《果蔬及果蔬汁中橘红2号的测定 高效液相色谱法》 编制说明

1 果 蔬 及 果 蔬 汁 中 橘 红 2 号 的 测 定  高 效 液 相 色 谱法 (送审稿)编 制 说 明吉林省产品质量监督检验院二一三年三月2目  录一、 研究背景、制定标准的必要性和意义 1二、 工作简况 21、前期工作22、实验室间验证工作3三、研究思路与有关国家标准的关系 3四、主要试验的研究论证报告和技术性能分析 31、方法原理 32、前处理条件 43、仪器分析条件 44、方法检出限 55、回收率和精密度 5五、方法验证 61、验证方法 62、验证结论   73、实际样品测定 7六、征求意见情况及重大意见分歧处理结果 8七、实施标准的建议 81一、研究背景、制定标准的必要性和意义橘红 2 号染料为橘红色粉末，不溶于水，溶于芳烃类溶剂。作为染色剂可增加甜橙果实或蔬菜的红色色泽与着色均匀度，提高果实的市场竞争力。但由于其可能的致癌性，橘红 2 号色素在我国并不被允许做为食品添加剂所使用。但是近年来，各地水果市场相继发现“染色橙” 。香港食物环境卫生署抽查 39 个橙类样品，发现 1/3 的样品橙皮中含禁用及可能致癌的橘红 2 号色素。我单位也已经陆续接到群众反应并对经过染色的甜橙果实进行了详细的实验确认和方法研究。对于橘红 2 号色素的含量目前国内还没有制定出标准的检测方法。因此有必要建立果蔬、果蔬汁中橘红 2 号染料的检测方法，填补国内相关方面的检测空白。由于其可能的致癌性，橘红 2 号色素被欧盟和日本等许多国家和地区所禁用。美国食品药物管理局明确规定，水果蜡液的成分必须是对人体无害的，应符合食品添加剂的使用规定，凡经蜡液处理的果品必须在食品标签中明确标明成分；同时，规定经合适溶剂溶解后的柑桔红 2 号色素，仅限于不打算加工的早熟甜橙果皮增色，而且使用后果实表皮不得残留挥发性溶剂，全果中柑桔红 2 号色素最大残留量不得超过 2 mg/L（百万分之二） 。目前，该色素也仅允许在美国佛罗里达州和得克萨斯州使用，而美国加州、欧盟和日本等则禁用此类色素。我国国家标准 GB 2760-2011食品添加剂使用标准中未规定柑橘红 2 号染料能够用于柑橘类水果的增色，即为不得使用。食品监管必须有据可依，无论是监管部门还是消费者都不能单从外表鉴别果蔬或果蔬汁是否为人为添加染色剂，只有经过有资质的检验部门检验后方可确定。但目前国内还没有制定出柑橘红 2 号检测方法的相关标准，因此有必要尽快建立相应的标准方法以规范市场，保障国内的食品安全。本标准起草人参考国内外学术研究的方法，查阅了相关最新资料和文献，结合我国国情和国内实验室的特点，与起草单位的专家多次试验，起草了本标准果蔬及果蔬汁中橘红2号的测定 高效液相色谱法。2二、工作简况任务来源：吉林省卫生厅任务编号： DBS22/0XX-2012起草单位：吉林省产品质量监督检验院起草人基本情况：姓名 性别 年龄 职称 工作分工郎乐 男 32 工程师 项目负责人，文本编写、实验方案设 计邴炜 女 43 研究员 技术顾问华蕾 女 44 研究员 技术顾问张庆波 男 35 工程师 验证方案设计及验证王庆峰 男 32 工程师 验证方案设计及验证刘斌 男 30 高级工程师 验证方案设计及验证李宁 男 31 工程师 验证方案设计及验证刘桂华 女 30 工程师 定性确认石金娥 女 32 高级工程师 资料收集、查新李滢倩 女 33 工程师 资料收集、查新1、前期工作针对果汁和果蔬中橘红 2 号染料的检测，本标准起草人查阅了最新的相关资料和文献，结合我国国情和国内实验室的特点，建立了一个灵敏度高、选择性好、能为我国大多数的检测机构所使用的方法，填补了国内标准的一项空白。同时对确定的检测方法进行检出限、回收率、精密度等试验。收集的标准及相关文献如下：1 GB/T 603化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备2 GB/T 5009.1食品卫生标准检验方法理化部分 总则33 GB/T 19681-2005 食品中苏丹红染料的检测方法-高效液相色谱法4 GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法  5 高效液相色谱法测定果汁和果蔬中柑橘红2号染料理化检验(化学分册) 2011年05期2、实验室间验证工作2013 年 3 月，我们邀请 5 家检测机构进行了实验室间的验证工作。通过统计分析各个实验室的检测数据，验证了方法的准确度和精密度、方法检出限等。参加验证的实验室一致认为：该方法适用于测定果汁和果蔬中柑橘红 2 号染料的含量，具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等特点。三、研究思路与现有国家标准的关系本标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，尽可能与国际通行标准接轨，注重标准的可操作性，严格按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则  第1部分：标准的结构和编写和GB/T 20001.4-2001标准编写规则 第4部分：化学分析方法的要求编写。由于橘红2号与苏丹红1号染料的分子结构较为相似（如图1） ，因此课题组在标准的编制过程中参考了国家标准GB/T 19681-2005食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法中样品的提取部分，并通过实验根据样品基质的不同对提取的方法进行了针对性的调整，在保证橘红2号回收率的同时，最大程度的减少样品基质的干扰。橘红2号           图 1 柑橘红2号与苏丹红1号及2号染料分子结构式4四、主要试验的研究论证报告和技术性能分析1、方法原理根据橘红2号不溶于水，易溶于芳烃类溶剂的特点，样品用丙酮-正己烷（1+3）混合溶剂提取并蒸发至干。用甲酸-乙腈（0.5+99.5）溶液(经正己烷饱和)溶解残渣，正己烷脱脂。在液相色谱C18反相柱上进行分离，在波长510 nm处检测，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量。2、前处理条件2.1 提取溶剂的选择：橘红2号与苏丹红1号染料的分子结构较为相似。由于果汁、果蔬中水分、水溶性物质较多，且橘红2号具有不溶于水的性质，参考国家标准GB/T 19681-2005食品中苏丹红染料的检测方法 ，采用丙酮-正己烷(1+3)混合溶剂提取，再经液-液萃取与水相分离，能很好地去除水溶性杂质并把样品中柑橘红2号提取出来，试验选择丙酮-正己烷(1+3)混合溶剂作为提取溶剂，液-液萃取方法提取样品中柑橘红2号。2.2净化条件的选择：由于用丙酮-正己烷(1+3)混合溶剂提取样品时，会同时提取出一些类脂物，为达到较好的净化效果，试验用甲酸-乙腈正己烷饱和溶液溶解残渣后，加入正己烷，采用甲酸-乙腈(0.5+99.5)溶液与正己烷液-液分配脱脂，试验结果表明，柑橘红2号的回收率理想，能较好地达到净化油脂的目的。3、仪器分析条件3.1 色谱柱的选择橘红 2 号具有不溶于水，易溶于芳烃类有机溶剂的特点，适用于反相液相色谱分析。标准中选用 Zorbax SB-C18 3.5 m 4.6 mm150 mm 的色谱柱，取得较好的分析效果。实际工作中可采用通用的液相色谱用 C18 反相柱进行分离。3.2 紫外吸收波长的选择在色谱条件下对橘红2号标准溶液进行测定，结果表明，橘红2号在510 nm附近吸收最大，故标准中选择510 nm作为检测波长。53.3 色谱条件的优化橘红2号的化学结构与苏丹红1号较为相似，在C18柱上都有较强的保留。实验中采用乙腈与水以体积比90比10作为混合流动相，取得较好的分析效果。经空白样品与空白加标样品分析结果对比表明，在橘红2号的出峰时间附近无明显干扰峰。4、方法检出限根据 GB/T 5009.1-2003食品卫生检验方法 理化部分 总则中 A.2 色谱法中的计算方法：检出限=S/bb标准曲线回归方程中的斜率。S仪器噪声的 3 倍。确认方法检出限为 0.1 mg/kg。5、回收率和精密度根据GB/T 5009.1-2003，我们选用2个空白样品，分别加入三个水平的橘红2号标准溶液，按照送审稿的样品处理方法及相同的色谱条件下，进行回收率的测定，每个样品重复6次，计算出每个添加水平的回收率和相应的相对标准偏差（RSD）值。方法回收率结果见表1，精密度见表2。表1 不同添加浓度平均回收率（n=6）样品名称 添加浓度（mg/kg） 回收率范围/(%) 平均回收率/(%)0.30 90.0-103.3 95.61.00 90.0-101.0 95.7橙汁饮料5.00 94.4-96.8 96.00.30 83.3-90.0 87.21.00 92.0-98.0 94.7果蔬汁5.00 94.8-97.0 95.7表 2  吉林省产品质量监督检验院实验室内精密度实测值/（mg/kg）样品名称添加浓度/（mg/kg） 1 2 3 4 5 6平均测定浓度/（mg/kg）标准偏差相对标准偏差/(%)0.30 0.31 0.29 0.27 0.28 0.29 0.28 0.29 0.014 4.771.00 0.96 0.98 0.95 0.94 1.01 0.90 0.96 0.037 3.89橙汁饮料5.00 4.75 4.72 4.83 4.81 4.84 4.84 4.80 0.051 1.0760.30 0.27 0.26 0.26 0.25 0.27 0.26 0.26 0.008 2.881.00 0.95 0.96 0.93 0.92 0.94 0.98 0.95 0.022 2.28果蔬汁5.00 4.85 4.74 4.77 4.75 4.77 4.83 4.79 0.045 0.93五、方法验证1、验证方法由我院统一制备果汁和果蔬汁样品，同时发送到 3 个参加方法验证的实验室进行验证，每个实验均对每个样品测定 6 次，结果见下表。表3 检测机构1实验室内橘红2号的精密度实测值/（mg/kg）样品名称添加浓度/（mg/kg）1 2 3 4 5 6平均测定浓度/（mg/kg）平均回收率/(%)标准偏差相对标准偏差/(%)0.30 0.29 0.31 0.33 0.29 0.28 0.28 0.30 98.9 0.0197 6.631.00 1.06 0.93 0.92 0.92 0.98 0.96 0.96 96.2 0.0538 5.60果汁5.00 4.95 4.89 4.89 5.1 4.95 4.95 4.96 99.1 0.0769 1.550.30 0.31 0.29 0.26 0.27 0.28 0.28 0.28 93.9 0.0172 6.121.00 0.89 0.86 1.02 0.92 0.96 0.90 0.93 92.5 0.057 6.18果蔬汁5.00 4.86 4.95 5.06 4.96 4.89 4.88 4.83 96.6 0.0770 1.59表4 检测机构2实验室内橘红2号的精密度实测值（mg/kg）样品名称添加浓度/（mg/kg）1 2 3 4 5 6平均测定浓度/（mg/kg）平均回收率/(%)标准偏差相对标准偏差/(%)0.30 0.33 0.29 0.32 0.30 0.32 0.29 0.31 102.8 0.017 5.591.00 0.95 0.98 0.92 0.97 0.95 0.87 0.94 94.0 0.040 4.26果汁5.00 5.09 4.90 4.89 4.95 4.93 4.86 4.94 98.7 0.081 1.6570.30 0.29 0.32 0.31 0.32 0.28 0.29 0.30 100.6 0.017 5.711.00 0.97 0.94 0.95 0.92 1.06 0.96 0.97 96.7 0.049 5.05果蔬汁5.00 4.94 4.87 4.87 4.96 4.87 5.07 4.93 98.6 0.079 1.61表5 检测机构3实验室内橘红2号的精密度实测值/（mg/kg）样品名称添加浓度/（mg/kg）1 2 3 4 5 6平均测定浓度/（mg/kg）平均回收率/(%)标准偏差相对标准偏差/(%)0.30 0.29 0.32 0.28 0.28 0.29 0.28 0.29 96.7 0.015 5.341.00 0.97 0.94 0.91 0.89 1.08 0.92 0.95 95.2 0.069 7.20果汁5.00 4.97 4.86 4.87 4.90 4.86 5.12 4.93 98.6 0.102 2.070.30 0.32 0.29 0.29 0.31 0.28 0.27 0.29 97.8 0.019 6.351.00 0.88 0.93 0.90 0.94 0.86 0.89 0.91 91.4 0.030 3.32果蔬汁5.00 4.94 4.92 4.86 4.88 4.83 4.86 4.89 97.7 0.044 0.912、验证结论经实验验证：检测方法在精密度、准确度、检出限等方面完全达到了测定果蔬及果蔬汁中橘红 2 号的要求，其方法方便、快捷，应广泛应用。3、实际样品测定表6 实际样品测定数据汇总表序号 橘红2号/(mg/kg)1 -2 -3 -4 -5 -86 -7 -8 -9 -10 -11 -12 -注： “”为未检出六、征求意见情况及重大意见分歧处理结果1、征求意见情况本标准征求吉林省出入境检验检疫局、长春市产品质量监督检验院、吉林省农科院、中科院长春应用化学研究所等单位专家意见后，将结果汇总，共征求意见5个单位，返回5个单位，共征求意见17条，采纳15条，不采纳2条。2、重大意见