多基因病的分子遗传学ppt课件.ppt

多基因病的分子遗传学唐吟宇 主要内容 第一节多基因病的一般特征第二节多基因病的研究方法 重点难点 第三节糖尿病的分子遗传学 第一节多基因病的一般特征 一特征1 病种多 如高血压 冠心病 动脉粥样硬化 哮喘 高脂蛋白血症 糖尿病 胃及十二指肠溃疡 精神分裂症 风湿病 癫痫 甲亢 唇裂 腭裂 先天性心脏病等 2 发病率高 群体发病率 家庭复发风险比较 单基因遗传病 25 50 多基因遗传病 1 10 群体发病率比较 单基因病 低于1 10000 多基因病 超过1 1000 有些1 10 3 危害性大 直接危害人类的生存与健康 4 病因复杂 遗传因素和环境因素 5 微效性6 累加作用7 对其研究具有前沿性 多基因病是复杂疾病 遗传因素有以下特点 1 参与发病的遗传因素多于一个 每个基因通过对中间性状的影响直接或间接地促进疾病的发生 2 每个基因参与发病的程度不同 大多数基因的作用较小 但也可由一个或几个基因呈主基因效应 3 每个基因只赋予个体某种程度的易患性 但每个基因的作用不足以致病 也并非致病所需 需要多个基因累加起来才会致病 4 各基因参与发病的机制可能是 各自对不同的代谢途径产生影响 疾病的最终发生是各基因在不同途径作用的综合结果 5 各基因致病效应的累积加上环境因素的作用构成了个体的疾病易患性 当易患性超过一定阈值时即可导致疾病的发生 二概念 易患性与发病阈值 1 易患性 liability 人群中易患性变异 呈正态分布 2 发病阈值 threshold 易患性达到或超过一定的限度后就会发病 该限度的易患性即发病值 群体的易患性平均值 从该群体的发病率作出估计 即群体发病率是测量易患性平均值的依据 3 遗传度 heritability 多基因病的易患性由遗传因素和环境因素共同引起 其中遗传因素所起作用的相对大小称为遗传度 heritability 遗传度提供的其他信息 若通过患者同胞发病率计算的遗传度高于其他亲属发病率计算的遗传度 或者遗传度超过100 则提示单基因遗传病的可能性 三复发风险的一般规律1 遗传度高低 2 患者亲属级别 一级亲属的发病率为群体发病率的开方值 3 家庭中患者数量 4 患者病情严重程度 5 近亲婚配 6 性别 第二节多基因病的研究方法当前对多基因病的研究 主要是寻找疾病的主基因 或易感基因 并试图阐明其遗传机制 主要方法 关联分析 associationstudy 连锁分析 linkageanalysis 基因组筛查 genomicscanning 候选基因研究 candidategenestudy 一 关联分析 associationstudy 比较患者组与对照组某遗传标记出现的频率 从而判断遗传标记与疾病关系的研究方法 关联分析 选择与疾病代谢有关的蛋白或酶的基因作为候选基因 在其位置已知的情况下 首先选取该基因内部或附近的多态性位点作为遗传标记 然后进行病例 对照研究 比较病例组与对照组在遗传标记位点等位基因出现的频率 如果遗传标记位点的频率在病例组和对照组有显著差异 则该标记与疾病关联 对于复杂性状的多基因病 关联分析较连锁分析更为有效 因为关联分析研究对象是病人和正常人 无需家系资料 且更容易找出只有微弱效应的基因 即使显示关联的标记不是造成疾病的变异 但很可能与变异连锁 因此关联分析更适合于多基因遗传模式 若差异极为显著 则遗传标记与疾病关联 表明有三种可能 1 遗传标记与致病基因座不在一条染色体上 2 遗传标记与致病基因座在一条染色体上 3 遗传标记本身即致病基因座 与疾病的发生机理有直接的关系 遗传标记主要是微卫星DNA STR 和单核苷酸多态性 SNP 二 连锁分析 linkageanalysis 连锁分析是分析两基因在染色体上相互关系的方法 通常是应用已知位点的遗传标记 在患者家系中进行分析 从而确定该致病基因在染色体上的粗略位置 连锁分析 是确定两个遗传标记或者更多遗传标记之间的物理关系 以确定致病基因的位置 它根据生殖细胞减数分裂时 染色体发生交换和重组的原理 如果标记与特定基因位于不同的染色体 那么向子代传递时 它们将会发生自由分离 反之 如果标记与特定基因位于同一染色体且相距较近 在传递过程中 它们将不会发生自由分离 而呈现共分离的现象 行为一致 利用这个原理 如发现某个标记物与疾病存在 很强的 连锁关系 则可将疾病相关基因确定在和该遗传标记 非随机 共同传递的区域 该方法的好处是它将致病基因限定在一个小的范围内 以便进一步寻找引起疾病的突变 不足之处是 不能直接发现致病基因 且很难收集到合适的大家系 所以在探索多基因病相关基因的应用中受到一定限制 三 基因组筛查 genomicscanning 是指在不需要事先了解该基因位置 生物学功能 致病机制的情况下 利用高密度的多态性标记 通过全基因组扫描 划定与疾病相关的易感区域 再在此区域内选择适当的多态性标记精细扫描 然后根据连锁分析的方法 评价疾病与标记物的相关性 从而定位与疾病相关的染色体区域或致病基因 其流程如下 1 家系收集及基因组DNA提取 2 微卫星标记或SNP标记的选择 3 标记的引物合成和PCR扩增 4 电泳检测 基因分型 5 等位片段分析 通过电脑 6 基因组扫描综合分析 计算LODS值 两基因非随机出现的概率与随机出现的概率之比 再取对数 若某个标记的LODS值大于3 比值大于103 即可肯定标记与致病基因连锁 进而将致病基因定位在标记所在区域内 全基因组筛查 选择并使用覆盖23条染色体上的 密度适当的遗传标记 结合家系进行分析 部分基因组筛查 选择并使用覆盖某一条染色体或其部分区段上的 密度适当的遗传标记 结合家系进行分析 四 候选基因研究 candidategenestudy 基于对代谢途径的认识 已知代谢途径 选择关键酶的基因 作为疾病的候选基因 研究其编码顺序或非编码顺序与疾病的关系 即研究患者中该基因的编码序列是否有基因突变 非编码序列是否有多态性位点基因与调控关联或与调控连锁 确认或排除候选基因是否致病基因 进而可能克隆疾病基因 用于基因诊断或药物生产 综上所述 目前对于多基因病易感基因的研究 主要有两种方法 1 候选基因策略的关联分析 2 全基因组扫描的连锁分析 比较 对于多基因病而言 关联分析可能比连锁分析更有效 因为关联分析相对于连锁分析更易找到只有很微小效应的基因 而且不需要很难找到的家系 结论 关联分析更适合于多基因遗传的模式 对几种方法作选择时需要考虑的因素 家系 样本数 经费 已有资源 研究时间 疾病等 第三节糖尿病的分子遗传学糖尿病 diabetesmellitus DM 乃多基因病复杂性的代表 是继肿瘤 心血管疾病之后第3位严重威胁人类健康的重大疾病 全世界约有1 5亿多患者 其研究已经成为世界性的难题 可分为 胰岛素依赖性糖尿病 IDDM I型糖尿病T1DM非胰岛素依赖性糖尿病 NIDDM II型糖尿病T2DM占90 发病率 城市近10 农村3 糖尿病 其遗传机制的复杂性历来是遗传学家头痛的问题 fromheadachetonightmare 一 当前研究方法 1 候选基因法确定一个或数个在糖代谢中起重要作用的酶的基因 在群体或家系中研究这个基因与发病的关系 研究患者中该基因的编码序列是否有突变 非编码序列是否有多态性位点与基因调控关联或连锁 不平衡 以确认是否致病基因 候选基因有 醛糖还原酶基因 AR 血管紧张素 转换酶基因 ACE 血管紧张素原基因 AGT 一氧化氮合成酶基因 NOS 葡萄糖激酶基因 GCK 胰岛素基因 胰岛素受体基因等 2 遗传标记排除作图法 连锁分析法 寻找与糖尿病发病相关的分子遗传学标记 通常对糖尿病家系进行连锁分析 确定或排除某一区段与糖尿病的尚未知的致病基因连锁 这是对未知代谢途径研究的有效方法 以上两种方法 既有区别 也有联系 I型糖尿病相关基因位点比较肯定 主要有 IDDM1 15 II型糖尿病相关基因位点正在进行大量研究 现已报道的阳性重复位点主要有 20q12 13 1q21 23 12p13 7q21等 二 主要候选基因或基因位点 一 HLAII类抗原基因与T1DM的关联1 HLA基因谱HLA是多基因家族中的超基因 位于6号染色体短臂 见示意图 复等位基因数 II类基因区有4个亚区 每个亚区的等位基因数分别是 DP区6个 D区26个 DQ区9个 DR区20个 一条染色体上的每个亚区内都各有多个 链基因 基因产物为糖蛋白 分别由各亚区 基因合成 和 链 再形成非共价二聚体 2 HLA DR和HLA DQ与T1DM的关联 1 DR3 DR4 DRw6DRw8与T1DM关联 2 DQ基因区与T1DM的相关性比DR基因区更强 例如 0 2 的美国人为T1DM所困 而携带DR3和DR4的白人发病率是正常人的20倍 3 DQ 基因可能决定T1DM的易感性和耐受性 4 可能有某单倍型的几个位点共同参与了T1DM的易感性 二 其它1型糖尿病的易感位点IDDM2胰岛素基因IDDM315q26IDDM4D11S1253 1374IDDM56q25与雌激素受体基因连锁IDDM618S478IDDM72q31 谷氨酸脱羧酶抗体基因 IDDM86q25 27IDDM9IDDM10D10S193 588IDDM1114q24 3 q31D14S67与糖尿病连锁IDDM12D2S272 2q33 细胞毒素相关因子 IDDM13D2S164 2q24 IDDM156q21 与HLA连锁 虽已报道15个易感位点 但还会有新位点发现 还需要进行研究以便确认或排除 还需进一步精细定位 进而克隆易感基因 阐明易感基因的生物学功能 三 胰岛素基因人胰岛素基因位于11p15 由1355bp组成 包括3个外显子和2个内含子 5 侧翼区是调节顺序 启动子位于第一个外显子上游25bp处 第一外显子上游168bp 258bp之间的顺序为增强子 该基因区称为IDDM2 胰岛素是最为保守的生物大分子之一 哺乳类动物之间的胰岛素基因结构差异很小 人胰岛素基因突变很少发生在编码区 因此 胰岛素基因突变不是糖尿病的主要病因 在胰岛素基因5 侧翼区 在距转录起始点363bp处 有一个高度变异区 INS5 HVR 其重复单位为14bp ACAGGGGTGTGGGG 可将其作为一个遗传标记 按此HVR的长度 可将其分为三型等位基因 型等位基因 小于600bp重复40多次 型等位基因 600 1600bp重复80多次 型等位基因 1600 2470bp重复160多次 三型基因按孟德尔方式传递 人群中存在六种基因型 在欧美 高加索人种 糖尿病患者 型等位基因的频率显著高于对照 四 胰岛素受体基因胰岛素作用于靶细胞需要胰岛素受体与之结合 胰岛素受体是一种质膜糖蛋白 它由连接胰岛素的两个 亚单位和具有酪氨酸激酶活性的两个 亚单位组成 胰岛素受体基因突变使受体与胰岛素的结合性降低 产生靶细胞抵抗胰岛素的现象 这主要是T2DM的特征 总之 胰岛素受体基因突变可导致糖尿病 但基因的保守性 决定其也不是糖尿病的主要原因 五 葡萄糖激酶 GCK 基因GCK存在于肝脏和胰岛的 细胞 GCK对血糖的调节如下图 血糖 血糖 细胞葡萄糖感受器 胰岛GCK 胰岛素 肝葡萄糖感受器 肝GCK 如果GCK活性降低 正常代谢平衡出现紊乱 则导致血糖增高 引起糖尿病 1 GCK基因结构及多态性GCK基因定位于7p13 由12个外显子 11个内含子组成 这12个外显子从5 向3 方向依次命名为1B 1H 1C 2 3 4 5 6 7 8 9 10 其中1B仅出现在胰岛细胞 而1H和1C仅出现于肝细胞 其他外显子在两种组织内相同 这种组织特异性是由基因的特异启动子所决定的 即组织不同启动子不同 在GCK基因的不同部位转录 形成各自特异的GCKmRNA 在GCK基因区3 端处 发现3个 GC n 2个 GA n不连续串联重复序列 即GCK微卫星DNA多态性标志之一 称为GCK 1 现发现GCK 1含有七个等位基因 将含195bp的等位基因命名为Z 其他六种分别为Z 2 Z 4 Z 6 Z 8 Z 10 Z 15 它们的不同之处就在于上述不连续双核苷酸重复序列长度不同 如Z 2含197bp Z 15含180bp 依此类推 2 GCK基因与T2DM的关联美国黑人Z 4等位基因与T2DM关联 可看成该人群T2DM的遗传标记 毛里求斯人Z 2等位基因与T2DM关联 白人 印第安人Z等位基因与T2DM负关联 3 GCK基因突变与MODY型糖尿病目前已知 GCK基因突变是MODY的病因一 GCK基因第七外显子发生无意义突变 Glu 279 AM 即谷氨酸 提前终止 或发生错义突变 Gly 261 Arg 即谷氨酰胺 精氨酸 突变的GCK改变了与葡萄糖的亲合力 还引起细胞的ATP ADP比值改变 干扰了胰岛素的分泌 导致MODY发生 六 NOS基因一氧化氮作为细胞信号传递的信使是近年来生命科学的重要成就 一氧化氮 NOS 合成酶基因与糖尿病的关系应受到关注 人类NOS由多个基因编码 可分为诱导型 iNOS 神经元型 nNOS 和内皮细胞型 eNOS NOS是内源性NO生成的限速酶 影响NOS基因转录 翻译的因素都可以影响NO的生成 iNOS定位于17cen q11 2区域 长约37kb 包含26个外显子 nNOS定位于12q24 2 24 31 长约120kb 有28个外显子 eNOS定位于7q35 36 长约21kb 有26个外显子 在糖尿病微血管并发症鼠中发现eNOS表达下降 iNOS表达增加 iNOS基因启动子区的一个多态性位点可能与欧洲人的2型糖尿病相关 在南非 观测到nNOS基因的7 9等位基因在2型糖尿病患者中显著增多 在eNOS基因中发现四种突变可能影响糖尿病的微血管并发症 我们研究了中国汉族人iNOS基因和eNOS基因微卫星DNA各等位基因与2型糖尿病的关系 发现iNOS基因 CCTTT 14和 CCTTT 15与DM负相关 eNOS基因 CA 34与DM正相关 对DM及其并发症发生机制有了新的认识 有必要进一步研究正常人群和DM及微血管病变患者NOS基因编码区的差异 单核