针probe 同位素P32I125非同位素生物素地高辛荧光素 检测靶核酸 待测核酸 中是否存在与之同源的序列 1 原位杂交 ISH 2 荧光原位杂交 FISH 3 双色 多色 银染原位杂交 DSISH 3 Southernblot DNA杂交 4 Northernblot RNA杂交 2 聚合酶链反应 polymerasechainreaction PCR 技术又称体外基因扩增利用DNA变性和复性原理体外进行特定的DNA片段高效扩增获得或放大特异基因信号的重要手段 扩增产物的检测凝胶电泳分析琼脂糖凝胶电泳 最常用 聚丙烯酰胺凝胶电泳单一条带 Real timePCR原位PCRRT PCR3 基因芯片技术 二 基因突变的检测方法1 聚合酶链反应 单链构象多态性分析 Singlestrandconformationpolymorphismanalysisofpolymerasechainreactionproducts PCR SSCP 长度相同 但碱基序列不同的单链DNA构象不同在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率 泳动率 不同 基本方法作PCR将产物变性而成为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示结果可用同位素 荧光素标记非同位素标记 2 PCR 限制性片段长度多态性 restrectionfragmentlengthpolymorphisms RFLP 分析技术基本原理 序列中一个碱基发生改变 使原来的内切酶位点消失或产生新的酶切位点 用限制性内切酶消化PCR扩增出来的DNA片段 检测其酶切片段长度的差异 3 变性梯度凝胶电泳法 denaturinggradientgelelectrophoresis DGGE 基本原理电泳时 不同浓度凝胶温度不同DNA链中有一个碱基改变在不同的温度发生解链电泳迁移率改变 4 DNA序列分析 DNAsequencing 5 荧光原位杂交 FISH 6 DNA芯片技术 DNAchip 三 肿瘤的微卫星不稳定性分析微卫星不稳定性 microsatelliteinstability MI 是指简单重复序列的增加或丢失检测方法PCR DNA序列凝胶电泳 四 肿瘤易感性检测遗传癌症综合征与易感性癌症综合征易感基因视网膜母细胞瘤Rb1Wilms瘤WT1Li Fraumeni综合征p53家族性腺瘤性息肉 FAP APC遗传性非息肉性结肠癌 HNPCC hMSH2 hMSH1乳腺癌BRCA1卵巢癌BRCA1采用相应基因变异方法进行检测 五 肿瘤相关病毒核酸杂交技术与PCR技术 六 基因重组技术主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝 七 基因转染 genetransfection 技术 八 RNA干涉 RNAinterference 核酸杂交 PCR技术与免疫组化 荧光 WB方法结合免疫组化 荧光在翻译水平上定位研究基因表达核酸杂交 PCR技术检测DNA RNA 在基因或转录水平研究基因表达 九 激光捕获显微切割技术 Lasercapturemicrodissection LCM 显微镜直视下 组织切片 确定 分离 纯化单一类型细胞群或单个细胞 十 共聚焦激光扫描显微镜技术 ConfocalLaserScanningMicroscope CLSM 细胞 CT 上世纪80年代 组织内部微细结构的荧光图像 在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态改变 应用能观察各种荧光标记的 组织 包括活组织 培养细胞 粘附细胞 细胞涂片 石蜡切片 冰冻切片 后面