[doc] 高糖对THP1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4表达的影响.doc

高糖对thp-1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4表达的影响?852?文章编号10004718(2008)05085204中国病理生理杂志chinesejournalofpathophysiology2008,24(5):852855高糖对thp一1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4表达的影响木梁文昌,李连喜,杨志红,张烁,何敏,金惠铭,胡仁明(复旦大学附属华山医院内分泌科,复旦大学内分泌糖尿病研究所,上海200040;复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海200032)【摘要目的:探讨高糖对单核/巨噬细胞系thp一1细胞及人主动脉平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4(trailr4)表达的影响.方法:用pma孵育thp1细胞,诱导其分化成为巨噬细胞.流式细胞仪检测成功诱导的巨噬细胞粘附分子cd11b及cd1lc.采用不同糖浓度干预thp一1细胞,用westernblotting技术检测trailr4的表达.用25mmol/l高糖培养液在不同时点孵育人主动脉平滑肌细胞,观察trailr4蛋白表达的变化.用pkc激动剂干预thp一1细胞后,用westernblotting技术检测trailr4的表达.结果:佛波酯(pma)孵育thp一1细胞48h可诱导其分化成为巨噬细胞.20mmol/l高糖明显上调人thp一1细胞trailr4的表达.高糖对人主动脉平滑肌细胞trailr4表达上调的影响随着刺激时间的增加而增加.pkc激活后thp一1细胞trailr4的表达明显上调.结论:高糖上调trailr4蛋白表达,trailr4通过抑制巨噬细胞及平滑肌细胞的凋亡促进动脉粥样硬化.关键词受体,肿瘤坏死因子;巨噬细胞;肌,平滑,血管【中图分类号】11363【文献标识码ahighglucoseup-regulatestrail-r4expressioninthp-1cellsandsmoothmusclecellsleongmancheong.,lilianx1一,yangzhihong.,zhangshuo.,hemin.,jinhuiming2.huren一.ming.(departmentofendocrinology,huashanhospital,instituteofendocrinologyanddiabetologyfudanuniversity,shanghai2o0o4o,china;departmentofphysiologyandpathophysiology,shanghaimedicalcollegeoffudanuniversity,shanghai200032,china.email:.ca)abstractaim:toevaluatetheexpressionoftnfrelatedapoptosisinducingligandreceptor4(trailr4)ofthp一1cellsandhumanaortasmoothmusclecellsunderhighglucoseintervention.methods:monoeyticcelllinethp一1wasincubatedwithpmatoinducetomaturemacrophage,adhesionmoleculescd11bandcd1lcwereas-sessedbyfacs.trailr4levelsinthp一1cellstreatedwithdifferentglucoseconcentrationsweredeterminedbywesternblotting.thechangesoftrailr4proteinexpressionswereobservedatdifferenttimepointsinhumanaortasmoothmusclecells.westernblottingwasemployedtoevaluatetrailr4levelsaftertheinterventionofpkcactivator.results:incubationwith160nmol/lpmainducedmaturemacrophages.trailr4expressionwasupregulatedafterincubationwith20mmol/lglucoseinmacrophages.trailr4waselevatedinatimecoursemannerunderhigh出岛selevelinhumanaortasmoothmusclecells.moreover,activationofpkcinducedtrailr4expressions.con-clusion:upregulatedtrailr4proteinlevelsinducedbyhighglucoselevelsmightinhibitapoptosisofmonocytesandsmoothmusclecellsandcontributetotheprogressionofatherosclerosis.keyw0rdsreceptors,tumournecrosisfactor;macrophages;muscle,smooth,vascular糖尿病及其慢性并发症是常见的代谢性疾病之一,糖尿病大血管及微血管病变是糖尿病患者致死,致残的主要原因,而高糖高脂是导致糖尿病血管病变的主要因素.糖尿病患者的高血糖,高血脂可导致内皮细胞损伤,单核细胞粘附,迁移,移行进入血管壁并分化成为巨噬细胞.巨噬细胞一方面吞噬脂质转变成泡沫细胞,同时表达,分泌多种细胞因子.这些细胞因子一方面加剧了血管壁的慢性炎症【收稿日期20080129【修回日期20080417?【基金项目国家863重大课题资助项目(no.2002ba711a05);上海市科学技术委员会重大课题资助项目(no.04dz19504)通讯作者tel:02162481305;email:,反应,同时也进一步加重了内皮细胞损伤,并促进血管平滑肌细胞增殖及分泌细胞因子.血管平滑肌细胞亦可吞噬脂质而转变成泡沫细胞,后者是糖尿病动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)的病理基础.最近的研究显示,肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tnfrelatedapoptosisinducingligand.trail)在血管生理及动脉粥样硬化的病理过程中发挥重要作用.而trailr4是肿瘤坏死因子受体超家族中的一员,它能够与trail相互作用广泛调控细胞凋亡,并可作为诱导受体中和trail的生物学作用j.本研究观察高糖对单核/巨噬细胞系thp一1细胞和平滑肌细胞trailr4表达的影响,以更好的了解糖尿病患者发生动脉粥样硬化的病理生理机制.材料和方法1材料thp一1细胞由中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库提供;人主动脉平滑肌细胞和231培养液购自cascadebiologics公司;rpmi一1640培养基,购自gibcol公司;胎牛血清(fetalbovineserllm,fbs)购自hyclone公司;牛血清白蛋白(bsa),佛波酯(phorbolmyristateacetate,pma)为sigma公司产品.cd1lb及cd11c购自上海晶美公司.2方法2.1细胞培养thp一1细胞培养用含有10%小牛血清的rpmi一1640培养液,37.c,5%co培养箱中静置培养,培养液中加hepes10mmol/l和青霉素,链霉素为110u/l,在每次实验前用160nmol/lpma孵育thp一1细胞48h,诱导其分化成巨噬细胞.人主动脉平滑肌细胞用含有平滑肌生长补充剂的231培养液培养,37,5%co培养箱中静置培养.2.2流式细胞仪检测cd11b及cd11c用160nmol/lpma诱导thp一1细胞48h后,胰酶消化贴壁的thp一1细胞,分别做巨噬细胞表面分子的特殊标记cd11b或cd11c,室温避光孵育30min,流式细胞仪检测表达量.2.3蛋白印迹验证trailr4的差异表达向细胞内加入ripa200l和pmsf2l,融化后吸人离心管中.12000r/min4.c离心30min,吸取上清液.分光光度计bradford法进行蛋白定量,一2o保存.每次实验各取样品5og蛋白进行12%sdspage电泳,100v30min;150v90min.转膜,100v2h.5%脱脂奶粉封闭1h.tbst液10min3次洗膜.取兔抗人trailr4抗体(1:1500,calbiochem)或bactin抗体(1:5000,santacruz)与膜进行杂交,室温2h.tbst液洗膜10min3次.取辣根过氧化物酶(hrp)标记抗(1:3000,cellsignalingtechnology)与膜杂交,室温1h.tbst液洗膜,10min3次.ecl(上海普飞)显色5min.然后依次进行曝光,显影,定影.trailr4表达以trailr4/13一actin总灰度值表示.3统计学处理数据用均数标准差(s)表示,采用spss15.0统计学软件进行数据处理,组间比较采用方差分析.结果1thp一1细胞培养,诱导其分化成为巨噬细胞用含有10%小牛血清的rpmi一1640培养液培养thp一1细胞,待细胞进入对数生长期后,用160nmol/lpma孵育thp一1细胞48h后,thp一1细胞从悬浮状态诱导成贴壁状态,细胞表面粘附分子cd11b明显低表达,cd1lc呈相对高表达(图1),符合巨噬细胞的特点o.2高糖对单核/巨噬细胞系thp一1细胞trailr4表达的影响用不同糖浓度的培养液孵育thp一1细胞24h后,抽取细胞总蛋白行westernblotting检查可见2ommol/l高糖能明显上调trailr4蛋白表达(图2).3高糖对人主动脉平滑肌细胞trailr4表达的影响用25mmol/l高糖的培养液孵育人主动脉平滑肌细胞,westernblotting检测发现随着刺激时间的增加,高糖(25mmol/l)对人主动脉平滑肌细胞trailr4表达的上调作用明显增加(图3).4pkc激动剂对thp一1细胞trailr4蛋白表达的影响于thp一1细胞中加入不同浓度的pkc激动剂干预24h后,westernblotting检验发现trailr4表达随pkc激动剂浓度增加而增加(图4).讨论trailr4是第四个被确认为trail的受体.其主要功能是通过竞争trail与促凋亡受体trailr1,trailr2的结合从而抑制trail的促凋亡作用.生理情况下,trail与trailr1或trailr2结合后通过后者的死亡结构域募集caspase一8及caspase一10的前体,活化的caspase一8进一步切割caspase一3前体,生成有活性的caspase一3,从而触发外源性的凋亡通路.而trail与trailr4结合后,由于trailr4不具备完整的死亡结构域而无法转导凋亡信号,从而抑制了细胞凋亡.trail不仅有着广泛的促凋亡活性j,它?854?cq>inn0thp-1f200)10.1011010cdl1bcu>山thp一1cellsstimulatedwithpmafor48h(200)n0101010cdl1cfig1incubationwith160nmolpmainducedmaturemacrophages,thplcellsbecameadherentafterinducedtomaturemacrophagebyincubationwith160nmolpmafor48h.lowexpressionofcd1lbandrelativehighexpressionofcd1lcwereobservedinthp一1cells.whichwasinconcordwithmaturemacrophages.图1pma孵育thp一1细胞48h可诱导其分化成为巨噬细胞atrailr4dactincontrol2qglucose(mmol/l)atra1lr413-actincontroll5mmo1/l20mmol/lglucoseglucosefig2theexpressionoftrialr4inthp一1cellsindifiefentglucoseconcentrationsofcuhuralmedia.thp1gjcellswereincubatedwith20mmolflglucosefor24h.cellextractswereanalyzedfortrailr4expressionbywesternblotting,”pregulationoftrailr4wasobservedat20mmolglucose.a:immunoblottingimage;b:quantificationofimmunoblottingx4-s.n=3,p<0.055control,图2不同糖浓度对单核/巨噬细胞系thp一1细胞trail图3一r4表达的影响b2?5c?塞2.0墨1.5.f1.0复0.5._ddc0一q.iq寸.一,atrailr413-actincontrolq!qqq9pma(nmoi/l)pma(nmoi/l)fig4activationofpkcupregulatedtheexpressionoftrailr4inthplcehs.thplcellswereincubatedwithdifferentconcentrationsofpkcactivator(pma)for24h.trailr4expressionwasassessedbyweslemblotting.upregulationoftrailr4wasfound.a:westernblottingimage.b:analysisofwesternblottingfrom3experiments.面s./1,:3.p<o.05contro1.圈4pkc激活后trp一1细胞trailr4表达明显上调还可以拮抗tnf的促白细胞黏附作用,因此被认为是抗炎因子.研究显示trail的表达与c反应蛋白呈负相关,由于c反应蛋白与斑块的稳定性与氧化应激密切相关,提示trail有稳定斑块及对动脉粥样硬化有保护作用.近来有研究发现1型糖尿病患者外周血t细胞表达trailr4明显高于对照组,由于trailr4有上述抑制细胞凋亡的生理作用,提示trail与trail受体相互作用与胰岛b细胞的凋亡有关.巨噬细胞的持续增殖及平滑肌的增生是糖尿病大血管病变的重要病理生理基础,本研究首次发现高糖干预情况下能上调fnip一1细胞及入主动脉平滑肌trailr4的表达,且trailr4的上调随pkc激动剂浓度增加而增强.提示thp一1细胞于高糖情况下凋亡减少,从而间接促进增殖,加剧炎症反应的恶化.本研究显示trailr4可能成为干预糖尿病血管并发症的靶点之一.高糖情况下pkc通路的激活是糖尿病最重要的发病机制之一.pkc通路的激活不仅是糖尿病微血管病变的主要因素,也在动脉粥样硬化中扮演重要角色.由pkc激活介导的巨噬细胞增殖是糖尿病血管并发症的重要病理生理过程,但其中巨噬细胞增殖的靶点至今尚未明确.本研究应用不同剂量pkc受体激动剂pma干预巨噬细胞后,发现trailr4表达上调,说明trailr4的表达受pkc调控,由于trailr4具有抑制凋亡作用,因此提示?855?在高糖激活pkc所导致的巨噬细胞和平滑肌细胞增殖中trailr4扮演了重要角色,高糖刺激后巨噬细胞和平滑肌细胞trailr4表达的上调对动脉粥样硬化的发病可能起促进作用.参考文献1libbyp,ridkerpm,maseria.inflammationandathero-sclerosisj.circulation,2002,105(9):l135一l143.2vanderlaanpa,rearclonca.thematicreviewseries:theimmunesystemandathemgenesis.theunusumsuspects:anoverviewoftheminorleukocytepopulationsinathero-sclerosisj.jlipidres,2005,46(5):829838.3rossr.atherosclerosis-aninflammatorydiseasej.nenojmed,1999,34o(2):l15126.4zaillig,secchiemp.theroleoftlietrail/trailre-ceptomsysteminhematopoiesisandendothelialcellbiolo-gyj.cytokinegrowthfactorrev,2006,17(4):245257.5ashkenazia.targetingdeathanddecoyreceptorsofthetumournecrosisfactorsuperfamilyj.natrevcancer,2002,2(6):420430.6prietoj,eklunda,patarroyom.regulatedexpressionofintegriasandotheradhesionmoleculesduringdifferentia-tionofmonocyte8intomacmphagesj.cellimmunol,l994,l56(1):191211.7degliespestima,dougallwc,smolakpj,eta1.thenovelreceptortrail?r4inducesnfkappabandpro-tectsagainsttrailmediatedapoptosis,yetretainsanincompletedeathdomainj.immunity,1997,7(6):813820.8falschlehnerc,emmerichch,gerlachb,eta1.trailsign