专题四课题3：酵母细胞的固定化.ppt.ppt

课题3酵母细胞的固定化 专题4 酶的研究与应用 课题目标 课题重点 难点重点 制备固定化酵母细胞 难点 制备固定化酵母细胞 1 说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理 2 尝试制备固定化酵母细胞 并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵 背景知识 1 酶制剂的概念和种类 一 酶制剂 含有酶的制品 1 定义 2 种类 液体酶制剂 治疗胃病的胃蛋白酶液 固体酶制剂 多酶片 加酶洗衣粉中的蛋白酶和脂肪酶 实例 在屠宰厂 可以从家畜胰脏中提取出胰酶 在水果加工厂 可以从菠萝皮中提取出菠萝蛋白酶 缺点 要有充足的原材料 广泛应用受到限制 2 酶的生产 1 组织提取法 方法 采用一定的技术直接从动植物或微生物的组织 细胞中将酶提取出来 优点 简单易行 在动植物或微生物资源丰富的地区具有应用价值 2 发酵法 方法 通过微生物发酵获得所需要的酶 胞外酶 从发酵液中直接提取 胞内酶 将细胞弄碎再经过提取纯化而得到 易培养 繁殖速度快 便于大规模生产 优点 提取方式 3 化学合成法 缺点 成本高 已知分子结构的酶 方法 通过微生物发酵获得所需要的酶 提取出来的酶还要经过分离 纯化 再加入适量的稳定剂和填充剂 制成相应的酶制剂后才能用于催化化学反应 3 酶的提取和分离纯化 1 酶的提取 盐溶液提取法 碱溶液提取法 有机溶剂提取法 适宜的温度和ph和保护剂 方法 2 酶的分离提纯 沉淀技术 密度梯度离心法 层析技术 条件 课题背景 2 酶制剂的缺点 1 酶通常对强酸 强碱 高温和有机溶剂等条件非常敏感 容易失活 2 溶液中的酶很难回收 不能被再次利用 提高了生产成本 3 反应后会混在产物中 可能影响产品质量 1 酶制剂的优点 催化效率高 低能耗 低污染等 课题背景 3 设想 两项技术 1 设想一 固定化酶技术 固定化酶技术 用物理或化学方法将酶固定在一定空间内的技术 常用方法是将酶固定在不溶于水的载体上 优点 使酶既能与反应物接触 又能与产物分离 同时 固定在载体上的酶还能被反复利用 缺点 一种酶只能催化一种化学反应 而在生产实际中很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能进行 所以操作比较麻烦 实例 用固定化酶技术生产高果糖浆 3 设想 两项技术 2 设想二 固定化细胞技术 固定化细胞技术 用物理或化学方法将细胞固定在一定空间内的技术 在固定化酶技术的基础上 发展出了细胞固定化技术 将细胞固定在不溶于水的载体上反复使用 固定化细胞常用的载体 常用的不溶于水的多孔性载体 优点 可催化一系列化学反应 成本更低 操作更容易 相对于酶的固定化 缺点 固定后的细胞与反应物不容易接近 可能导致反应效果下降 本课题 制备固定化酵母细胞 体会固定化酶的作用 一 基础知识 一 固定化酶及应用实例 1 固定化酶 固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶 具体来说 是指经物理或化学方法处理 使酶变成不易随水流失即运动受到限制 而又能发挥催化作用的酶制剂 2 固定化酶技术生产高果糖浆 1 高果糖浆 是指果糖含量为42 左右的糖浆 作为蔗糖的替代品 不会像蔗糖那样诱发肥胖 糖尿病 龋齿和心血管病 对人类的健康更有益 2 生产原料 葡萄糖 葡萄糖是由淀粉转化而来 是以酶解法催化淀粉所得的糖化液 经葡萄糖异构酶的异构作用 将其中一部分葡萄糖异构成果糖 由葡萄糖和果糖 含量在42 左右 而组成的一种混合糖糖浆 3 生产原理 葡萄糖 果糖 葡萄糖异构酶 这种酶稳定性好 可持续发挥作用 但在溶解于葡萄糖溶液后 无法从糖浆中提取回收 浪费很大 使用固定化酶技术 将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上 再将这些酶颗粒装到一个反应柱内 柱子底端装上分布着许多小孔的筛板 酶颗粒无法通过筛板上的小孔 而反应液却可以自由出入 生产过程中 将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入 使葡萄糖溶液流过反应柱 与固定化葡萄糖异构酶接触转化成果糖 从反应柱的下端流出 4 生产过程 3 生产优点 反应柱能连续使用半年 大大降低了生产成本 提高了果糖的产量和质量 目前用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆的规模已经超过了每年1000万吨 二 固定化细胞技术 利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间的技术 1 固定化酶和固定化细胞技术 2 酶和细胞固定化方法 1 物理吸附法 方法 将酶吸附到固体吸附剂表面的方法 固体吸附剂 多为活性碳 多孔玻璃等 2 包埋法 方法 将酶包裹在多孔的载体中 包埋成格子型或包埋成微胶囊型 载体 明胶 琼脂糖 海藻酸钠 醋酸纤维素和聚丙烯酰胺 种类 凝胶包埋法 将个别酶分子包在高聚物格子中 可以将块状聚合形成的凝胶切成小块 也可以直接包埋在珠状聚合物中 这样作可以使固定化酶机械强度提高10倍 并改进酶脱落的情况 微囊化法 将酶溶液或悬浮液包裹在膜内 膜既可以使酶存在于类似细胞内的环境中 又阻止酶的脱落或直接与微囊外环境接触 小分子底物能迅速通过膜与酶作用 产物也能扩散出来 交联法 通过双功能试剂 将酶和酶联结成网状结构的方法 3 化学结合法 将酶分子相互结合 或将其结合到纤维素 琼脂糖 离子交换树脂等载体上的固定方式 种类 共价结合法 酶和载体以共价键的形式结合在一起的方法 这种方法需要酶和载体都具有氨基 羧基或羟基等官能团 方法 包埋法 化学结合法 物理吸附法 3 酶和细胞固定方法的选择 酶适合采用化学结合和物理吸附法固定 细胞适合采用包埋法固定 1 酶和细胞固定方法的选择 2 原因 细胞个大 个体大的细胞难以被吸附或结 合酶分子很小而个小的酶容易从包埋的材料中漏出 类型 优点 不足 直接使用酶 催化效率高 低耗能 低污染等 对环境条件非常敏感 容易失活 溶液中的酶很难回收 不能被再次利用 提高了生产成本 反应后酶会混在产物中 可能影响产品质量 固定化酶 酶既能与反应物接触 又能与产物分离 同时 固定在载体上的酶还可以被反复利用 一种酶只能催化一种化学反应 而在生产实践中 很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的 固定化细胞 成本低 操作容易 对酶活性的影响更小 可以催化一系列的反应 容易回收 固定后的酶或细胞与反应物不容易接近 可能导致反应效果下降由于大分子物质难以自由通过细胞膜 因此固定化细胞的应用也受到限制 三 酶制剂 固定化酶和固定化细胞催化的对比 思考 1 从操作角度来考虑 你认为哪一种方法更容易 固定化细胞更容易2 哪一种方法对酶活性影响最小 物理吸附法和化学结合法影响最小 酶与反应物能充分接触 3 固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶 是所固定的细胞能产生的一系列酶4 如果想把微生物发酵过程变成连续的酶促反应 应该选择哪中方法 固定化细胞技术5 如果反应物是大分子物质 又应该采用哪种方法 固定化酶技术 因为大分子物质难以通过细胞膜 本课题使用包埋法来固定细胞 即将微生物细胞均匀的包埋在不溶于水的多孔性载体中 常用的载体有 明胶 琼脂糖 海藻酸钠 醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等 本实验选用海藻酸钠做载体包埋酵母菌 1 酵母细胞的活化 1 过程 称取1g干酵母 放入50ml的小烧杯中 加入蒸馏水10ml 用玻璃棒搅拌 使酵母细胞混合均匀 成糊状 放置1h左右 使其活化 2 注意事项 选用的干酵母要具有较强的活性 而且物种单一 在缺水状态下 微生物处于休眠状态 活化就是让休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态 二 实验操作 一 制备固定化酵母细胞 2 配置物质的量浓度为0 05mol l的cacl2溶液 1 过程 称取无水cacl20 83g 放入200ml的烧杯中 加入150ml的蒸馏水 使其充分溶解 待用 2 注意事项 溶解物质要彻底 勿用自来水溶解 以防自来水中各种离子影响实验结果 3 配制海藻酸钠溶液 1 过程 称取0 7g海藻酸钠 放入50ml小烧杯中 加入10ml水 用酒精灯加热 边加热边搅拌 将海藻酸钠调成糊状 直至完全溶化 用蒸馏水定容至10ml 2 注意事项 加热时要用小火 或者间断加热反复几次 直到海藻酸钠溶化为止 海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量 海藻酸钠浓度过高 将很难形成凝胶珠 浓度过低 形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少 4 海藻酸钠溶液和酵母细胞混合 1 过程 将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温 加入以活化的酵母细胞 进行充分搅拌 再转移至注射器中 2 注意事项 溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温 否则会因温度过高杀死酵母菌 搅拌要彻底充分 使两者混合均匀 以免影响实验结果的观察 5 固定化酵母细胞 1 过程 以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加到配制好的cacl2溶液中 将形成的凝胶珠在cacl2溶液中浸泡30min左右 2 注意事项 可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠 用作对照 海藻酸钠胶体在cacl2这种电解质的作用下 发生聚沉 形成凝胶珠 需稳定30min左右 二 用固定化酵母细胞发酵 1 冲洗 将固定化酵母细胞 凝胶珠 用蒸馏水冲洗2 3次 洗去凝胶珠表面多余的电解质溶液 刚形成的凝胶珠应在cacl2溶液中浸泡一段时间 以便形成稳定的结构 检验凝胶珠的质量是否合格 可以使用下列方法 用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压 如果凝胶珠不容易破裂 没有液体流出 就表明凝胶珠的制作成功 在实验桌上用力摔打凝胶珠 如果凝胶珠很容易弹起 也能表明制备的凝胶珠是成功的 1 过程 2 发酵 150ml10 葡萄糖 固定化酵母细胞 200ml锤形瓶 密封 25 发酵24h 2 注意事项 1 控制好发酵温度 一般是室温25 2 发酵时间可视具体情况而定 一般时间稍长一些 效果明显 3 可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理做对照实验 海藻酸钠在水中溶解的速度较慢 需要通过加热促进其溶解 溶解海藻酸钠 最好采用小火间断加热的方法 例如 加热几分钟后 从石棉网上取下烧杯冷却片刻 并不断搅拌 再将烧杯放回石棉网继续加热 如此重复数次 直至海藻酸钠完全溶化 如果加热太快 海藻酸钠会发生焦糊 三 操作提示 1 观察凝胶珠的颜色和形状 1 如果制作的凝胶珠颜色过浅 呈白色 说明海藻酸钠的浓度偏低 固定的酵母细胞数目较少 2 如形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 则说明海藻酸钠的浓度偏高 制作失败 需要再作尝试 2 观察发酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母细胞发酵产生酒精 可以看到产生了很多气泡 同时会闻到酒味 四 结果分析与评价 如果希望反复使用固定化酵母细胞 就需要避免其他微生物的污染 在工业生产中 细胞的固定化是在严格的无菌条件下进行的 结合专题2的无菌操作技术 想一想如果要求制作反复使用的固定化酵母细胞 应该在实验过程中注意那些问题 1 海藻酸钠溶液 cacl2溶液和各种操作器具灭菌 2 实验过程进行无菌操作 五 课题延伸 结合专题1中的课题1 想一想 是否可以利用固定化细胞发酵制作果酒和果醋 使用固定化细胞能否达到连续生产的目的 有兴趣的同学不妨试一试 可以利用固定化细胞发酵制作果酒和果醋 使用固定化细胞能达到连续生产的目的 六 课题延伸 课后习题 p52 习题1 类型 优点 不足 直接使用酶 催化效率高 低耗能 低污染等 对环境条件非常敏感 容