基因工程工具酶.ppt

12 20 2019 12 20 2019 基因工程工具酶 工若善其事 必先利其器 基因工程的操作 是分子水平的操作 它涉及到一系列相互关连的酶促反应 要靠一些重要酶类作工具 对基因进行人工切割和拼接 故称为 工具酶 已知有许多酶在基因克隆实验中有着广泛的用途 工具酶是从哪里获得的呢 12 20 2019 基因克隆的工具酶第一节限制性核酸内切酶和dna片段化第二节dna连接酶第三节dna聚合酶第四节逆转录酶及其它酶 12 20 2019 基因工程工具酶 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类 这些酶类参与微生物的核酸代谢 在核酸复制和修复等反应中具有重要作用 有的酶还具有微生物区别自己dna和非己dna的功能 进而作为降解非己dna的防御工具 在研究掌握了利用这些酶类对基因切割 拼接操作方法后 人类即获得了最好的基因工程 工具 以其功能可分为三大类 核酸降解酶类 核酸合成酶类 核酸修饰酶类 12 20 2019 12 20 2019 第一节限制性核酸内切酶和dna片段化 九个问题 一 限制性内切酶的发现二 核酸内切限制酶的类型及切割频率三 核酸内切限制酶的命名原则四 型核酸限制性内切酶的基本特性五 影响核酸内切限制酶活性的因素 5点 1 六 限制性内切酶反应的终止七 限制酶消化反应的步骤八 使用限制酶的注意点 4点 九 dna的片段化 12 20 2019 一 限制性内切酶 restrictionenzyme 的发现1 限制性核酸内切酶 是一类能够识别双链dna分子中的某种特定核苷酸序列 并由此切割dna双链结构的核酸内切酶 它们主要是从原核生物中分离纯化出来的 根据1994年美国出版的 分子生物学百科全书 的统计数字 仅 型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中 分离出2300种以上 可识别230种不同的dna序列 2 发现早在20世纪中期 以arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中 就发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制 restriction 和修饰 modification 系统 r m系统 12 20 2019 在限制 修饰系统中限制作用是指宿主细菌可以通过自身限制酶的作用 破坏入侵的外源dna 如噬菌体dna等 使得外源dna对生物细胞的入侵受到限制 而保护了宿主菌 而生物细胞 如宿主 的dna分子合成后 通过自身修饰酶的作用 使特定位置上的碱基发生甲基化而得到了修饰 可免遭自身限制性酶的破坏 这就是r m系统中修饰作用的含义 1978年w arber h o smith nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖 12 20 2019 l 12 20 2019 12 20 2019 二 核酸内切限制酶的类型及切割频率1 类型 12 20 2019 12 20 2019 2 切割频率 是指某限制性核酸内切酶在dna分子中预期的切割概率 有了它 又知道dna序列的长度 就可以估算该限制性核酸内切酶在某种dna分子中的切点数n 但前提是 假定dna的碱基组成是均一的 识别序列在dna分子上是随机分布的 因为所有的dna分子都是由4种脱氧核苷酸组成的 每一种出现的概率即为1 4 如果某限制性核酸内切 12 20 2019 酶的识别序列是6bp时 则其切割频率为 1 4 6 1 4096 即每隔4 1kb就可能有一个切割点 当识别序列为n个bp 则其切割频率为 1 4 n 12 20 2019 三 核酸内切限制酶的命名原则由于发现了大量的限制酶 所以需要有一个统一的命名法 h o smith和d nathans 1973 提议的命名系统 已被广大学者所接受 他们建议的命名原则包括如下几点 1 用属名的第1个字母 大写 和种名的头2个字母 小写 组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称 例如 大肠杆菌 escherichiacoli 用eco表示 流感嗜血菌 haemophilusinfluenzae 用hin表示 12 20 2019 限制性核酸内切酶的命名 ecori escherichia 属名 coli 种名 ry13 株系 编号 若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母 12 20 2019 2 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型 例如ecok hind 3 如果一种特殊的寄主菌株 具有几个不同的r m体系时 则以罗马数字表示 例如 流感嗜血菌rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为hindi hindii hindiii等等 12 20 2019 4 名称 限制酶 核酸内切限制酶用r表示外 还要带有系统的名称 例如 流感嗜血菌核酸内切酶r hindiii 修饰酶 则在它的系统名称之前加上甲基化酶m表示 相应于核酸内切酶r hindiii的流感嗜血菌rd菌株的修饰酶 命名为甲基化酶m hindiii 但在实际应用上 这个命名体系已经作了进一步的简化 由于附有标注字母在印刷上很不方便 所以现在通行的是把全部略语字母写成一行 在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方 限制性核酸内切酶的名称r便被省去 12 20 2019 四 型核酸限制性内切酶的基本特性 1 为单链多肽 最适ph6 8 能被盐抑制 被mg2 激活 2 底物dna分子双链中有特异性识别序列 通常有4 8个bp甚或更多 大都为一回文对称的结构 即识别序列中有一个中心对称轴 若从这个轴向两侧方向 读 内容都是完全相同的 也称为反向重复序列 3 一般可在特异性识别序列内切割双链dna分子 有例外 产生链的断裂 断裂端有粘性末端和平齐末端之分 其中两个粘性末端可以互补配对连结成重组分子 4 其他 同裂酶 同尾酶 远距离裂解酶 双切割酶等 分述如下 c 12 20 2019 a 识别序列 识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列 回文序列的概念 具有特异性识别的反向重复序列称为回文序列 识别序列有连续的 如gatc 和间断的 如gantc 两种 它们都呈回文结构 abcc b a a b c cba a b n ba abnb a abb a abb a 或 或 12 20 2019 ecor pst 不同核酸内切酶的特异识别位点 12 20 2019 b 切割类型 检验大量的实验事例之后发现 由核酸内切限制酶的作用所造成的dna分子的切割类型 通常是属于下述两种排列方式之一 1 两条链上的断裂位置是交错地 但又是对称地围绕着一个对称轴排列 这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的dna片段 3 和5 2 两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心 这样形式的断裂是形成具有平齐末端的dna片段 12 20 2019 三种酶切末端 5 粘性末端 如ecor 3 粘性末端 如pst 平齐末端 如sma alu hae 12 20 2019 5 ctgcag 3 5 ctgca oh 3 p g 3 a psti切割位点 切割后形成3 oh的单链粘性末端 3 gacgtc 5 3 g p 3 ho acgtc 5 b ecori切割位点 切割后形成5 p的单链粘性末端 5 g aattc 3 5 g oh 5 p aattc 3 3 cttaa g 5 3 cttaa p 5 ho g 5 c ecorv切割位点 切割后形成平齐末端 5 gatatc 3 5 gat atc 3 3 ctatag 5 3 ctatag 5 12 20 2019 产生的末端特征 我们所说的粘性末端是指dna分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构 若是 3 它们能够通过互补碱基间的配对而重新连结起来 平末端的dna片段与粘性末端相比 则不易于重新连结 耗能多 12 20 2019 2 同裂酶 isoschizomers 来源不同的限制酶识别序列相同 产生同样的切割 形成同样的末端 这类酶称为同裂酶 isoschizomers 若同裂酶的切点相同 会形成同样的末端 例如 hpa 和mspi c cgg 12 20 2019 来源不同 识别的靶序列也各不相同 但都能产生相同的粘性末端 称为同尾酶 常用的bamhi bcli bgl xhoi就是一组同尾酶 它们切割dna之后都形成由 gatc 4个核苷酸组成的粘性末端 很显然 由同尾酶所产生的dna片段 是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的 因此在基因克隆中很有用处 3 同尾酶 isocaudamer 12 20 2019 例如 bamh bcl bgl 三种酶可产生相同的5 gatc粘性末端 由这种同尾酶产生的dna片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来 12 20 2019 由同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点 称之为 杂种位点 hybridsite 但必须指出 这类杂种位点的结构 一般不能再被原来的任何一种同尾酶所识别切割的 例如 sali 5 gtcgac 3 和xhoi 5 ctcgag 3 的消化片段相连 但所形成的重组片段 5 gtcgag 3 则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割 也可能有少数例外 12 20 2019 表 几种常见的限制性核酸内切酶 12 20 2019 五 影响核酸内切限制酶活性的因素 5点 1 1 dna的纯度2 dna的甲基化程度3 酶切消化反应的温度4 dna的分子结构5 核酸内切限制酶的缓冲液 关于限制性内切酶的星活性 12 20 2019 1 dna的纯度核酸内切限制酶消化dna底物的反应效率 在很大程度上是取决于所使用的dna本身的纯度 若污染了在dna制剂中的某些物质后 例如蛋白质 酚 氯仿 酒精 乙二胺四乙酸edta sds十二烷基硫酸钠 以及高浓度的盐离子等 都有可能抑制核酸内切限制酶的活性 12 20 2019 为了提高核酸内切酶对低纯度dna的反应效率 一般采用如下三种方法 增加核酸内切限制酶的用量 平均每微克底物dna可高达10单位甚至更多些 加大成本 扩大酶催化反应的体积 以使潜在的抑制因素被相应地稀释 延长酶催化反应的保温时间 12 20 2019 在有些dna制剂中 尤其是按微量碱法制备的 会含有少量的dnase的污染 由于dnase的活性需要有mg2 的存在 而在dna的贮存缓冲液中含有螯合二价金属离子的edta 因此在这种贮存制剂中的dna仍然是稳定的 然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后 内含mg2 dna则会被dnase迅速地降解掉 要避免发生这种情况 唯一的办法就是使用高纯度的dna 12 20 2019 2 dna的甲基化程度限制性核酸内切酶是原核生物限制 修饰体系的组成部分 因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用 会强烈地影响酶的活性 为避免产生这样的问题 在基因克隆中使用的是从失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备的质粒dna 12 20 2019 3 酶切消化反应的温度dna消化反应的温度 是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素 不同的核酸内切限制酶 具有不同的最适反应温度 而且彼此之间有相当大的变动范围 大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37 但也有许多例外的情况 其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37 例如smai是25 apai是30 有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37 例如maei是45 bcli是50 maelii是55 还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达60 以上 消化反应的温度低于或高于最适温度 都会影响核酸内切限制酶的活性 甚至最终导致完全失活 12 20 2019 4 dna的分子结构dna分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响 某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒dna或病毒dna所需要的酶量 要比消化线性dna的高出许多倍 最高的可达20倍 此外 还有一些核酸内切限制酶 切割它们自己的处于不同部位的限制位点 其效率亦有明显的差别 据推测 这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差异造成的 位点偏爱见教材p42 12 20 2019 5 限制性核酸内切酶的反应缓冲液核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括 氯化镁或醋酸镁 氯化纳或醋酸钾 tris hcl ac 巯基乙醇或二硫苏糖醇 dtt 牛血清白蛋白 bsa 等 酶活性的正常发挥 是绝对需要二价阳离子的 通常是mg2 购买时厂家会提供专门的缓冲液并有说明其成分 有些核酸内切酶可以在2种甚至4种缓冲液中均有较高的催化活性 对绝大多数限制酶来说 在ph 7 4的条件下 其功能最佳 一般为ph6 8 12 20 2019 6 星 活性 在 非最适的 反应条件下 包括高浓度的核酸内切限制酶 高浓度的甘油 低离子强度 用mn2 取代mg2 以及高ph值等等 有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生 松动 从其 正确 识别序列以外的其它位点切割dna分子 这种现象称为star活性 有些核酸内切限制酶的切割特异性 受所用的缓冲液成份的影响比较明显 例如 最常用的ecori限制酶 在正常的情况下 是在g aattc识别序列处发生切割作用的 但如果缓冲液中的甘油浓度超过5 v v 那么其识别序列的特异性就会发生松动 可在aatt或pupuatpypy序列处发生切割作用 ecori限制酶的这种特殊的识别能力 通常叫做星活性 以ecori 表示 12 20 2019 六 限制性内切酶反应的终止消化dna样品后 在进一步处理dna样品前往往需要钝化内切酶的活性 大多数限制性内切酶的钝化方法是65 温浴5分钟 但有些酶 如bamhi和hae 对热稳定 则需加入终止反应液 如加入0 5mol l的edta使之在溶液中的终浓度达到10mmol l 以终止反应 此外 还可以用等体积的酚抽提酶解产物 提取dna 如果用限制性内切酶消化dna分子后 为了进行凝胶电泳分析 则可直接加入凝胶电泳加样缓冲液 振荡混合后 直接上样进行凝胶电泳 12 20 2019 七 限制酶消化反应的步骤以下是对0 2 1 0ugdna进行消化的典型反应步骤 如要对更大量的dna进行消化 则反应的各个成分须相应放大 1 将dna溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀 使总体积为18ul 2 加入2ul适当的10x限制酶消化缓冲液 轻敲管外壁以混匀之 3 加入1 2单位限制酶 轻弹管外壁以混匀之 1单位酶通常定义为 在建议使用的缓冲液及温度下 在20u1反应液中反应1小时 使lugdna完全消化所需的酶量 12 20 2019 4 将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育 5 加入0 5mol ledta ph8 0 使终浓度达10mmol l 以终止反应 6 如果消化后dna直接进行凝胶电泳分析 可加入6ul凝胶电泳加样缓冲液 振荡混合后 即可加样进行电泳 如欲纯化消化后的dna 可用酚 氯仿和氯仿各抽提1次 再用乙醇沉淀dna 12 20 2019 八 使用限制酶的注意点 4点 1 限制酶十分昂贵 遵循以下建议可以最大限度地节省开支 为能从贮存管内取出小量的酶 只要用一次性使用的移液器吸头在酶溶液表面轻沾一下即可 这样 你可以取到至少0 1ul的酶量 浓缩的限制酶也可在使用前用1x限制酶缓冲液稀释 但切勿用水稀释以免酶变性 12 20 2019 2 限制酶在50 甘油中保存于 20 时是稳定的 在进行酶切消化时 先加入除酶以外的所有反应成分混匀后 再加入酶液 并且从冰箱内取出的贮酶管要立即放置于冰上 操作要快速 用完后立即将酶放回冰箱 以使酶在冰箱外放置的时间尽可能缩短 每次取酶时都应换一个无菌吸头 一旦限制酶中污染了dna或其他酶 将造成财力和时间上的浪费 12 20 2019 3 尽量减少反应中的加水量以使反应体积减到最小 但要确保酶体积不超过反应总体积的1 10 否则 限制酶活性将受到甘油的抑制 4 通常延长消化时间可使所需的酶量减少 这在切割大量dna时不失为一大节约方法 在消化过程中 可取少量反应液进行微胶电泳以判断消化进程 12 20 2019 九 dna的片段化 1 单酶切法 单酶切的dna片段数 若底物dna为环状 完全切割后 产生与其切点数 n 相同的dna片段数 若底物dna为线状 完全酶切后 则产生n 1个dna片段数 12 20 2019 2 双酶切法 可在同一反应体系中进行 也可在不同的反应体系中分步进行 3 部分酶切 不完全酶切 有多种原因造成 使dna片段得率降低 但专门创造部分酶切条件可以获得需要的dna片段 p49 12 20 2019 4 dna分子的限制性图谱 1 限制性图谱 根据用一种或多种限制酶酶切的结果 可以在dna分子上标识出各种酶切识别序列位点 这种限制性酶切位点的分布图谱 叫作dna分子的限制性图谱 即作图的界标 又称遗传标记marker 实质上是限制性酶的识别序列位点 2 根据作图方法和界标的不同 又可以分别称作 遗传图 和 物理图 最精细的物理图就是基因组的全序列图 图上界标间的距离 是以物理长度来表示 即以核苷酸对的数目来表示 12 20 2019 第二节dna连接酶一 dna连接酶的发现二 连接酶的连接机理三 分类四 连接酶最佳反应温度 12 20 2019 一 dna连接酶的发现1967年 世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条dna链之间形成磷酸二酯键的酶 即dna连接酶 1igase 这种酶需要在一条dna链的3 末端具有一个游离的羟基 oh 和在另一条dna链的5 末端具有一个磷酸基团 p 只有在这种情况下 才能发挥其连接dna分子的功能作用 12 20 2019 在大肠杆菌及其它细菌中 dna连接酶催化的连接反应 是利用 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 氧化型 作能源的 而在动物细胞及噬菌体中 则是利用atp 腺苷三磷酸 作能源 值得注意的是 dna连接酶并不能够连接两条单链的dna分子或环化的单链dna分子 被连接的 链必须是双螺旋的一部分 实际上 dna连接酶是封闭双螺旋dna骨架上的缺口 nick 即在双链dna的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂 12 20 2019 12 20 2019 二 连接酶的连接机理在反应中 atp 在有些连接酶是nad 提供了激活的amp 同dna连接酶生成一种共价结合的酶 amp复合物 同时伴随着释放出焦磷酸 ppi 或烟酰胺单核苷酸 nmn 其中 amp 腺苷一磷酸 是通过一种磷酸酰胺键同dna连接酶的赖氨酸之c 氨基相连 图 激活的amp随后从赖氨酸残基转移到dna一条链的5 末端磷酸基团上 形成dna 腺苷酸复合物 最后一步是3 oh对活跃的磷原子作亲核攻击 结果形成磷酸二酯键 同时释放出amp 12 20 2019 12 20 2019 12 20 2019 三 分类 用于共价连接dna限制片段的连接酶有两种不同的来源 一种是由大肠杆菌染色体编码的叫做dna连接酶 另一种是由大肠杆菌t4噬菌体dna编码的叫做t4dna连接酶 这两种dna连接酶 除了前者用nad 作能源辅助因子 后者用atp作能源辅助因子外 其它的作用机理并没有什么差别 12 20 2019 四 连接酶最佳反应温度连接酶连接切刻dna的最佳反应温度是37 但是在这个温度下 粘性末端之间的氢键结合是不稳定的 因此 连接粘性末端的最佳温度 应是界于酶作用速率和末端结合速率之间 一般认为 15 比较合适 12 20 2019 第三节dna聚合酶 4个问题 分子克隆操作中 常使用的dna聚合酶有大肠杆菌dna聚合酶i 大肠杆菌dna聚合酶的klenow大片段 t4dna聚合酶 t7dna聚合酶 逆转录酶等 这些dna聚合酶的共同特点是 它们都能把脱氧核糖核苷酸连续加到双链dna分子引物链的3 一oh末端 催化核苷酸的聚合 而不发生从引物模板上解离的情况 其中 t7dna聚合酶的聚合能力最强 12 20 2019 一 大肠杆菌dna聚合酶i1956年a kornberg等首先从e co1i细胞中分离出来 它是在dna模板的方向上催化核苷酸聚合的酶 由单一多肽组成的球蛋白 1 功能 dna聚合酶i是一个多功能酶 它包括三种不同的酶活力 1 5 3 聚合酶活性 催化单核苷酸结合到dna模板的3 一oh末端 以ssdna作模板 沿引物的3 一oh方向按模板顺序从5 一3 延伸 2 5 3 外切酶活性 e co1idna聚合酶1也能从游离的5 末端降解dsdna成为单核苷酸 3 3 5 外切酶活性 dna聚合酶i还能从游离的3 oh末端降解dsdna或ssdna成为单核苷酸 12 20 2019 p p p p p p p p p p t t a a a a g g c c ho p c oh g p oh u p oh u p oh g p oh oh 5 5 3 rnaprimer dnapolymerase 5 3 polymerase 12 20 2019 2 e colidna聚合酶 在基因工程中的重要用途 1 制备高比活的dna探针通过dna缺口转移 制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的dna探针 2 用于分子克隆 3 dna序列分析 12 20 2019 缺刻转移 nicktranslation 指在dna分子的单链缺口上 dna聚合酶i的5 3 核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生 这就是说 当外切酶活性从缺口的5 一侧移去一个核苷酸之后 聚合作用就会在缺口的3 一侧补上一个新的核苷酸 但由于poli不能够在3 oh和5 p之间成键 因此随着反应的进行 5 一侧的核苷酸不断地被移去 3 一侧的核苷酸又按序地增补 于是缺口便沿着dna分子按合成的方向移动 这种移动特称为缺刻转移 12 20 2019 12 20 2019 二 klenow片段1 本质 它是由大肠杆菌dna聚合酶i全酶 经枯草杆菌蛋白酶 一种蛋白质分解酶 处理之后 产生出来的分子量为76x103dal的大片段分子 称为klenow片段或者klenow聚合酶 2 功能 klenow聚合酶仍具有5 3 的聚合活性和3 5 的核酸外切酶活性 但失去了全酶的5 3 的核酸外切酶活性 12 20 2019 3 主要用途 修补经限制酶消化的dna所形成的3 隐蔽末端 标记dna片段的末端 以及cdna克隆中的第二链cdna的合成 pcr 双脱氧链末端终止法进行dna测序等 12 20 2019 12 20 2019 三 t4dna聚合酶t4dna聚合酶 是从t4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的dna聚合酶 具有两种酶催活性 即5 3 的聚合酶活性和3 5 的核酸外切酶活性 如同大肠杆菌dna聚合酶的klenow片段一样 t4dna聚合酶也可以用来标记dna平末端或隐蔽的3 末端 12 20 2019 12 20 2019 四 末端转移酶 末端脱氧核苷酸转移酶 从小牛胸腺和骨髓中提取 可使dntp添加到dna分子的3 oh末端上 不要求模板 但需co2 的存在 添加的末端分2类 一类是加寡da和dc 另一类是加寡dt和dg 混合这2类后 可使同聚物da和dt尾部退火连接 用途 1 给载体或cdna加上互补的同聚物 2 用于dna片段3 末端的放射同位素标记 12 20 2019 另外几种 耐热dna聚合酶 taqdna聚合酶 t7噬菌体dna聚合酶 改造的测序酶 rna聚合酶 分为2种类型 一种以dna为模板 用来做rna探针 一种不以dna为模板 又称为poly a 聚合酶 在缺少poly a 的rna上加尾 a a a a a 再以olig dt 为引物合成cdna的第一连 12 20 2019 第四节逆转录酶及其他常用酶 4个问题 一 逆转录酶又称为依赖rna的dna聚合酶 这是一种有效的逆转录rna合成为dna的酶 其产物是与mrna互补的dna又称cdna 12 20 2019 12 20 2019 1 逆转录酶是一个多功能性酶 主要有几种不同的酶活性 1 依赖rna的dna聚合酶以rna链为模板 以