siRNA说明书.doc

产品以冻干粉的形式，常温运输。收到产品后，请于-20-80保存，冻干粉可以稳定保存一年。使用前请瞬时离心，用RNase-free H2O或者灭菌ddH2O，配制成20M储存液，分装保存，避免反复冻融 (尽量不超过5次)。表120M储存液的配置参考siRNA(nmol)0.250.512520溶解体积(l)12.525501002501000使用前须知为避免外界因素(包括酶，极端pH或者温度条件等)导致产品降解，所有操作请严格遵循RNA操作规则。实验过程中，产品最好于冰上放置，使用完毕后请于-20-80小心保存。细胞实验方法为了降低细胞密度、试剂用量，转染效率等因素导致的孔间差异，保证实验可靠性和可重复性，一般建议：a. 转染实验中每个转染样品至少设置3个以上复孔；b. 接种细胞时，每孔接种的细胞数量尽量保持一致，并且细胞在各孔的表面平均分布。1. 转染浓度：siRNA产品最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异。推荐初始转染浓度为50nM，转染后检测时间为2472h。最佳转染效率一般通过设置时间曲线和浓度梯度进行优化，优化的范围建议为5100nM。2. 转染步骤：以lipofectamine2000(简称lipo2000)转染siRNA于24孔板，转染浓度为50nM为例，其他规格容器转染请参考表2。1) 转染前一天，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的培养基，使转染时的细胞密度能够达到3050% (不同细胞生长速度不一样，因此，接种细胞的数量需要根据细胞培养的经验)。注意：转染时，细胞密度是影响转染效率的关键因素之一，细胞生长过度会削弱细胞活力，降低细胞的转染效率。2) 对于每个转染样品，请按以下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：a. 稀释siRNA：用50l不含血清培养基Opti-MEM(v1)稀释1.25l 20M的siRNA储存液，轻轻混匀，室温孵育5min；b. 稀释lipo2000：用50l不含血清培养基Opti-MEM(v1)稀释1l lipo2000，轻轻混匀并室温孵育5 min；c. 将a与b轻轻混匀，室温孵育20min(溶液可能会有浑浊，但不会影响转染)。注意：稀释好的lipo2000长时间放置可能导致转染试剂活性的降低，应尽量在25min之内与稀释好的siRNA混合。另在混合试剂时，请勿剧烈吹打或振荡，手指轻弹管壁即可，过度用力可能会破坏脂质体的结构，甚至影响siRNA-lipo2000混合物的形成。3) 将siRNA-lipo2000混合液加入含有细胞的400l培养基(v2)的培养孔中，轻轻混匀；4) (可选)培养46h后，将孔中含siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜培养基；5) (可选)进行其他必要的特殊处理(如加药处理)；6) 将培养板置于37的CO2培养箱中培养2496h (培养时间与实验目的相关)。表2使用lipo2000(invitrogen)转染siRNA产品用量参考v1：Opti-MEMI (无血清、无抗生素，转染专用)；v2：完全或不完全培养基培养板每孔中总体积(v1+v1+v2)siRNA终浓度siRNA储存液lipo2000DNA共转染96-well100l (25l+25l+50l)100nM0.5l0.25l10100ng100l (25l+25l+50l)50nM0.25l0.25l10100ng100l (25l+25l+50l)30nM0.15l0.25l10100ng100l (25l+25l+50l)20nM0.1l0.25l10100ng100l (25l+25l+50l)10nM0.05l0.25l10100ng24-well500l (50l+50l+400l)100nM2.5l1l100200ng*500l (50l+50l+400l)50nM1.25l1l100200ng500l (50l+50l+400l)30nM0.75l1l100200ng500l (50l+50l+400l)20nM0.5l1l100200ng500l (50l+50l+400l)10nM0.25l1l100200ng12-well1mL (100l+100l+800l)100nM5l2l200400ng1mL (100l+100l+800l)50nM2.5l2l200400ng1mL (100l+100l+800l)30nM1.5l2l200400ng1mL (100l+100l+800l)20nM1l2l200400ng1mL (100l+100l+800l)10nM0.5l2l200400ng6-well2mL (250l+250l+1500l)100nM10l5l5001000ng2mL (250l+250l+1500l)50nM5l5l5001000ng2mL (250l+250l+1500l)30nM3l5l5001000ng2mL (250l+250l+1500l)20nM2l5l5001000ng2mL (250l+250l+1500l)10nM1l5l5001000ng*：实验参考用量示例; ：当实验涉及DNA共转时参考3. 效果检测：转染完成后2472小时均可进行siRNA沉默效果检测，最佳检测时间与细胞类型，转染试剂，检测目的等相关。1) RNA水平的检测：mRNA是检测siRNA沉默效率的最佳指标，siRNA转染后2472h即可检测到靶基因mRNA表达明显降低，检测方法宜采用qPCR检测方法。注：引物设计质量很重要；2) 蛋白水平的检测：蛋白是RNAi沉默效率的重要