【doc】辽宁省不同地域稻水象甲分子遗传差异及其意义研究.doc

辽宁省不同地域稻水象甲分子遗传差异及其意义研究辽宁农业科学2006(1):13liaoningagriculturalsciences文章编号:10021728(2006)01000103辽宁省不同地域稻水象甲分子遗传差异及其意义研究李志强,于凤泉,田春晖,孙富余,李2(1.辽宁省农业科学院植物保护研究所,辽宁沈阳110161;2.大连理工大学环境与生命学院,辽宁大连116024)中圈分类号:$435.112.6文献标识码:a外来入侵害虫稻水象甲(lissorhoptrusoryzophiluskusche1)在辽宁省迅速传播蔓延,成为水稻主要害虫,对北方稻区水稻生产构成严重威胁.探索外来入侵有害生物传播蔓延途径,过程等机理,将为控制或减缓其传播蔓延和实施检疫防治措施提供依据.但是,历史事件的追踪,传播蔓延过程的直接观测均不易实际操作.所幸的是,稻水象甲营孤雌生殖,其不同群体之间无遗传交流,只有群体物理混合,而分子生物学技术又为不同群体的遗传背景差异提供了强有力的手段20】.本研究基于对稻水象甲在辽宁省传播过程的直观判断,选择了典型地域的样本,进行rapdpcr检测,证实了不同地域稻水象甲群体的遗传差异,分析了这一差异性对追溯稻水象甲传播过程和开展其传播蔓延控制的意义.1材料与方法1.1不同地域稻水象甲群体取样根据不同地域稻水象甲首见发生危害的时问早晚选取采样地点.2005年6月中旬分别在辽宁省的盘锦市大洼,锦州市凌海,葫芦岛市绥中,大连市瓦房店,丹东市东港和沈阳市东陵等6个地点采集稻水象甲成虫,分别记为poplpop6,一25下冻死,保存备用.1.2dna提取成虫样品转入液氮中冷冻,每样取2o头加液氮研磨,加入提取缓冲液(10mmol/ltris-hciph值8.0,0.immol/ledta,0.5%sds,5og/mlproteink)2ml,5o6o下保温3h,加等体积的酚混匀,12000r/min离心10min,取上层液加同体积酚/氯仿抽提1次,2/3体积的异丙醇沉淀,75%乙醇洗沉淀后溶于400lte中,加rnase在37下消化30rain,一20下保存备用.1.3rapd过程用williams(1990)随机扩增优化方法l4j.25l反应液:含2utaq酶,2.510(buffer(1.5mmol/lmgch+10mmol/ltris-hci+5ommol/1.kci+1%明胶),dntp(每种200/mol/l),primer(10pmol/l)1.0t,l,dna模板1.0t,l(100ng).反应程序:94预变3min,94变性30s,35退火40s,72延伸2min,40个循环后7210min.1.4电泳,染色与拍照rapd扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上恒压电泳2h,eb染色,紫外分析仪下观察拍照.1.5遗传差异分析方法选择重复性好,亮度较强的条带进行统计分析.电泳图谱上同一rapd位点上有电泳带者赋值1,无电泳带者赋值0.按nei(1987)方法5】计算样本间遗传距离d和遗传相似系数i,用popgen(vet3.2)软件进行遗传距离计算与聚类分析.1.6分子遗传差异的意义分析确定不同地域稻水象甲分子遗传的差异性,结合不同地域始见发生危害时间不同,发生量的差异6】推断稻水象甲在辽宁省的传播蔓延过程,结合地理信息和寄主分布调奢数据分析稻水象甲的传播途径,提出阻止或减缓其传播蔓延的措施.1.7引物与试剂rapd实验引物设计为含1o个核苷酸的随机引物,由大连宝生物工程有限公司合成,extaq酶反应系统亦购自该公司;proteasek,rnasea购自promega公司;琼酯糖凝胶为西班牙产;其他试剂均为国产分析纯试剂.2结果与分析2.1不同地域样本的rapd谱带分析用4o条随机引物对辽宁省的6个地域稻水象甲样本dna进行随机扩增,筛选出1o条有效引物,其中表现较好的引物8条.对6个样本dna扩增,共得到117条清晰的多态性谱带,片段大小为5004000bp(图1).不同引物扩增6个样本的多态性位点统计如表1.结果表明:多态性谱带最多的引物为opy一18,23条,最少的引物为op()-l8,8条,不同引物的扩增产物具有显-收稿日期:20060110基金项目:辽宁省科技攻关项目外侵有害生物传播蔓延机理与持续控制技术研究(2004214001)及辽宁省基金项目稻水象甲迁移扩散规律及其利用研究(20032090)?2?辽宁农业科学2006钷着差异.不同样本间,以绥中样本多态性谱带为最多,26条.东港样本为最少,1o条,不同样本的扩增产物亦存在明显差异.2.2不同地域稻水象甲群体问亲缘关系分析视每个扩增的dna片段为可区分的rapd标记,赋值计算后,得到6份样本间的遗传相似系数i和遗传距离d(表2).该结果表明,样本2与样本4的的遗传相似系数最大,遗传距离最小;而样本3(绥中)与其他样本间遗传相似系数均较小,遗传距离较大.聚类分析结果表明,样本2与4首先聚为一类;样本1与6再聚为一类;样本3远离其他样本,亲缘关系与其他样本最远(图2).表18种引物扩增6个不同地域稻水象甲样本的rapd多态性位点统计表2不同地域稻水象甲群体的遗传相似系数与遗传距离.遗传相似系数1遗传距离d样本pop1pop2pop3pop4popop6p0p1p0p2p0p3pop4pop5.pop6poplpop20.9366一一0.0655一一p0p30.90310.8675一一010190.1421一一p0p40.89650.98780.8643一一0.1141o.01220.1468一一p0o50.8356092320.77980.9448一一0.178500799024870.0568一pop60.94220.89770.82330.85480.7777一一0.0595010840,l944015680.2514一一厂l陵f-0o02(t.膀1.一.二pop5;图2辽宁省6个不同地域稻水象甲群体亲缘关系2.3稻水象甲分子遗传差异的意义分析rapipcr实验结果表明,绥中稻水象甲群体与辽宁省其他地区的群体具有较大的遗传差异,而辽宁省其他地区稻水象甲群体的遗传差异性较小.这表明,辽宁省的稻水象甲具有不同来源,绥中群体具有独立来源,其他地区的群体为同一个来源,或者系几个来源却具有充分的群体混合,从发生时间顺序上看,属同一来源的可能性更大.从辽宁省的不同地域及其邻近地区报道稻水象甲发生危害的时间及群体数量变化趋势上看,与东港相邻的朝鲜及与绥中相邻的河北唐山,秦皇岛均在2o世纪8o年代末发生稻水象甲,东港1992年最先检出稻水象甲发生,次年,绥中,丹东其他区县区及庄河均检出该害虫,这说明辽宁东部与西部稻水象甲各具独立的来源.其他地域检出稻水象甲发生危害的时间分别是:瓦房店(1995第1期李志强等:辽宁省不同地域稻水象甲分子遗传差异及其意义研究-3-1996),大洼(1997),东陵(1998),凌海(1999),全省以凌海所在的锦州地区发生最晚,这些地区没有境外群体来源,次第出现稻水象甲危害的事实说明该害虫在奇主相的连续地区上传播蔓延,辽东地区虫源是绥中以外地区群体的基本来源.从地理信息和寄主植物分布情况看,绥中虫源未向锦州,盘锦等地传播的根本原因是:在辽西走廊葫芦岛市区一带为多山地区,缺乏稻水象甲寄主植物(水稻,水生禾本科植物)的连续性,从而阻碍了绥中虫源向东部传播.从稻水象甲传播蔓延主要是在寄主相连续分布上传播的途径看,结合自然情况人为设置寄主间隔能有效地阻止稻水象甲的传播或有效减缓其蔓延速度.研究还表明,稻水象甲自然迁移扩散力较弱,每年的最远扩散范围为2030km.利用这一特点,在疫区周边设置物理的或化学的隔离带,可以有效减缓其传播势头,控制该害虫在全国广大稻区传播蔓延.3讨论本研究首次运用rapd.pcr技术证实了辽宁省不同地域稻水象甲群体遗传差异性,分析并间接验证了稻水象甲的传播过程与途径,结合其他研究结果,探讨了控制稻水象甲传播与蔓延的可能途径.虽然rapd.pcr技术在昆虫学上的应用已有很多研究报道,但在追溯外来人侵有害生物传播过程的历史情况和探索其控制途径方面仍较新颖.稻水象甲已成为我国水稻生产的重大威胁.2005年调查,吉林全省发生该害虫,内蒙古通辽市也发生该害虫,环渤海湾的山东,河北,天津与辽宁均系该害虫的老疫区.北方水稻主产地水稻生产均受该害虫威胁.有必要采集各地虫源,分析其遗传背景的差异,探索害虫来源和主要传播途径,开展较大区域的传播蔓延控制研究.在研究方法上,虽然扩增片段长度多态性aflp标记在种内遗传差异分析方面更为准确,但该项技术较随机扩增多态性dna即rapd更复杂,引物使用等经验积累也较少.本研究将在今后探索整个北方地区稻水象甲的遗传差异性上尝试应用aflp方法.当然,无论是rapd还是aflp,都存在计算机或手工分析多样性位点,通过数学方法比较遗传物质的细微差异,仍具有很多不确定性.但结合常规研究结果开展分析,更具有实用价值.参考文献:1孙富余,田春晖.赵成德,等.稻水象甲种群增长规律初探j.生态,2002.22(10):17051709.2赵怀玲.尤民生.rapd,pcr技术及其在昆虫学研究中的应用综述j.武夷科学,2001.17(6):7381.3张民照,康乐.aflp标记的特点及其在昆虫学研究中的应用j.昆虫,2002.45(4):538543【4williams.j.g.k.eta1.dnapolymorphlsmsamplifiedbyarbitraryprimersareusefulasgeneticmarkers,nucleicacidsres.,1990,18:65316535.5masatoshinei.molecularevolutionarygenetics.columbiauniversitypress.1987.6田春晖.辽宁省稻水象甲虫源积累研究a.成卓敏.农业生物灾害预防与控制研究m.北京:中国农业科技出版社,2005.1o9112.geneticvariabilityanditsimportanceofricewaterweevil(lissorhoptrusoryzophilus)fromdifferentareasinliaoningprovincelizhiqiang,yufengquan,tianchunhui,sunfuyu,liwen.1i(1.instituteofplantprotection,liaoningacademyofagricnlturalsciences,shenyangliaoning110161;2.schoolenviromentalandbiologicalscienceandtechnology,dalianuniversityoftechnology,dalian,liaon-ing116024)abstract:ricewaterweevil(lissorhoptrusoryzophilus)isanimportantpestofpaddyricecropsinliaoningprovincethatwasfirstdescribedasanewalieninvasivespeciesin1992.highqualitydnawassuccessfullyisolatedandrapdwaseffectivelyusedtostudygeneticsimilarityandgeneticvariabilityofthisinsectamong120individualsusingeightprimers.thehighresolutionprovidedbyrandomamplifiedpolymorphicdna(rapds),incombinationwithefficientgeneticdistanceestimators,allowedapreliminarydescriptionoftheecologyandevolutionofthepopulationsofthisinsectinliaoningprovince.theresultsarecompatiblewithauniqueeventofcolonizationandparthenogenesis,followedbythespreadingofthewaterweevilacrossthesurroundingliaoningareas.acomparisonoftheresultsobtainedwithdifferentgeneticdistanceestimatorsispresentedthatshowsuizhonggroup(pop3)issignificantdifferencefromtheotherswhicharegenerallysimilar.itmeadthat:1)populationsofricewaterweevilfromdifferentareahavedifferentorigin;2)itsrapidspreadcausesmainlybyeastpopulat