《食品安全地方标准 植物源性食品中α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱-质谱质谱法》 编制说明

食品安全地方标准植物源性食品中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱-质谱/质谱法编 制 说 明（送审稿）吉林省农业科学院二一二年十一月目  录一、 研究背景 2二、 任务来源 2三、 制定本标准的必要性和意义 2四、 标准制定的主要过程 3五、 制定标准的原则和依据 4六、 标准主要条款的说明 41、标准的名称 42、标准的范围43、方法原理54、前处理条件55、仪器分析条件66、检出限 97、线性范围 108、准确度、精密度 11七、标准验证情况说明13八、验证结论13九、本标准作为强制性地方标准的建议13十、贯彻标准要求和措施建议14十一、参考文献  141一、 研究背景玉米赤霉烯酮类毒素及其代谢产物具有雌激素类物质的生物活性，食品中的该物质通过食用逐渐在人体内蓄积，造成人体性激素机能紊乱及影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，可能致癌。尤其是对女婴的危害更为严重，易造成性早熟。随着研究的深入，人们已经认识到只进行玉米赤霉烯酮是不够的，同时对食品中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮等毒素进行定量检测，才能正确评价其污染程度及潜在风险。目前国内各科研机构正积极开展农产品安全生产、检测、监督管理和风险评估的研究，其中食品中玉米赤霉烯酮及其次生代谢物的测定是重要的研究内容之一。二、 任务来源任务来源：吉林省卫生厅任务编号：DBS22/032 - 2012归口单位：吉林省农业委员会起草单位：吉林省农业科学院三、 制定本标准的必要性和意义玉米赤霉烯酮的检测技术相对已经成熟，其中高效液相色谱法使用最为广泛，目前国家标准使用的全部为高效液相色谱法，但是该方法有一个弊端，就是定性能力较差，检测中往往造成假阳性，且灵敏度不高。而液相色谱-质谱/质谱法则可很好的解决这两个问题。同时玉米赤霉醇是玉米赤霉烯酮的主要代谢产物，同样具有类雌激素作用，若玉米赤霉烯酮或玉米赤霉烯醇，两个指标中，有一项明显偏高，则致病的几率则大大增加。目前对玉米赤霉醇检测标准仅有用于动物源性食品检测的，而植源性食品中没有检测方法。在此情况下，我们提出植物源性食品中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱-质谱/质谱法地方标准的制订，是非常具有前瞻性及先进性的，可以弥补监管机构和质检机构对植物源性食品中玉米赤霉醇检测无标准可依的现状，使检测方法统一化、规范化、标准化。四、 标准制定的主要过程1、前期工作（一）调查研究阶段：2012 年 1 月2012 年 6 月该标准立项后，标准起草小组立即着手进行有关 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮分析方面的省内外调研及国家标准、行业标准、国际标准和国外先进标准查新工作，同时咨询了国内相关专家的意见和建议。在大量收集、整理和分析国内外在该研究领域的有关技术资料，并按制定标准的要求进行分类整理的基础上，明确了标准制定的技术路线。（二）起草阶段：2012 年 7 月2012 年 11 月标准起草小组按照计划任务书的要求，结合专家咨询意见建议以及其它制定标准的要求，研究建立标准方法的实验方案，并进行条件试验。起草人员认真查阅了标准制定的有关文件，通过参加标准宣贯培训，对标准的格式、内容、术语表达方式等进行了深入学习，严格遵循GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写和GB/T 20001.4-2001 标准编写规则 第 4 部分:化学分析方法给出的规则起草了植物源性食品中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱-质谱 /质谱法 。起草小组成员对标准的草案进行了多次修改，形成了征求意见稿。向吉林省食品药品检验所等 10 个检测机构发出了征求意见稿，有 6 个机构提出了修改意见，征求专家意见汇总处理表见附件 1。（三）实验室间的验证工作：2012 年 11 月2012 年 11 月，我们选定了吉林省产品质量监督检验院等省内三家权威的检测机构进行了实验室间的比对验证工作。通过统计分析各个实验室的检测数据，验证了方法的准确度和精密度、检出限等。参加验证的实验室一致认为：该方法适用于测定植物源性食品中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的含量，具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等特点。验证报告见附件 2。五、 制定标准的原则和依据本标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性” 的原则，尽可能与国际通行标准接轨，注重标准的可操作性，严格按照 GB/T 1.1-2009标准化工作导则  第 1 部分：标准的结构和编写规则和 GB/T 20001.4-2001标准编写规则 第 4 部分：化学分析方法的要求进行编写。六、 标准主要条款的说明1、 标准的名称植物源性食品中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的测定 液相色谱-质谱/质谱法2、 标准的范围本标准规定了植物源性食品中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的液相色谱-质谱 /质谱测定方法。适用于成品粮及其加工制品（面粉、淀粉等） 、食用植物油脂及其加工制品等中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮的测定。3、 方法原理试料中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮经三氯甲烷提取，采用碱性水溶液萃取并调至中性后，再经二氯甲烷萃取后，使用液相色谱-质谱/质谱仪测定，外标法定量。4、前处理条件4.1 提取称取试料 10 g（精确至 0.01 g）于 100 mL 具塞锥形瓶中。固体样品加入 50 mL 三氯甲烷（4.1） ，植物油脂样品加入 35 mL 三氯甲烷（4.1） ，盖紧塞子，于振荡提取器上（5.5）振荡提取 30 min。4.2 净化使用中速滤纸过滤提取液（7.1）并用三氯甲烷定容至 50 mL(V1)。吸取25.0 mL 提取液(V2)至 125 mL 分液漏斗（5.7 ）中，加入 5 mL 饱和氯化钠溶液（4.10） ，混匀，再加入 25 mL 2%氢氧化钠（4.11）溶液，剧烈振荡 1 min，静置分层，弃去三氯甲烷层。再用 25 mL 三氯甲烷重复萃取一次，弃去三氯甲烷层。加入 25 mL 柠檬酸溶液（4.12） ，混匀。再加入 25 mL 二氯甲烷（4.2） ，剧烈振荡 1 min，静置分层。将二氯甲烷层溶液通过装有 5 g 无水硫酸钠（4.3）的漏斗。再用 25 mL 二氯甲烷重复萃取一次，操作同上。另用 5 mL 二氯甲烷冲洗无水硫酸钠，合并二氯甲烷萃取液至浓缩瓶中，40 以下于旋转蒸发仪上浓缩至近干。残留物用 5 mL 二氯甲烷溶解并转移至玻璃离心管中，于 40 以下用微弱氮气吹干，残留物用 1.0 ml 乙腈-水溶液（4.12）溶解，于漩涡混合器上（5.6）漩涡混匀后，过 0.22 m有机滤膜（4.18） ，供仪器测定。4.3 前处理条件的确定4.3.1 提取溶剂的选择比较了三氯甲烷、乙腈、无水乙醚三种提取溶剂的提取效果。其中三氯甲烷和乙醚提取效率较高，考虑到乙醚挥发性高，操作过程中不易控制，因此我们选择了三氯甲烷作为提取溶剂。4.3.2 提取时间的选择比较了10min、20min、30min、60min的提取效果，结果发现随着提取时间的增加，提取效率不断提高，30min 以后提取效率达到最高，以后不再增加，因此确定30min作为提取时间。4.3.3萃取溶剂的选择-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮在弱碱性水溶液中的溶解性高于有机溶剂，因此选择氢氧化钠作为第一次萃取的溶液，以除去脂类和色素等脂溶性的杂质。对0.5%、1%、2% 和3%四种浓度的氢氧化钠的萃取效率进行了比较，发现氢氧化钠的浓度为2%时较为合适。5 仪器参考条件5.1 色谱参考条件a） 色谱柱：C18 色谱柱，100 mm2.1 mm，粒径 1.8 m；b） 柱温：40 ；c） 流动相、流速及洗脱梯度：流速 0.3 mL/min；洗脱梯度见表 1；d） 进样量：30 L。表 1 流动相、流速及洗脱梯度时间/min 流速/ （mL/min） A 相：水/% B 相：乙腈/%0.0 0.3 50 505.0 0.3 25 755.1 0.3 0 10010.1 0.3 0 10010.2 0.3 100 018.1 0.3 100 05.2 色谱参考条件的确定5.2.1流动相的选择比较了甲醇和水、乙腈和水作为流动相的洗脱效果，发现两者相当。但是甲醇和水用作流动相时系统压力较高，因此选择了乙腈和水系统作为流动相。5.2.2洗脱方式的选择对于-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮，采用50%乙腈等度系统和梯度洗脱时分离效果相当，等度洗脱时分析时间较长，同时梯度洗脱可有效除去极性较弱的杂质，因此选择了梯度洗脱的方式。5.2.3色谱柱的选择比较了50mm、100mm和150mm三种不同规格的窄径C18 色谱柱，发现100mm分离效果较好，且分析较短，4min 中之内 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮便可得到良好的分离，因此选择了100 mm2.1 mm（粒径1.8 m）的C18色谱柱作为分析柱。5.3质谱参考条件a）电离方式：电喷雾电离；b）扫描方式：负离子扫描；c）检测方式：多反应监测（MRM）；d）离子源温度：350 ；e）干燥气流量：10 L/min；f）监测离子、去簇电压及碰撞能量：见表 2。表 2 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮监测离子、去簇电压及碰撞能量化合物名称 监测离子 去簇电压 碰撞能量-玉米赤霉烯醇 319/275a；319/160 -160 -15；-30玉米赤霉烯酮 317/175a；317/131 -150 -25；-25a 定量离子5.4 质谱参考条件的确定对扫描方式、离子源温度和干燥气温度等进行了优化，确定出最佳的质谱条件。对-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮去簇电压、碰撞能量等进行了优化，同时参考相关标准和文献筛选出最佳的定性和定量离子对。5.5 标准溶液、玉米空白样品、玉米加标样品多反应监测（MRM）色谱图按照确定的前处理方法和仪器参考条件对标准溶液、玉米空白样品、玉米、大豆、淀粉、花生、小麦面粉、大米、芝麻油、玉米油及大豆油等样品的空白加标进行测定，多反应监测（MRM）色谱图见图1图11。2x1000.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95- TIC MRM (* -> *) 0.5-1.d23.55912.330Counts (%) vs. Acquisition Time (min)0.511.522.533.544.555.566.577.588.599.510 4x1000.20.40.60.811.21.41.61.822.22.42.62.833.23.43.63.844.24.44.64.855.2- TIC MRM (* -> *) CK02.dCounts (%) vs. Acquisition Time (min)0.511.522.533.544.555.566.577.588.599.510图 1 0.5 ng/mL 标准溶液 MRM 色谱图          图 2 空白玉米样品 MRM 色谱图2x1000.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95- TIC MRM (* -> *) T-1.dCounts (%) vs. Acquisition Time (min)0.511.522.533.544.555.566.577.588.599.510  2x1000.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95- TIC MRM (* -> *) dadou.dCounts (%) vs. Acquisition Time (min)0.511.522.533.544.555.566.577.588.599.510图 3 空白玉米样品加标 MRM 色谱图           图 4 空白大豆样品加标 MRM 色谱图2x1000.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95- TIC MRM (* -> *) dianfen.dCounts (%) vs. Acquisition Time (min)0.511.522.533.544.555.566.577.588.599.510  2x1000.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95- TIC MRM (* -> *) huasheng.dCounts (%) vs. Acquisition Time (min)0.511.522.533.544.555.566.577.588.599.510图 5 空白淀粉样品加标 MRM 色谱图             图 6 空白花生样品加标 MRM 色谱图   2x1000.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95- TIC MRM (* -> *) mianfen.dCounts (%) vs. Acquisition Time (min)0.511.522.533.544.555.566.577.588.599.510  2x1000.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95- TIC MRM (* -> *) shuidao.dCounts (%) vs. Acquisition Time (min)0.511.522.533.544.555.566.577.588.599.510图 7 空白小麦面粉样品加标 MRM 色谱图       图 8 空白大米样品加标 MRM 色谱图2x1000.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95- TIC MRM (* -> *) zhimayou.dCounts (%) vs. Acquisition Time (min)0.511.522.533.544.555.566.577.588.599.5102x1000.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95- TIC MRM (* -> *) yumiyou.dCounts (%) vs. Acquisition Time (min)0.511.522.533.544.555.566.577.588.599.510图9 空白芝麻油样品加标MRM色谱图          图10 空白玉米油样品加标MRM色谱图2x1000.050.10.150.20.250.30.350.40.450.50.550.60.650.70.750.80.850.90.95- TIC MRM (* -> *) dadouyou.dCounts (%) vs. Acquisition Time (min)0.511.522.533.544.555.566.577.588.599.510图11 空白大豆油样品加标MRM色谱图6、 检出限和定量限以信噪比为3时计算方法的检出限。以样品取样量为10 g，确定- 玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮检出限分别为0.002 mg/kg和0.001 mg/kg以信噪比为10时计算方法的定量限限。以样品取样量为10 g，确定- 玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮定量限分别为0.006 mg/kg和0.003 mg/kg7、 线性范围配制了 0.200 ng/mL、0.500 ng/mL、1.00 ng/mL、5.00 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、 50.0 ng/mL、100 ng/mL 等不同浓度系列 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮标准溶液上机测定，结果发现 0.200 ng/mL20.0 ng/mL-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮线性良好。线性曲线见图 6 和图 7。zearalenol - 6 Levels, 6 Levels Used, 6 Points, 6 Points Used, 0 QCsConcentration (ng/ml)-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21Responses3x10-0.200.20.40.60.811.21.41.61.822.22.42.62.833.23.43.6y = 183.7228 * x  - 11.0376R2 = 0.99906274图 6 -玉米赤霉烯醇线性曲线图zearalenone - 6 Levels, 6 Levels Used, 6 Points, 6 Points Used, 0 QCsConcentration (ng/ml)-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21Responses3x10-0.500.511.522.533.544.555.566.5y = 337.5867 * x  + 21.2056R2 = 0.99835529图 7 玉米赤霉烯酮线性曲线图8、 回收率、准确度和精密度在玉米、大豆、水稻、花生、玉米淀粉、面粉、大豆油、玉米色拉油、芝麻油等空白样品中加入 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮标准物质，进行回收率与精密度实验。实验室内回收率及重复性测定结果见表 3，实验室间回收率及再现性测定结果见表 4。表 3  不同基质空白样品中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮添加回收率及精密度（n=6）样品名称 被测组分 添加浓度 /(g/kg) 回收率范围/% 相对标准偏差/%6.0 76.496.5 9.0412.0 77.292.3 6.44-玉米赤霉烯醇60.0 75.395.6 8.583.0 76.398.3 9.266.0 82.398.6 6.80玉米玉米赤霉烯酮60.0 84.397.6 5.926.0 79.498.5 8.3612.0 83.297.3 6.04-玉米赤霉烯醇60.0 80.398.9 7.85大豆玉米赤霉烯酮 3.0 78.398.9 8.926.0 85.597.9 5.7660.0 85.998.4 5.526.0 78.496.9 8.0912.0 82.496.3 5.91-玉米赤霉烯醇60.0 81.394.9 6.393.0 77.397.9 8.836.0 84.596.9 5.53水稻玉米赤霉烯酮60.0 84.697.4 5.056.0 74.291.9 8.4412.0 72.491.3 7.89-玉米赤霉烯醇60.0 78.390.9 5.953.0 76.392.9 7.856.0 76.592.4 6.66花生玉米赤霉烯酮60.0 80.691.9 5.316.0 73.292.4 8.5212.0 71.689.3 7.40-玉米赤霉烯醇60.0 73.389.3 7.423.0 72.691.5 8.716.0 72.590.1 7.54玉米淀粉玉米赤霉烯酮60.0 75.691.4 7.366.0 71.290.4 8.4112.0 73.389.5 6.88-玉米赤霉烯醇60.0 72.090.1 7.713.0 72.790.4 7.806.0 74.589.1 6.48面粉玉米赤霉烯酮60.0 73.691.4 7.706.0 70.988.4 8.0612.0 71.389.8 8.44-玉米赤霉烯醇60.0 71.990.4 7.563.0 71.590.3 8.246.0 72.889.9 7.37大豆油玉米赤霉烯酮60.0 72.789.5 7.696.0 71.490.5 8.3712.0 73.391.8 8.04-玉米赤霉烯醇60.0 73.992.6 7.353.0 72.891.3 8.016.0 72.690.1 7.50玉米色拉油玉米赤霉烯酮60.0 73.590.5 7.576.0 70.189.0 8.8912.0 72.190.4 8.22-玉米赤霉烯醇60.0 71.790.4 7.643.0 72.991.6 8.06芝麻油玉米赤霉烯酮 6.0 70.688.1 7.7760.0 72.589.5 7.76表 3  不同基质空白样品中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮添加回收率及精密度（n=6）平均测定回收率/%样品 项目 添加水平 /(g/kg) 吉林省质检院吉林商检长春市质检院 本所平均值/% RSD/%6.0 75.50 89.15 98.33 87.48 87.66 10.70 12 89.58 87.05 79.58 86.22 85.41 4.99 -玉米赤霉烯醇60 89.38 85.89 83.22 86.13 86.16 2.93 3.0 91.33 86.05 79.33 85.88 85.57 5.74 6.0 81.50 90.05 73.83 90.15 81.79 9.58 玉米玉米赤霉烯酮60 91.47 90.68 75.23 91.39 85.79 9.30 6.0 89.83 89.82 81.17 88.48 86.94 4.78 12 93.33 89.72 74.75 88.72 85.93 9.50 -玉米赤霉烯醇60 92.05 88.38 84.88 88.18 88.44 3.31 3.0 81.67 89.48 80.33 86.32 83.83 5.04 6.0 74.33 91.23 73.83 90.57 79.80 12.18 大豆玉米赤霉烯酮60 80.78 92.45 84.95 91.87 86.06 6.55 6.0 90.83 88.72 92.00 86.55 90.52 2.66 12 75.92 89.42 90.67 88.42 85.34 8.03 -玉米赤霉烯醇60 91.22 87.89 94.55 87.60 91.22 3.58 3.0 90.67 86.95 79.67 85.98 85.76 5.33 6.0 82.36 89.83 93.17 89.73 88.45 5.16 大米玉米赤霉烯酮60 86.33 90.3 78.63 90.83 85.09 6.62 6.0 87.00 82.95 71.33 82.38 80.43 8.34 12 80.25 84.68 84.33 84.32 83.09 2.53 -玉米赤霉烯醇60 79.38 83.5 91.30 84.10 84.73 5.84 3.0 95.63 83.78 71.33 82.80 83.58 11.88 6.0 83.50 81.97 73.17 81.95 79.55 5.92 玉米油玉米赤霉烯酮60 79.07 84.13 85.03 84.26 82.74 3.30 七、 方法验证本方法经吉林省产品质量监督检验院、吉林出入境检验检疫局技术中心、长春市产品质量监督检验院等三个实验室的技术人员进行了方法验证试验。八、 验证结论经验证该检测方法在精密度、准确度、检出限等方面完全达到了测定植物源性食品中 -玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮检测要求，其方法方便、快捷，应