高效液相色谱法测定维生素C.doc

.高效液相色谱法测定维生素C的含量【摘要】高效液相色谱法已经成为解决生命科学、医药学发展中各种难题的重要手段，在实验室中也广泛应用于物质的定性定量分析。本实验中利用高效液相色谱法对维生素C进行定量分析，所采用的定量分析方法为外标法，通过做出标准溶液浓度与峰面积的标准曲线进而对样品中的维生素C进行定量检测。【关键词】高效液相色谱法、维生素C、含量1、 引言维生素 C（Vitamin C, Vc）又叫抗坏血酸，是一种水溶性维生素。Vc 在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。人体内缺乏 Vc 时容易导致坏血病。同时，由于 Vc 是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成， 它同时还具有防癌、 预防动脉硬化、 治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效。Vc 在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。 樱桃、 番石榴、 辣椒、 猕猴桃等水果中 Vc 含量在 50-300 mg/100 g。溶于流动相 （mobile phase）中的各组分经过固定相时，由于与固定相（stationary phase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC）。HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、 自动进样器、 预柱或保护柱、 柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。 制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。2、 HPLC测定维生素C的含量2.1、仪器试剂2.1.1、仪器高效液相色谱仪（Agilent1260），色谱柱：C18 柱 (250 mm4.6 mm, I.D.5 m)；平头进样器。2.1.2、试剂乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素 C，磷酸二氢钾等均为分析纯，实验用水为超纯水。Vc 标准溶液：快速准确称取 0.025 g Vc，用 1 mol/L 乙酸溶液溶解，定量转移至250 mL 容量瓶中，用 1 mol/L 乙酸溶液定容，得到 100 mg/L 标准溶液备用，现用现配。2.1.3、色谱条件流动相： 3%的乙腈-0.05 mol/LKH2PO4水溶液 （v/v）； 流速 1 mL/min； 柱温 30，紫外检测波长 265 nm；进样量 10 L。2.2、实验步骤2.2.1、样品处理1、按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。2、样品准备：取 10 片维生素 C 片，研匀。准确称取 0.02g，用 1 mol/L 乙酸溶液溶解，定量转移至 50 mL 容量瓶中，用 1 mol/L 乙酸溶液定容，用 0.45m滤膜过滤。3、标准曲线绘制：分别配制 5，20，50，80，100 mg/L 的 Vc 样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析，平行测定 3 次。以 Vc 色谱峰面积对浓度作图，绘制标准曲线。4、定量分析：供试品溶液经 0.45 m 微孔滤膜过滤后进行 HPLC 分析。平行测定 2 次，记录其 Vc 的色谱峰面积，根据校准曲线计算维生素片中 Vc 的含量。5、实验结束后，按要求清理好仪器。3、数据处理不同Vc 浓度对应色谱峰面积图表浓度mg/L5205080100峰面积mAU*S146.73135592.211431509.601812428.493903050.15918y=30.58x-14.146 R2=1y(sample)=1892.33813代入上式有x=62.34mg/L4、实验结果讨论本实验中所采用的定量分析方法为外标法，即标准校正法。该法直接，易于操作，计算简单。但是标样与测定组分为统一化合物，分离、检测条件的稳定性对定量结果影响较大。除此方法外，常用的定量分析方法还有内标法、峰面积归一化法。至于定性分析，常用的方法为保留值定性，与已知物对照定性，还有安保柳枝经验规律定性。此外还有选择性检测响应定性，色谱-结构分析仪器联用等方法。在分析未知物时，首先要知道这个化合物化学物理常数，然后选择合适的样品处理方法，使样品有较好的萃提回收率和较少的干扰成分存在；而对于分离分析，如果使用紫外检测器，在这之前应先做个化合物的吸收波长扫描，以找出其最大吸收波长，流动相先用纯水和乙腈或甲醇在不同比例时进行调节，保证出峰时无干扰和一定的分离度，然后依据峰形和化合物的pKa值进行水相的pH值调节，以找到最佳的流动相体系。气相色谱仪具有分离选择性好、柱效高、速度快、检测灵敏度高、试样用量少、应用广泛等特点。但气相色谱仪也具有一点局限性，在没有纯标样的条件下，对试样中未知物的定性定量较为困难，往往需要与红外光谱、质谱等结构分析仪器联用，对于飞沸点高、热稳定性差、腐蚀性和反应活性强的物质，气相色谱仪分析比较困难。