慢性间断性缺氧诱导大脑细胞凋亡的研究.pdf

l 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院神经科 邮编l00730 2 中国医学科学院基础所神经生物研究室 慢性间断性缺氧诱导大脑细胞凋亡的研究 彭斌l李舜伟l谭会兵2 摘要 目的探讨急性及慢性间断性缺氧时大脑神经细胞凋亡的机制 方法 l 建立缺氧动物模型 将 sd大鼠置于常压低氧舱中 充入氮气调节氧浓度至所需氧浓度 2 动物分组 急性缺氧组 在低氧舱中缺氧 l 5h 慢性间断性缺氧组 每日在低氧舱中6h 每周缺氧6d 共缺氧28d 采用原位tdt缺口末端标记 tunel 法检测凋亡细胞 结果急性及慢性间断性缺氧后凋亡细胞明显增加 结论缺氧可诱导迟发性神经 细胞凋亡 缺氧性脑损伤可能在神经系统变性疾病的发病机制中起重要作用 关键词 低氧脑损害凋亡 study of the apoptosis in rat brain induced by chronic interm ittent hypoxia peng b in li shunz ei tan uibing depart ment of neurology peking union m edical college ospital beijing l00730 abstract objective to deter m ine whether an established models of acute and chronic cerebral hypoxia in the rats demonstrates any features of apoptosis m ethods l to establish the ani mal model of hypoxia male sprague daw ley rats were placed in a chamber maintained at l0 02 ypoxia was maintained by infusing n2balanced against an inward leak of air through holes in the chamber 2 the rats were divided into t wo groups acute hypoxia group and chronic hy poxia group the rats of acute hypoxia group were placed in the hypoxic chamber for l 5 hour while the chronic hypoxic rats were 6 hour of hypoxia daily 6 days week 4 weeks a fter the hypoxic models were made the severity of hypoxic damage was assessed in the cortex and hippocampus by light m icroscpy apoptosis was exam ined by using ter m inal de oxynucleotidyl transferase mediated dutp biotin nick end labeling tunel resultsapoptosis occurred both in acute and chronic hypoxia group the peak of apoptosis was seen at 5th day after hypoxia which was more than that of chronic hypoxia group apoptotic cells were mostly distributed in the cortex and hippocampus conclusionsthe resultsindicated that apotposis occurred after being exposed to hypoxia ypoxic cerebral injury m ight play ani mportant rolein the patho genesis of neurodegenerative disease key words ypoxia cerebral injuryapoptosis 临床上缺氧性脑损伤并不少见 呼吸衰竭 溺 水 严重贫血 窒息及睡眠呼吸障碍等均可引起不同 程度的脑损害 l 2 对缺血 缺氧动物脑损伤的研 究提示 在缺血 缺氧后出现的神经细胞迟发性死亡 是凋亡 3 由于缺血 缺氧模型与单纯性缺氧模型 不同 本实验目的即是建立低氧模型 以期探讨急性 及慢性缺氧诱导神经细胞凋亡有关机制 材料与方法 一 材料 雄性sd大鼠35只 体重200 250g 购于北京 协和医院动物中心 低氧舱由中国医学科学院基础 所病理生理室提供 舱内与外界空气通过一直径为 l 5cm的胶管相通 保持常压低氧 氧气 二氧化碳 浓度测定仪购于上海市嘉定学联仪表厂 cyes 型 氮气由北京协和医院氮气中心提供 原位细 胞凋亡检测tunel试剂盒购自德国borehringer m annhei m公司 dab工作液购自北京中山生物科 技有限公司 mk 80l由中国医学科学院基础所药 理室赠送 二 动物模型 l 急性缺氧动物模型 雄性sd大鼠20 只放入 33 北京医学2002年第24卷第5期 体积220l低氧舱内 舱内用小风扇不断将空气混 匀 用一恒速泵将混匀的舱内气体输入舱外的氧气 浓度测定仪 持续监测舱内浓度 使舱内浓度控制在 10 5 舱内二氧化碳和水蒸汽分别用钠石灰 和氯化钙吸收 缺氧舱壁留有小缝隙与舱外相通 可供舱外气体缓慢进入 使舱内气压与大气压始终 平衡 饲料及饮水同常 迅速充入氮气 每次缺氧 开始时氧浓度从23 降至10 0 5 用时 10m in 缺氧舱内二氧化碳浓度始终 3 温度保 持22 2 c 维持该状态1 5h后结束实验 将大鼠 置于空气中 分别在缺氧后1 4只 3 5 只 5 6 只 7 5 只 d 处死 2 慢性间断性缺氧动物模型 雄性sd大鼠15 只 入低氧舱 低氧条件同上 维持氧浓度10 0 5 6h 后将动物取出低氧舱 置于空气中 第2 天再重复如上过程 每周缺氧6d 在缺氧3周 5 只 及4周 10只 时结束实验 3 mk 801 治疗组 将 mk 801 溶于0 1pb 10g kg 8 在缺氧前30m in腹腔注射 此后步骤 同急性缺氧组 缺氧后5d处死 4 对照组 雄性sd大鼠6 只 与低氧组置于同 一房间 除不低氧处理外 余条件相同 三 实验步骤 1 动物麻醉采用0 1 戊巴比妥腹腔注射 1m l kg 麻醉成功后常规灌注固定 取脑 放入 4 多聚甲醛后固定3h 然后移入30 蔗糖溶液至 标本沉底 以备切片之用 冰冻切片机 h istostat m icrotome american 0ptical 20 c低温行冠状切 片 取interaural 5 2mm水平 bregma线 3 80 mm 为实验切片 4 片厚10 m 切片置于 20 c冰 箱冷藏备用 2 常规he染色 3 原位细胞凋亡检测 tunel 步骤 切片于 4 多聚甲醛室温放置10m in 0 1mol l pb 漂洗 30m in 后切片放入0 3 h202甲醇中1h 在pb洗2 次 5m in 后 切片上滴加0 1 t riton 置冰上室 温6m in pb 洗2次 5m in 滴加tunel液置 37 c湿 盒 内40m in 之 后 滴 加dab 室 温 反 应 15m in 甲苯胺蓝复染 梯度乙醇脱水 二甲苯透明 中性树胶封片 阴性对照组以0 1mol l pb代替 tunel酶液 余步骤同实验组 四 统计学方法 ssps8 0 软件包进行统计分析 以 0 05 为有显著性差异 结果 一 he染色 1 急性缺氧 各组均可见散在分布的肿胀神经 元 主要在文状体 皮层深层等部位见凋亡细胞 胞 体皱缩 胞核浓聚 深染 数量不多 2 慢性缺氧 肿胀神经元明显增多 胞浆出现空 泡 变性细胞以纹状体 大脑皮层第3 5 6 层为著 海马大体形态基本保持完整 在ca1及齿状核可见 散在皱缩细胞及肿胀细胞 凋亡细胞未见明显增 多 3 mk 801 治疗组 也可见肿胀的神经元和凋 亡细胞 与未治疗组相比无明显变化 二 tunel标记结果 结果以每张切片上凋亡 细胞数统计 1 急性缺氧 从缺氧后1d n 8 20 2 38 开 始 tunel阳性细胞逐渐增多 第3 天n 8 40 3 64 第4 天n 14 00 1 58至第5天n 30 5 达到高峰 第7天恢复至第1天水平 n 10 4 2 6 较对照组 n 2 10 1 58 增加 0 05 其中第5天较第3 4 7 天明显增多 0 05 tunel阳性细胞主要分布在纹状体 皮层深层 海 马伞 在海马齿状回及尾状核等部位也可见散在凋 亡细胞 2 慢性间断性缺氧组 缺氧3 周及4周后 在皮 层有tunel阳性细胞 n 13 6 2 0 n 14 3 3 0 较对照组增多 n 2 10 1 58 0 05 但 比急性缺氧后第5天少 n 30 5 0 05 3 mk 801 治疗组 tunel阳性细胞 n 28 5 3 4 较对照组 n 2 8 1 4 明显增多 但与未治 疗的第5天组 n 30 5 相比无明显变化 0 05 讨论 我们的研究证明缺氧引起的迟发性神经细胞死 亡也可以表现为凋亡的形式 凋亡细胞主要分布在 皮层深层及海马伞等部位 与缺血 缺氧时损伤类 似 4 只是凋亡的细胞数较少 相关的研究也有类 似的结果 rosenbaum等 5 证明缺氧可以诱导交感 神经细胞凋亡 缺氧引起细胞凋亡的机制目前尚不 完全清楚 兴奋性氨基酸如谷氨酸 n 甲基 d 天冬 氨酸 nmda 被认为是较重要的共同通道 可诱导 043 北京医学2002年第24卷第5期 n0 及ca2 内流 从而引起神经细胞凋亡 此外 氧 自由基引起的凋亡也被引起重视 在缺氧的应答反 应中 低氧诱导因子 1 if 1 基因表达的意义也日 益受到重视 6 研究结果表明 缺氧诱导的凋亡细 胞数目毕竟较少 提示凋亡这种细胞死亡形式只是 缺氧脑损伤机制中的一个方面 同时 我们的研究还证明 在慢性缺氧时 凋亡 细胞未见明显增加 而是以皮层神经元肿胀变性 坏 死为突出表现 这可能与缺氧刺激的严重程度有关 t aylor 等 7 认为 决定细胞死亡或凋亡有以下主要 因素 细胞的发育状态 细胞的种类 损伤的严重程 度和获得atp的能力 其中损伤的严重程度有重 要的作用 同一种细胞在轻度损伤时表现为凋亡 而重度损伤则诱导凋亡 可能的机制是细胞结构的 损伤程度会影响细胞的死亡模式 例如 线粒体对氧 尤其敏感 线粒体的变化可能在细胞死亡形式中起 核心作用 轻中度损伤时 线粒体膜通透性轻度增 加 释放有限的诱导细胞凋亡的成分 而重度的线粒 体损伤可释放大量的ca2 和r0s reactive oxygen species 使细胞膜完整性被破坏 导致细胞坏死 此外 bonfoco 等 8 也证明 低浓度的nmda引起细 胞凋亡 而高浓度的nmda则导致细胞坏死 我们 认为 在慢性缺氧时 持续的低氧可能导致大量的细 胞损伤物质释放 如r0s及nmda等 从而引起 以坏死为主要表现的病理损害 本研究急性缺氧致 死组的结果与此相近 mk 801 是nmda受体拮抗剂 在动物脑梗死 模型中可明显减少梗死面积 本实验未能证实 mk 801 对神经细胞在缺氧性损伤时具有保护作 用 与某些作者的结论有所不同 9 我们认为可能 与实验动物少有关 也可能是缺氧时兴奋性氨基酸 损伤只是引起神经细胞凋亡的原因之一 其他因素 如一氧化氮及自由基损伤等 可能起着较重要的作 用 细胞凋亡在神经系统许多疾病 尤其是在神经 系统变性病如老年痴呆 帕金森病 肌萎缩侧索硬化 等的发病机制中有重要的作用 对缺氧大脑神经细 胞凋亡现象及其机制的研究 对揭示这些疾病之间 可能存在的某些联系将有一定的帮助 参考文献 1 m ecklinge a cramon dy cramon gm event related potential evi dence for a specific recogintion memory deficit in adult survivors of cerebral hypoxia brain 1998 121 1919 1935 2 彭 斌 李舜伟 黄席珍 等 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者事 件相关电位研究 中华神经科杂志 1999 32 361 364 3 n itatori t sato n w agrui s et al delayed neuronal deathin the ca1 pyram idal cell layer of the gerbil hippocampus follow ing transient is chem ia is apoptosis j neruosci 1995 15 1001 1011 4 shibata m a raki n amada j et al t emporal profiles of ischem ia in duced apoptotic cell deathin hippocampus and cerebral cortex j cereb b lood f low m etab 1999 suppl 1 s47 5 rosenbaum dm m ichaelson m batter dk et al evidence for hypox ia induced programmed cell death of clutured neruons ann neurol 1994 36 864 870 6 彭 斌 李舜伟 低氧诱导因子 1与神经系统缺血 缺氧应答反 应 国外医学脑血管疾病分册 2001 9 209 211 7 t aylor dl edwards d m ehmet 0 xidative metabolism apoptosis and perinatal brain injury brain patho 1999 9 93 117 8 bonfoco e krainc d ankarchona m et al apoptosis and necrosis t wo distinct eventsinduced respectivel by m ild andintenseinsults w ith n methyl d aspartate or nitric oxide superoxide in cortical cell cul tures proc natl a cad sci usa 1995 92 7162 7166 9 m atsuoka y yoshihisa k fukunaga r et al in vivo hypoxia induced neuronal damagein dentate gyrus of rat hippocampus changesin nm dareceptors and the effect ofmk 801 neurochem int 1997 30 533 542 收稿 2001 10 29 致读者 本刊要求论著稿件请附200字左右的中文摘要及相应的英文摘要 英译文题 单位英文名称和前三名作者汉语拼 音 并在摘要下写出2 3个关键词 包括英文关键词 为便于通过医学主题词查阅您的文章 请参照 医学主题词词 表 列出论著的中英文对照的关键词 中 英文摘要请按结构式摘要的形式来写 即目的 方法 结果 结论四部分 参考 文献的作者3位以上务必列出前3位 3 位以内全列 不可只列一位加 等 国外文献作者的姓及名字缩写要列齐全 文献在文内引用处一定要全部列出角码 图一定要以读者看懂为准 凡以上资料不全者将影响文章刊出日程 本刊编辑部 143 北京医学2002年第24卷第5期 慢性间断性缺氧诱导大脑细胞凋亡的研究慢性间断性缺氧诱导大脑细胞凋亡的研究 作者 彭斌 李舜伟 谭会兵 作者单位 彭斌 李舜伟 中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院神经科 100730 谭会兵 中国医学科学院基础所神经生物研究室 刊名 北京医学 英文刊名 beijing medical journal 年 卷 期 2002 24 5 被引用次数 19次 参考文献 9条 参考文献 9条 1 mecklinge a cramon dy cramon gm event related potential evidence for a specific recogintion memory deficit in adult survivors of cerebral hypoxia 外文期刊 1998 pt 10 2 彭斌 李舜伟 黄席珍 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者事件相关电位研究 期刊论文 中华神经科杂志 1999 06 3 nitatori t sato n wagrui s delayed neuronal death in the ca1 pyramidal cell layer of the gerbil hippocampus following transient ischemia is apoptosis 外文期刊 1995 4 shibata m araki n hamada j temporal profiles of ischemia induced apoptotic cell death in hippocampus and cerebral cortex 1999 01 5 rosenbaum dm michaelson m batter dk evidence for hypoxia induced programmed cell death of clutured neruons 外文期刊 1994 6 彭斌 李舜伟 低氧诱导因子 1与神经系统缺血 缺氧应答反应 期刊论文 国外医学 脑血管疾病分册 2001 04 7 taylor dl edwards d mehmet h oxidative metabolism apoptosis and perinatal brain injury 外文期刊 1999 8 bonfoco e krainc d ankarchona m apoptosis and necrosis two distinct events induced respectivel by mild and intense insults with n methyl d aspartate or nitric oxide superoxide in cortical cell cultures 外文期刊 1995 16 9 matsuoka y yoshihisa k fukunaga r in vivo hypoxia induced neuronal damage in dentate gyrus of rat hippocampus changes in nmda receptors and the effect of mk 801 外文期刊 1997 本文读者也读过 10条 本文读者也读过 10条 1 宗峰 左祥荣 王慧 吕剑 解卫平 王虹 zong feng zuo xiang rong wang hui l u jian xie wei ping wang hong 新型katp开放剂埃他卡林对低氧性肺动脉高压大鼠血管活性物质的影响 期刊论文 实用老年医学2010 24 3 2 王华仁 李积胜 wang hua ren li ji sheng 急性缺氧小鼠海马ca1区nos活力和nnos蛋白表达的时程变化 期刊 论文 中国心理卫生杂志2005 19 7 3 赵平 郭艳辉 崔健君 产前缺氧性适应动物模型制备 期刊论文 中华麻醉学杂志2002 22 1 4 丁志丹 梁光辉 李向楠 齐宇 秦建军 赵松 赵高峰 ding zhidan liang guanghui li xiangnan qi yu qin jianjun zhao song zhao gaofeng 肝素对低氧性肺动脉高压大鼠右心室收缩压和肺组织p27表达的影响 期刊论文 郑州大学学报 医学版 2008 43 1 5 封国生 李文斌 浅谈美国医院管理 期刊论文 医院院长论坛2008 5 3 6 陈少贤 周浩 王良兴 陈彦凡 谢于鹏 王群姬 张洪勤 洛沙坦对蛋白激酶c在慢性缺氧大鼠模型肺动脉胶原表达 作用的影响 期刊论文 中华内科杂志2002 41 7 7 周晋 孟然 隋新华 李文斌 杨宝峰 人脑皮层神经元和nb4细胞对亚砷酸的耐受性差异 期刊论文 中国科学c辑 2006 36 4 8 彭斌 潘杰 梁辉 王晓波 胡英环 高山 颈动脉虹吸段狭窄支架置入术后海绵窦综合征合并眼动脉胆固醇结晶栓 塞一例 期刊论文 中华医学杂志2009 89 19 9 刘文莉 涂家红 赵斌 杜军保 张春雨 王聪 王海英 硫化氢抑制低氧性肺动脉高压大鼠肺动脉细胞外基质的表达 期刊论文 中国急救复苏与灾害医学杂志2007 2 6 10 姚力 蔡若蔚 邱建龙 大鼠慢性间歇性缺氧后c fos的表达与神经细胞凋亡的关系 期刊论文 福建医科大学学 报2010 44 2 引证文献 19条 引证文献 19条 1 唐宁 文珠 张进 聂荣庆 胡国柱 人参皂甙rb1 黄芪抗大鼠大脑皮层神经细胞缺氧性凋亡研究 期刊论文 江西 医学院学报 2006 4 2 王凌星 黄红红 吴凌峰 慢性间断缺氧对老年期大鼠脑白质的影响 期刊论文 卒中与神经疾病 2009 2 3 guozhu hu jin zhang ning tang zhu wen rongqing nie effect of polygonatum polysaccharide on the hypoxia induced apoptosis and necrosis in in v