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Genloci Classic CRISPR-Cas9 操作流程路杨旭 （山西大学 生命科学学院，山西 太原 ）摘 要：基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。CRISPR-Cas9 技术是在细胞系中进行基因敲除的新方法，利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。通过一系列研究，证明了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的RNA序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。关键词：CRISPR-Cas9 技术；重组DNA技术；1.CRISPR-Cas9背景介绍 CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中类和类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。 基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。 2013 年 1 月份，美国两个实验室在Science杂志发表了基于 CRISPR-Cas9 技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的 RNA 将 Cas9 核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过 RNA 注射的方式将 CRISPR-Cas 系统导入小鼠受精卵比 DNA 注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组 DNA 进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的 RNA 序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用 CRISPR-Cas 技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因（肥胖相关 G 蛋白偶联受体 Mc4R）突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。 CRISPR-Cas 技术是继锌指核酸酶（ZFN）、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。2.CRISPR-Cas9原理Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。作为一种 RNA 导向的 dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子（unifying factor），能够共定位 RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的 Cas9（ Cas9 nuclease-null）融合，并表达适当的 sgRNA ，可靶定任何 dsDNA 序列，而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA，不影响 Cas9 的结合。由于PAM序列结构简单（5-NGG-3），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。Cas9 能在任何 dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及 RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。3.操作步骤3.1设计 2 条单链 oligo 序列；退火形成双链DNA3.2将双链 DNA 连接到载体中。3.3转化G10 Competent Cell;筛选阳性克隆；测序验证序列；质粒大提；电转染靶细胞。3.4在细胞内 crRNA 识别靶位点， Cas9 对靶位点进行随机剪切。3.5 CruiserTM酶切细胞池,计算突变率；CruiserTM 酶切初筛阳性克隆；将阳性克隆测序验证;做敲除序列比对分析。3.1设计 Oligo DNA 序列首先，您需要在靶标 DNA 区域中设计一对 20bp 左右的 oligo DNA。另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续 PCR 或测序检测阳性克隆，引物能扩增约 300bp 的 DNA 片段，上游引物距突变位点约 100bp，下游引物距突变位点约 200bp。将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为 PAGE。3.2 T4 DNA Ligase 连接将合成后的2条单链oligoDNA退火形成双链DNA，再与载体连接，pGK1.1 linear vector是线性化载体，无需酶切处理，可直接用于T4 DNA Ligase 连接反应，pGK1.1 载体已经优化过，其转染和敲除的 效率比一般 CRISPR 载体更高。退火反应体系如下：正链 Oligo(100M)0.5l负链 Oligo(100M)0.5lddH2O18lAnnealingBuffer(20x)1l20l将以上体系瞬时离心后，置于 PCR 仪中 95孵育 3min，孵育后自然冷却 20min。取 1.75l 的杂交后的双链 DNA 进行 T4 DNA Ligase 连接反应，反应体系如下：pGK1.1 linear vector2l双链 DNA1.75lT4 DNA Ligase1l10xT4 DNA Ligase Buffer1lddH2O4.25l10l连接产物可以直接转化 DH5a 高效感受态细胞，转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考分子克隆 实验指南，pGK1.1 的抗性为卡那霉素抗性，筛选后的阳性克隆，需测序验证序列的正确性。3.3电转染靶细胞(推荐)转染前进行质粒大提，确保质粒浓度2g/l 浓度，再取 47g 进行电转染靶细胞，推荐使用 Celetrix 细胞电转仪(型号：CTX-1500A)，贴壁细胞的数量需 1x1063x106，悬浮细胞的数量需 3x1065x106。另外，您也可以使用转染试剂转染靶细胞。3.4混合克隆 pool 检测48-72 小时后做有限稀释，一般 5 块板足够，并取电转后细胞的 pool 1000 个细胞以上离心，去上清， PBS 洗一遍，细胞沉淀溶于适量的 PBS 中，煮 5min 后模板就制备好了，剩余的 pool 细胞冻存。3.5CruiserTM 筛选阳性克隆将剩余的 pool 的靶细胞有限稀释后，分到 96 孔板中进行单克隆培养，如果靶细胞是悬浮细胞，推荐 使用 Cell Plaza(Cat.No.: GP08250)培养细胞，待细胞长好后，取 1000 个左右的细胞，提基因组。然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆，对 CruiserTM 筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析。CRISPR-Cas9 基因编辑实验流程图如下：4.展望上世纪70年代开发出重组DNA技术标志着一个生物学新时代的开始。第一次，分子生物学家们获得了操控DNA分子的能力，使得研究某些基因以及利用它们来开发出新型的医学和生物技术变为可能。近年来，基因组工程学技术取得的进展引发了一场生物研究新革命。在生命科学研究中，一些可以删除、插入和修饰细胞或生物体DNA序列的技术，使得阐析特异基因和调控元件的功能成为可能。多重编辑可进一步实现在更大的规模上调查基因或是蛋白质网络。在生物技术中，精确地操控遗传构件和调控机器还可以推动逆向操控或重建有用的生物系统。此外，基因组工程学正在推动新一代的药物研发和医药治疗。同时干扰多个基因可以模拟出作为复杂多基因疾病基础的累加效应，促成新的药物靶点。真核生物基因组包含数以亿计的DNA碱基，因此难于对其进行操控。开发出借助同源重组（HR）的基因打靶技术是基因组操控取得的一个突破。为了克服这些挑战，近年来开发出了一系列基于核酸酶的可编程基因组编辑技术，使得能够靶向性地、高效地改造多种真核生物，尤其是哺乳动物物种。在当前的基因组编辑技术中，发展最快的就是一类称作为Cas9的RNA引导核酸酶，其来自于细菌的适应性免疫系统CRISPR,借助于短RNA分子的引导Cas9可以轻易地靶向几乎所有的基因组选择位点。日前，有课题组利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞（包括iPS）的特定的基因组位点上进行切割，修饰。 Rudolf Jaenisch 研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。 他们将Cas9/sgRNA 与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。 传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。 核酸酶ZFN/TALEN 尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。参考文献：1.Yang B, Wen X, Kodali N S, Oleykowski C A, Miller C G, Ku-linski J, Besack D, Yeung J A, KowalskiD, Yeung A T. Purification, cloning, and characterization of the CEL I nuclease. Bio-chemistry, 2000,39: 35333541.2.Perry J A, Wang T L, Welham T J, Gardner S, Pike J M, Yoshida S, Parniske M. A TILLING reversegenetics tool and a accessible collection of mutants of the legume Lotus japonicus. Plant Physiology,2003,866871. 3.McCallum C M, Comai L, Greene E A, Henikoff S. Targeting Induced Local Lesio