巨噬细胞在艾滋病痴呆复合征中调控星形细胞CXCL8和CXCL12的研究论文.pdf

上海交通大学 博士学位论文 巨噬细胞在艾滋病 痴呆复合征中调控星形细胞cxcl8和 cxcl12的研究 姓名 郑加麟 申请学位级别 博士 专业 神经病学 指导教师 陈生弟 20080501 巨噬细胞在艾滋病一痴呆复合征中调控星形细胞c x c l 8 禾 i i c x o l l2 的研究 摘要 趋化因子和细胞因子是细胞间的信号传递分子 在协调免疫反 应 免疫系统与神经系统的交流中起着关键的作用 因此 趋化因子 和细胞因子的失调会导致一些中枢神经系统 c n s 的病变 例如人类免 疫缺陷病毒i 型 h i v 1 引起的痴呆 h i v ia s s o c i a t e dd e m e n t i a h a d 也称艾滋病一痴呆复合征 a i d sa s s o c i a t e dd e m e n t i a 而在h a d 中作为主要靶细胞并介导神经元损伤的是h i v i 感染和活化的巨噬细 胞 巨噬细胞是h i v 一1 病毒感染的靶细胞之一 h i v 1 病毒可以在巨 噬细胞中大量复制 感染的巨噬细胞携带h i v i 病毒在体内迁移 使 巨噬细胞成为h i v l 病毒载体和潜在的病毒库 并合成分泌多种细胞 因子和趋化因子 引起细胞过度活化 组织损伤及其他艾滋病并发症 如h a d 白细胞介素8 i n t e r l e u k i n8 i l 8 c x c l 8 c x c r ia n d c x c r 2 的配体 是一个重要的c x c 趋化因子 在h a d 中介导炎症反应 及组织损伤 然而疾病过程中调控c x c l 8 产生的机制至今仍不完全清 楚 此外 基质细胞衍生因子一1 s t r o m a lc e ll d e r i v e df a c t o r1 c x c l l 2 c x c r 4 的配体 是另一个重要的c x c 趋化因子 c x c l l 2 在神经 系统及免疫系统的发育中占有重要地位 已经证实其受体c x c r 4 作为 h i v i 感染的共受体 在h a d 的神经损伤中举足轻重 而关于c x c l l 2 产生的来源及调控机制尚不清楚 在本研究中我们探讨了h a d 中h i v 1 感染并活化的巨噬细胞在调节星形胶质细胞产生c x c l 8 及c x c l l 2 中 的作用及调控机制 我们的研究结果显示h a d 病人脑脊液中c x c l 8 和c x c l l 2 的水平 比没有神经损伤的h i v l 阳性病人要高 免疫激活的或h i v i 感染的 人单核细胞来源的巨噬细胞 m o n o c y t e sd e r i v e dm a c r o p h a g e s m d m 条件培养基 m c m 能够诱导人星形胶质细胞产生c x c l 8 和c x c l l 2 c x c l 8 的产生依赖于病毒感染后巨噬细胞产生的i l 一1 p 和t n f 一仅 p 3 8 e r k l 2 和j n k 拮抗剂能减少m c m 诱导的人星形胶质细胞产生的 c x c l 8 用依赖于双链r n a 的蛋白激酶 p k r 抑 i j f u 处理人星形胶质 细胞则可以完全阻断星形胶质细胞产生的c x c l 8 而c x c l l 2 的生成依 赖于病毒感染 免疫激活后巨噬细胞产生的i l 1b 并可以被i l ib 受体拮抗剂 i l i r a 拮抗 在患有h i v i 脑炎 h i v e 的严重联合 免疫缺陷鼠 s e v e r ec o m b i n e di m m u n o d e f i c i e n t s c i d 中同样发 现了c x c l l 2 的m r n a 水平和蛋白水平的显著增高 该增高同i l 一1b m r n a 表达的增高密切相关 本研究阐明了h a d 病理机制中h i v 1 感染 或免疫活化的巨噬细胞产生的i l 一1 p 和t n f 一仅诱导星形胶质细胞产生 c x c l 8 其中i l 1b 也可以诱导c x c l l 2 的生成 p 3 8 j n k e r k l 2 和p k r 信号通路参与了星形胶质细胞产生c x c l 8 并以此介导h a d 发 生过程中的中枢神经系统的炎症反应 本研究结果能够帮助我们进一 步理解h i v 一1 感染的巨噬细胞的病理变化机制 为如何减少感染巨噬 细胞介导的炎症反应及组织损伤寻找新的靶向分子奠定基础 具有重 要的生物学意义 并同时为h a d 的研究及治疗拓展新的思路 关键词 c x c l 8 c x e l l 2 h i v 一1 相关的痴呆复合征 星形胶质细胞 巨噬细胞 炎症 m 队c r o p h a g e sr e g u l a t ea s t r o c y t ec x c l 8a n d c x c l l 2d i r i n gh i 厂 1a s s o c i a t e dd e m n t i a a b s t r a c t c h e m o k i n e sa n dc y t o k i n e sa r es i g n a l i n gm o l e c u l e sb e t w e e nc e l l st h a t p l a y ac r u c i a lr o l ei nt h ec o o r d i n a t i o no fi m m u n e r e s p o n s e s a n d c o m m u n i c a t i o nb e t w e e nt h ei m m u n es y s t e ma n dt h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m c n s c o n s e q u e n t l y d i s r e g u l a t i o no fc h e m o k i n e sa n dc y t o k i n e sm a y f a c i l i t a t et h ed e v e l o p m e n to fc n sd i s e a s e s s u c ha sh v 1a s s o c i a t e d d e m e n t i a h a d w h i c hi st h ec l i n i c a lc o n s e q u e n c eo fn e u r o n a ld r o p o u t t h ep a t h o l o g i cc o r r e l a t et oh a d h i ve n c e p h a l i t i s h i v e i sc h a r a c t e r i z e d b yh i v 1i n f e c t e da n da c t i v a t e dm a c r o p h a g ea n dm i c r o g l i a a sw e l la s d a m a g ea n dd e a t ho fn e u r o n s a sar e s u ro fh i v 1i n f e c t i o n t h ei m m u n e c e l l sa r er e c r u i t e dt ot h ep r o x i m a t es i t ea n dp r o d u c ea na r r a yo ff a c t o r s i n c l u d i n gc y t o k i n e sa n dc h e m o k i n e sy e ti su n a b l et oc l e a rt h ei n f e c t i o na n d l e a dt ot h ei m p a i r m e n to fn e u r o n a lf u n c t i o n c x c l 8 i n t e r l e u k i n8 i l 8 a n dc x c l1 2 s t r o m a lc e l l d e r i v e df a c t o r1 s d f 一1 a r ec x cc h e m o k i n ea n dm e d i a t ei n f l a m m a t i o ni nh a d c x c l 8 a n dc x c l12a f f e c tc e l l m i g r a t i o n v i r u s m e d i a t e dn e u r o t o x i c i t y a n d n e u r o d e g e n e r a t i o nt h r o u g h t h e i r r e c e p t o r s c x c r l 2a n d c x c r 4 r e s p e c t i v e l y h o w e v e r t h eu n d e r l y i n gm e c h a n i s m sr e g u l a t i n gc x c l 8a n d c x c l12p r o d u c t i o nd u r i n gh a da r ei n c o m p l e t e l yu n d e r s t o o d i nt h i st h e s i s w e i n v e s t i g a t e d t h er o l eo fh i v 1 一i n f e c t e da n di m m u n ec o m p e t e n t m a c r o p h a g e s t h ep r i n c i p a lt a r g e tc e l la n dm e d i a t o ro fn e u r o n a li n j u r yi n h a d i nr e g u l a t i n ga s t r o c y t ec x c l 8a n dc x c l 12p r o d u c t i o n o u rd a t a d e m o n s t r a t e sc x c l 8a n dc x c l12l e v e l si nt h ec e r e b r o s p i n a lf l u i do fh a d p a t i e n t sw e r eh i g h e rt h a nm v 1s e r o p o s i t i v ep a t i e n t sw i t h o u tn e u r o l o g i c a l i m p a i r m e n t i m m u n e a c t i v a t e do rh i v 1 i n f e c t e dh u m a nm o n o c y t e d e r i v e d m a c r o p h a g e m o m c o n d i t i o n e dm e d i a m c m i n d u c e dp r o d u c t i o no f c x c l 8b yh u m a na s t r o c y t e s t h i sc x c l 8p r o d u c t i o nw a sd e p e n d e n to n m d mi l 一1pa n dt n f 一 f o l l o w i n gv i r a la n di m m u n ea c t i v a t i o nw h i l e c x c l12w a sm a i n l yd e p e n d e n to nm d mi l 11 3 t h ec x c l 8p r o d u c t i o n b ym c m w a sr e d u c e db yp 38 j n k o re r k1 2i n h i b i t o r s a n dc o m p l e t e l y b l o c k e db yd s r n a d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e p k r i n h i b i t o r f u r t h e r t h e l a b o r a t o r yo b s e r v m i o n sf o rc x c l 12w e r ec o n f i r m e di ns e v e r ec o m b i n e d i m m u n o d e f i c i e n t s c i d m i c ew i t hh i v 1e n c e p h a l i t i s r a v e i nt h e s e h i v em i c e r e a c t i v ea s t r o c y t e ss h o w e das i g n i f i c a n ti n c r e a s ei nc x c l12 e x p r e s s i o n a s o b s e r v e d b yi m m u n o c y t o c h e m i c a ls t a i n i n g s i m i l a r l y c x c l12m r n al e v e l sw e r ei n c r e a s e di nt h e e n c e p h a l i t i cr e g i o n a s m e a s u r e d b y r e a lt i m er t p c r a n dc o r r e l a t e dw i t hi l 一1pm r n a e x p r e s s i o n t h e s eo b s e r v a t i o n sp r o v i d ed i r e c te v i d e n c et h a ti l 一11 3 a n d o r n 师一仪 p r o d u c e d f r o mh i v 1 一i n f e c t e da n d o ri m m u n e c o m p e t e n t m a c r o p h a g e s i n d u c e sp r o d u c t i o no f c x c l 8a n dc x c l12b ya s t r o c y t e sa n d a ss u c hc o n t r i b u t et o o n g o i n gc x c l 8a n dc x c l 12m e d i a t e dc n s i n f l a m m a t i o nd u r i n gh a d k e yw o r d s c x c l 8 c x c l12 a s t r o c y t e m a c r o p h a g e i n f l a m m a t i o n h i v 1a s s o c i a t e dd e m e n t i a h a d c x c l 8 c x c l l 2 m d m m c m p k r h i v e s c i d 儿 1 r a t n f o l i l 1 1 3 p b m c 皿 h i v 1 m c s f m o i g f a p l 气p 2 c s f l p s 队p k e r k 胍 符号说明 h i va s s o c i a t e dd e m e n t i a i n t e r l e u k i n8 s d f 10 m o n o c y t e d e r i v e dm a c r o p h a g e m a c r o p h a g e c o n d i t i o n e dm e d i a p r o t e i nk i n a s er h i v e n c e p h a l i t i s s e v e r ec o m b i n e di m m u n o d e f i c i e n c y i n t e r l e u k i n1r e c e p t o ra n t a g o n i s t t u m e rn e c r o s i sf a c t o r 9 8 1 2 3 4 卜1 病毒反转录酶活性的检测 r ta s s a y 取h i v 1 感染的细胞培养上清 做反转录酶活性分析 用9 6 孑l u 底板 每孑l 2 1 1 0 塾己样品 1 0 0 箨l 反应混合液 每个样品为3 复孔 反应混合液包括0 0 5 酶n p 4 0 n o n i d e tp 4 0 1 0ug m l 多聚腺嘌呤 p o l ya 0 2 5ug m lo l i g o d t 5m m d t t 1 5 0 谴k c l 1 5m mm g c l 2 以及 朝 l i 狰溶解于t r i s h c l 缓冲液 p h7 在3 7 c 孵育2 4h 6 采用i t i i 型多头细胞样品收集器 将每孔中的培养液分别收集 于玻璃纤维膜上 5 6 烘烤2h 使其干燥 然舞将每孔纲胞收集膜分别放入一个 闪烁测定瓶中 加入5m l 闪烁液 p p o4 0g p o p o p0 2g 无水乙醇2 0 0m l 二 晕苯8 0 0m l 现用现配 室溢放置3h 采用f l 2 1 0 1 双道液体闪烁计数器 测定 每分钟脉冲数 c p m 结果用刺激指数s i 表示 s i 试验管一空白管 对照管 一空自管 1 2 3 5r n a 提取及t a q m a n 实时r t p c r 总r n a 用t r l z o l 试剂 i n v i t r o g e n a n dr n e a s ym i n ik i t q i a g e ni n c v a l e n c i a 娃 提取 入c x c l ba s s a y s o n d e m a n dp r i m e r s i d 羲h s 0 0 1 7 4 1 0 3 m 1 和人g a p d h g 1 y c e r a l d e h y d e 一3 一p h o s p h a t od e h y d r o g e n a s e 磷酸甘油醛脱氢酶 管 家基因对照 i d 4 3 1 0 8 8 4 e 购逸a p p l i e db i o s y s t e m si n c f o s t e rc i t y c a 实时r t p c r 应用o n e s t e pq u a n t i t a t i v et a q m a n 实时r t p c r 系统 a p p l i e d b i o s y s t e m si n c 通过c o m p a r a t i v ea a c t 方法 参照g a p d h 内标对照对c x c l 8 m r n a 水平进行定量 本实验所用到的引物都经过扩增效率测试 结果类似 1 2 3 6e l i s a 检测i 卜1 p t n f 咆和c x o l 8 5 细胞培养液或c s f 中的i l i p t n f 和c x c l 8 是通过e l i s a 来鉴定的 9 6 孑l 培养板 经室溢辫育过夜分别包被i l i 多 t 疆飞或c x c l 8 r d s y s t e m s m i n n e a p o l i s 默 特异 性的单克隆抗体 再用i b s a 溶于p b s 孵育2 小时以阻断非特异性的结合位点的结 合 漂洗之后予每个板中加入一标准系歹l 稀释的人重组i l i 多 聊咆或c x c l 8 r d s y s t e m s 和条件培养基的上清样品 孵育2 小时后漂洗 加入生物素耦联的羊抗 人i l i 多 t n f 一诺或c x c l 8 抗体 r d s y s t e m s 孵育圭小时蜃漂洗 链霉素亲和素耦联 辣根过氧化物酶孵育3 0 分钟 含0 0 5 t w e e n 2 0 的p b s 的彻底清洗后 加入h r p 的t m b 过氧化物酶底物 之后加入5 0 越的圭礁如s 0 终止反应 以9 6 孔酶标仪 m o l e c u l a r d e v i c e s s u n n y v a l e c a 在4 5 0 衄处读取光密度值 与标准值相比较后加以定量 1 2 3 7 数据分析 除特殊说明外 数据均通过分析平均值 标准差 s d 分折 这些数据通过方 差分析 a n o v a 再进行成对观察值的塔基检定 t u k e y t e s t 显著水平设为小于 0 0 5 所有的实验都至少使用3 名献盘者的样品以消除单个献血者的特定差异 所有 实验均已至少重复三次 每个样本设三重复或四重复 1 3 结果 1 3 1h a d 患者脑脊液 o e r e b r o s p i n 8 if i u i d o s f 中o x o l 8 水平升高 c x c l 8 在h i v 1 脑炎中的表达如何被调控尚不清楚 我们用e l i s a 检测了1 5 侧 h a d 患者脑脊液样品中c x c l 8 的含量 并将结果与h i v 血清测试阳性佩无临床神经功 能损伤的供者的样品 样本数 8 结果耀比较 图圭 表圭 h a d 组c s f 中c x c l 8 麓含量 1 3 7 7 2 4 1p g m 1 较h i v 一1 血清测试阳性但无临床神经功能损伤的供者个体c s f 中c x c l 8 魏含量显著增高 6 4 8 2 9 5p g m 王 p 0 0 1 这些数据表唆 h i v 脑炎中c x c l 8 在中枢神经系统中表达升高 c x c l 8 参与炎症过程中自细胞募集 我们 认为c x c l 8 露缝是h a d 麓l 经病理过程的的一个重要的趋化因子 嚣此我们在这一部 分中着重探讨h i v 脑炎中c x c l 8 表达上调的机制 6 表1 所有研究对象的临床特征 t a b l e2 c l i n i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fa l ls t u d ys u b j e c t s a g ee t h n i ci m p a i rc d 4 tw b c l y r e p h s m o n o sc s f c s f v i r a l s u b j e c g r o u p m s k e d c e l l sw b cp r o t el e a 4 t sex cells 主n嚣王p 1 u 1 r n a c o p i e s m i 1 f 6 3 2 m5 2 3 愆3 圭 4 m3 9 5 爆4 0 s f3 2 淹鞠 8 m4 0 9 耀5 2 i 0 m 4 0 l l f5 6 圭2 罐 5 0 1 3 m3 7 1 4 f 3 3 羔5 意4 0 1 6 m3 7 1 7 m5 5 1 8 趣5 5 1 9 m4 4 2 0 m4 8 2 l 艇4 8 2 2 m4 6 2 3 m 4 2 a f 唧蝴o a f o 濉o h i s p0 c a u c0 h i s p0 矗f 一 漤0 c a u co a f a m0 a 叫瀵圭 a f a m1 a f 叫ml 轰f 叫滋圭 h i s p1 a f 叫雌l 矗f a 蘩 圭 a f 叫嗽1 a f 叫wl a f o 澄2 c a u c2 h i s p2 e 杰毯e2 h i s p2 h i s p3 n o n o n o n o n o n o n o n o y e s y e s y e s y e s y e s y e s y e s y e s y e s y e s y e s y e s y e s y e s y e s 4 4 2 9 5 1 2 0 4 1 8 8 5 5 6 1 8 8 3 0 3 4 1 4 0 1 5 5 2 0 8 2 l 1 8 7 1 2 2 8 4 9 1 4 7 2 1 6 9 5 3 6 3 7 1 8 4 3 3 4 3 5 王 4 8 3 1 3 8 2 6 5 2 圭 7 5 5 4 2 2 2 3 2 1 7 2 1 2 3 9 7 1 4 2 2 3 5 6 4 8 2 1 2 5 3 董5 8 3 0 5 2 4 6 4 3 2 5 3 3 1 4 2 72 8 9 9 13 7 9 3 32 2 9 3 52 1 8 6 54 0 1 6 44 0 4 6 51 4 2 3 83 1 5 6 325 9 1 6 2l6 4 5 035 5 7 2l3 5 1 2 6l3 4 7 羔44 4 g 1l 3 7 1 74 7 4 7 807 6 7 835 9 1 7 354 4 圭3 29 8 3 1 0 223 2 1 3 5o3 0 1 4 102 8 1 4 334 9 9 841 0 5 圭0 7圭4 4 7 518 0 1 226 0 7 8圭 5 3 9 1l3 7 l o 825 5 3 7 8 3 3 4 5 0 4 2 9 1 4 3 0 0 0 3 6 0 0 圭1 6 1 3 2 7 5 0 0 0 1 8 0 0 9 5 0 1 8 8 9 4 5 5 2 5 6 2 5 9 2 2 0 7 1 9 1 9 2 0 6 5 5 n o t e m s k m e m o r i a ls l o a nk e t t e r i n g a b b r e v i a t i o n s n a n o ta v a i l a b l e n d n o t d e t e c t a b l e 7 图1 i i i v 1 感染患者c s f 中c x c l 8 的水平 f i g u r e1 c x c l 8l e v e l si nc s fo fh i v 1i n f e c t e ds u b j e c t s c s f 分别从h i v 感染合并或不合并神经系统损伤的患者中收集 以e l i s a 方法检测c s f 中c x c l 8 水平 以x s d 来表示图示数目患者的c x c l 8 平 均值 8 3 2 m c m 条件培养基 m c m 刺激人胚胎星形胶质细胞产生c x c l 8 我们首先研究了是哪种细胞类型在h i v 脑炎中过量表达c x c l 8 h i v e 病理组织 的研究已经确定星形胶质细胞和小胶质细胞可以生成c x c l 8 2 k 2 2 而入巨噬细胞不但 是h i v 在c n s 的宿主细胞 而且与小胶质细胞中表型上有很多相同之外 为了研究 人基噬纲胞的感染和活化对c x 既8 生成的影响 我们采用了一个被广泛接受的入m d m 培养体系私 以l p s 刺激m d m 模仿它们体内被激活的过程 血清中l p s 高达l o o p g m 1 水平升高是h i v 感染的一个特征勰 我们用0 l g m l 的l p s 分别刺激感染或未感染 h i v 的m d m 4 小时之后去除培养液 换用新鲜培养液清洗以清除残留的l p s 用新 鲜培养基孵育匿噬细胞2 4 小时薏 我们检测巨噬细胞培养液上清中c x c l 8 的浓度 与对照相比 h i v 感染引起c x c l 8 表达轻微升高 单独的l p s 处理能够刺激c x c l 8 表 达显著上调 然悉h i v 感染加强了糟s 刺激m d m 产生c x c l 8 的能力 图2 a h i v 感染的及免疫活化的巨噬细胞和星形胶质细胞之间的相互作用也是h a d 病 理过程中一个重要的因素 我们检测了c x c l 8 在c n s 中细胞数量最多的星形胶质细 胞中过表达的情况 我们使用了对照m d m 组 l p s 活化m d m 组 h 工卜l 感染m d m 组 及l p s 活化且 l 王v 王感染m d m 组的条件培养液 m a c r o p h a g e s c o n d i t i o n e dm e d i u m m c m 来处理培养的人星形胶质细胞 2 4 小时m c m 处理之后检测星形胶质细胞培养液 上清中c x c l 8 的水平 与l p s 活化的m c m 和m c m 中由巨噬细胞产生的c x c l 8 相比 l p s 活化且h i v 感染的m c m 显著提高了星形胶质细胞上清液中c x c l 8 的水平 图2 b 这些数据表明h i v i 感染的及免疫活化的i v e m 能够刺激星形胶质细胞丽产生更高浓 度的c x c l 8 9 圈2 h l v 一1 感染及l p s 激活的m c m 刺激人胚胎星形胶质细胞生成c x c l 8 f i g u r e2h i v 1 i n f e c t e da n dl p s a c t i v a t e dm c ms t i m u l a t e sc x c l 8p r o d u c t i o ni nh u m a n f e l a la s t r o c y t e s 人星形胶质细胞以3 复孔平铺于2 4 孔培养板 收集对照m d m h i v 感染的m d m l p s 活化或同时有h i v 感染的m d m 的上清作为m c m m d m 条件培养液 孵育星形胶质 细胞 a 检测m c m 中的c x c l 8 浓度 b 以2 0 m c m 处理人胚胎星形胶质细胞2 4 小时 检测星形胶质细胞上清中c x c l 8 浓度 以x s d 来表示三个独立实验的平均 结果 十 代表与同一e l i s a 板内平行设置的未孵育细胞的稀释m c m 相比p 0 0 1 料 代表阕对照组辐比p o 0 1 1 0 图3 i l ip 和t n f o 存在于l p s 和h i v 激活的m c m 中及重组i l 1p 和t n f o 簧白以 裁量依赖形式增麓星形胶质细胞中c x c l 8 蜂表达 f i g u r e3m 1 0a n dt y f o t a r ep r e s e n ti nl p sa n dh i v is t i m u l a t e dm c ma n di n c r e a s e c x c l 8e x p r e s s i o ni na s t r o c y t e si nad o s ed e p e n d a n tm s l m e l m c m 中i l 1b a 和t n f 一仪 b 浓度以e l i s a 检测 p d 在以不同浓度的 重组i 卜l 1 0 1 0 0 p g m 1 和谍f 吨 1 1 0 n g m 1 刺激2 4 小时候藤收集样品 以 实时r t p c r 和e l i s a 分别检测星形胶质细胞中的c x c l 8 信使r n a 表达 c 和上清 液中的蛋白浓度 d 以x s d 表示结果 本结果代表三个独立实验的平均 术术表 示同对照组相比p o 0 1 木表示同对照相比p o 0 5 表示同l p s 组相比p o 0 1 表示同l p s 相比p o 0 5 1 3 3 m c m 介导人星形胶质细胞产生的c x o l 8 依赖于细胞因子t n f 0 c 和il 11 3 我们检测了h i v 感染的或免疫活化的m d m 是否能够产生i l lj 3 和t n f 一仪 结果 显示 对照组m c m 含有少量的i l 一1 p 和t n f 一0 c 而l p s 激活之后i l lj 3 的浓度为 2 6 p g m l t n f 一仅的浓度为0 5n g m 1 l p s 激活且h i v l 感染的m c m 中 i l 一1 1 3a n dt n f 吨 的水平有显著的升高 分别为5 0p g m l 和1 7 n g m l 图3 a 和b 根据m c m 中i l i p 和t n f 吨的浓度 我们用不同剂量的重组i l 1 p 和t n f 飞处理人胚胎星形胶质细胞 i l l p 1 0 l o o p g m 1 和t n f 吨 1 l o n g m 1 剂量依赖性地在信使r n a 和蛋白水平引起 c x c l 8 表达上调 图3 c 和d 为了进一步检测人星形胶质细胞c x c l 8 的表达是否依赖于i l 1 p 和t n f 飞 我们 预先用不同的阻断剂来中和或拮抗m c m 中i l i p 和t n f 仪的活性 阻断剂包括可溶 性t n f r 1 1 0 0n g m 1 可中和t n f 一0 t n f r 2 1 0 0n g m 1 可中和t n f 吨 i l l 受体拮抗剂 i l 1r a 1 0 0n g m 1 i f n 飞中和性抗体 1 0 0 0i u m 1 a n di f n p 中 和性抗体 1 0 0 0i u m 1 阻断剂检测实验表明这些阻断剂均可成功阻断相应的细胞 因子 图4 a 及未发表的数据 与阻断剂预孵育2 小时后 将m c m 总容积的2 5 加 入到培养的星形胶质细胞中处理2 4 小时 h i v l 感染和l p s 活化m c m 引起的c x c l 8 过 表达被可溶性的t n f r 1 可溶性的t n f r 2 及i l 1 r a 所阻断 但并不被免疫球蛋 白对照组或是i 型干扰素中和性抗体所影响 图4 b 这些结果表明h i v 感染或免疫 活化的巨噬细胞分别通过i l 1p 和t n f 吨引起c x c l 8 的过表达 1 2 图4 m c m 介导的人星形胶质细胞c x c l 8 的生成依赖于m c m 中i l 1d 和t n f o t 的产生 f i g u r e4m c m m e d i a t e dh u m a na s t r o c y t ec x c l 8p r o d u c t i o ni sd e p e n d e n to i li l 1 1 3a n dt n f 吨 a 可溶性l o o n g m 1 t n f r 1 和t n f r 2 阻断了l o n g m l 的t n f q 诱导的c x c l 8 的 生成 而l o o n g m i i l 1 受体拮抗剂阻断了星形胶质细胞中i l 11 3 5 0 p g m 1 诱导的 c x c l 8 的生成 可溶性t n f r 1 和t n f r 2 i l 1 受体拮抗剂 以及i n f 一仪和i n f 一1 3 中和抗体本身对c x c l 8 生成没有明显影响 木术代表同对照组相比p o 0 1 代表同 重组蛋白相比p o 0 1 b 星形胶质细胞以t n f r 1 和t n f r 2 1 0 0 n g m 1 i n f 一仪 和i n f 1 3 中和抗体 1 0 0 n g m 1 进行预处理 以感染和激活的m c m 诱导c x c l 8 的产 生 而先以t n f r 1 t n f r 2 或是i l 1 r a 预处理降低了m c m 诱导的c x c l 8 的生成 1ug m l 的i n f 吨中和抗体和i n f 一1 3 中和抗体没有降低c x c l 8 的产生 结果以x s d 表示 是三个独立实验的代表 水木代表同对照相比p o 0 1 代表同对照l p s h i v 相 比p o 0 5 1 3 图5 m c m 介导产生的c x c l 8 依赖于m a p k s 通路 f i g u r e5m c m m e d i a t e dc x c l 8p r o d u c t i o ni sd e p e n d e n to nm a p k s a 以p 3 8 抑制剂s b 2 0 3 5 8 0 j n k 抑制剂s p 6 0 0 1 2 5 和e r k 抑制剂p d 9 8 0 5 9 分 别处理星形胶质细胞2 小时后 再分别以对照m d m h i v 1 感染的m i m l p s 活化或 同时有h i v 一1 感染的m d m 的条件上清液刺激星形胶质细胞 2 4 小时后用e l i s a 检测 c x c l 8 的生成 b 以同样抑制剂分别处理星形胶质细胞2 小时后 再以t n f q 5 0 n g m l 刺激星形胶质细胞 2 4 小时后检测c x c l 8 的生成 c 以同样抑制剂分别处 理星形胶质细胞2 小时后 再以i l 11 35 0 n g m l 刺激星形胶质细胞 2 4 小时后检测 c x c l 8 的生成 术木代表同对照相比p 0 0 1 代表同m c m 或细胞因子单独刺激组 相比p 0 0 1 1 4 1 3 4m c m 介导星形胶质细胞过表达c x c l 8 依赖于m a p k s 及p k r 为了确定m c m 诱导的c x c l 8 过表达的机制 我们研究了已知的参与炎症过程的 有丝分裂素激活蛋白激酶 m i t g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m a p k 信号通路 经典的m a p k 主要由e r k l 2 涨 帮p 3 8 三个信号路组成 在加入2 5 m c m 之前我们 用s b 2 0 3 5 8 0 p 3 8 阻断剂 s p 6 0 0 1 2 5 删阻断荆 或p d 9 8 0 5 9 e l k 王 2 阻断剂 预处理 将阻断剂与星形胶质细胞孵育2 小时 阻断剂相应的阻断了m c m 诱导的m a p k s 的磷酸化 未发表的数据 s b 2 0 3 5 8 0 s p 6 0 0 1 2 5 和p d 9 8 0 5 9 能够减少l p s 活化及 h t v 感染的m c m 诱导的星形胶质细胞表达c x c l 8 而e r k 抑制剂p d 9 8 0 5 9 不能起到同 样作用 这表明娜 p 3 8 和e r k 参与了m c m 褰j 激c x c l 8 表达的信号通路 同样的 嚣瓤圭 2 抑制剂p d 9 8 0 5 9 对m c m 弓 起的c x c l 8 表达起到较小的阻滞作用 图5 p 因为 j n k p 3 8 和e r k l 2 都参与了应激刺激 如细胞因子 的信号转导 而且m c m 介 导的人星形胶质细胞c x c l 8 的生成依赖于m c m 中i l 1b 和t n f q 的产生 图4 b 我 们进一步检测了m a p k s 抑制剂对t n f 吨 图5 b 和i l 1b 图5 c 介导的c x c l 8 表达的 影响 我们实验室的免疫印记法表明p 3 8 j n k 和e r k l 2 通路能够被t n f 一貔和i l l 多活化 雨这些活化均能够被抑制裁所阻断 耒发表的数据 t 滞飞介导的星形胶 质细胞c x c l 8 表达可以被s b 2 0 3 5 8 0 阻断 但是不受s p 6 0 0 1 2 5 或是p d 9 8 0 5 9 e r k 阻 断剂 影响 图5 s 不同的是 i 卜lb 介导的星形胶质细胞c x c l 8 表达可以被 s b 2 0 3 5 8 0 s p 6 0 0 1 2 5 或是p d 9 8 0 5 9 预处理所减少 图5 c 综上 这些结果表明 眦v 1 感染及l p s 活化m c m 引起豹星形胶质细胞c x c l 8 表达是通过p 3 8 j n k 和 e r k l 2 信号传导通路 t n f 介导的c x c l 8 表达是通过p 3 8 道路 而王卜l 介导 的c x c l 8 表达是通过p 3 8 j 凇 器e 殛圭 2 信号传导通路 1 5 蹋6 人胚胎星形胶震细胞生成c x c l 8 过程枣p k r 的参岛 f i g u r e6i n v o l v e r a c n to fp k ri nh u m a nf e t a la s t r o c y t ec x c l 8p r o d u c t i o a a 1 0ump k r 抑制剂预处理能够阻断i l 1 和t n f 吨诱导的人胚胎星形胶质细 胞中c x c l 8 的产生 而p k r 抑制剂的非活性类似物没有任何效果 术代表同对照相比 p 0 0 5 l 牢代表闻对照相比p o 0 1 释代表同i 卜l 抑制剂对照相比p 0 0 5 髯释代 表霹羊豫飞抑制剂对照耀比p 0 0 1 器 以1 01 1 蘩p k r 抑制剂预处理人胚胎星形胶 质细胞后再以感染和激活的燃诱导c x c l 8 的生成 拳术代表同对照棚比p 0 0 1 莓莓 同l p s 刺激相比p 0 0 1 代表同l p s h i v 抑制剂处理的星形胶质细胞对照相比 p 9 0 的细胞n e s t i n 阳性 n e s t i n 是一种神经干细胞标志物 2 6 人星形胶质细胞是按照之前描述的方法玷 从人脑组织皮质中分离出来的 星 形胶质细胞以2 1 0 7c e l l s 1 5 0c 2 的浓度接种在含1 0 胎牛血清 g i b c o i n v i t r o g e nc o r p 及抗生素 i n v i t r o g e n 包括青霉素 链霉素和新霉素 的d 皿m f 1 2 i n v i t r o g e n 中 贴壁的星形胶质细胞培养两周之后经0 2 5 的胰酶消化后培养在同 样条件下以增加其纯度 分离的星形胶质细胞用抗胶质细胞原纤维酸性蛋白 g l i a l f i b r il l a r ya c i d i cp r o t e i n g f a p 的抗体 d a k oc o r p c a r p i n t e r i a c a 通过 免疫细胞化学的方法加以鉴定 结果表明分离的星形胶质细胞纯度 9 8 2 2 3 7r n a 提纯和t a q m a n 实时r t p c r 总r n a 由t r i z o l 试剂和r n e a s ym