早期自然流产患者蜕膜组织中PR、PIBF、CSF1和IL15的表达及意义-优秀毕业论文.pdf

at h e s i ss u b m i t t e dt o z h e n g z h o uu n i v e r s i t y f o r t h ed e g r e eo fm a s t e r e 0 0 5 但对照组表达强度均高于研究组 两组相比差异有统计学意义 p 0 0 5 结论 p r p i b f c s f 1 在子宫蜕膜组织中表达强度的降低与早期自然流产关系 密切 是早期自然流产的母体因素复杂网络中的某一微小侧面 关键词早期自然流产蜕膜孕激素受体孕激素诱导的封闭因子集落刺 激因子l白介素1 5 a b s t r a c t e x f a n ds i g n i f i c a n c o fp r p i b f c s findxpressionsa n dn i r n l h c a n c e 1a n d 0 tr k r l i l l5i nd e c i d u ao fe a r l ys p o n t a n e o u sa b o r t i o np a t i e n t s p o s t g r a d u a t ez h i f a n gc h e n s u p e r v i s o rp r o f l it a n d e p a r t m e n to fg y n e c o l o g ya n do b s t e t r i c s t h es e c o n da f f i l i a t e dh o s p i t a lz h e n g z h o uu n i v e r s i t y z h e n g z h o uh e n a n4 5 0 0 14 a bs t r a c t b a c k g r o u n da n do b j e c t i v e s s p o n t a n e o u s a b o r t i o ni sak i n do f a b o r t i o nw h i c he n d sa nu n i n t e n d e d p r e g n a n c yb e f o r e2 8w e e k s i ti s af r e q u e n tp a t h o l o g i c a lp r e g n a n c ya n do f t e n a c c o u n t sf o r15 2 0 i na l lc l i n i c a l l yr e c o g n i z e dp r e g n a n c i e s e a r l ys p o n t a n e o u s a b o r t i o ni sak i n do fa b o r t i o nw h i c he n du s i n t e n d e dp r e g n a n c yb e f o r e12w e e k s e i g h t yp e r c e n t o fa b o r t i o no c c u ri nt h ef i r s t12w e e k so fp r e g n a n c yi nc l i n i c s 1 1 1 e e t i o l o g yo fs p o n t a n e o u sa b o r t i o nc o n t a i n sf a c t o r so fe m b r y oa n dm a t e r n a l i na b r o a d l i t e r a t u r e s a p p r o x i m a t e l y5 0 6 0 o fs p o n t a n e o u sp r e g n a n c yl o s s e sc a nb ee x p l a i n e d b y c h r o m o s o m a la n o m a l i e so ft h ef o e t u s i n f e c t i o u s a e t i o l o g i e s m a t e r n a l e n d o c r i n o l o g yo ra n a t o m i c a lc o m o r b i d i t y b u ts t i l l4 0 5 0 r e m a i n su n e x p l a i n e d a s u b s t a n t i a lp o r t i o no ft h e s eu n e x p l a i n e dc a s e sc a nb ea t t r i b u t a b l et oa na b n o r m a l a b o r t o g e n i ci m m u n er e s p o n s eo ft h em o t h e rt o w a r d sp o t e n t i a la n t i g e n so nt h ef o e t u s i ft h ef a c t o ri so ft h ef o e t u s a n dt h e r em a yb eam i s t a k ei nc h r o m o s o m a lo rg e n e s o t h e r w i s ei ti s c o m p l i c a t e d d o m e s t i ca n da b r o a d s c h o l a rd om a n yt e s t e sa n d r e s e a r c h e s a n dt h e yh a v ek n o w ns o m em a t e r n a lf a c t o r so fs p o n t a n e o u sa b o r t i o n b u t t h ee x a c tm e c h a n i s mi ss t i l ln o tc l e a r r e c e n t l y i n c r e a s i n ge v i d e n c es u g g e s t st h a t p r o g e s t e r o n em a yp l a yas i g n i f i c a n tr o l ei ne s t a b l i s h i n ga na d e q u a t ei m m u n er e s p o n s e d u r i n gt h ee a r l ys t a g eo fs u c c e s s f u lp r e g n a n c y i ti sn e c e s s a r yt od om o r ee x p e r i m e n t s t oe x p l o r e u n e x p l a i n e d t h em e c h a n i s mo fe a r l ys p o n t a n e o u sa b o r t i o nt ot a k e a b s t r a c t 1 t h ee x p r e s s i o n so fp r p i b f c s f 1a n di l 15w e r ef o u n d e di n d e c i d u at i s s u e so fb o t hg r o u p s 2t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ei nt h ee x p r e s s i o np o s i t i v er a t e so f p r p i b f c s f 1b e t w e e nt w og r o u p s p o 0 5 b u tt h ee x p r e s s i o ni n t e n s i t yo ft h r e e p r o t e i np o s i t i v es t a i n e di nd e c i d u at i s s u e so ft h ec o n t r o lg r o u pw e r eh i g h e rt h a nt h a t o ft h e s t u d yg r o u p as t a t i s t i c a l l yd i s t i n c td i f f e r e n c ei nt h ee x p r e s s i o nw a sf o u n d p 0 0 5 c o n c l u s i o n s t h el o w e re x p r e s s i o n so fp r p i b f c s f 1i nd e c i d u at i s s u e sw e r e i n t i m a t e l y a s s o c i a t e dw i t he a r l ys p o n t a n e o u sa b o r t i o n t h i si sal i t t l ep r o f i l eo fc o m p l i c a t e d n e t w o r ko fm a t e r n a lc a u s ei ne a r l ys p o n t a n e o u sa b o r t i o n k e yw o r d ss p o m a n e o u sa b o r t i o nd e c i d u ap r o g e s t e r o n er e c e p t o rp r o g e s t e r o n e i n d u c e db l o c k i n gf a c t o r c o l o n ym i m u l m i n gf a c t o r i n t e r l e u k i n 15 v 附图 2 6 综述部分 性激素及p i b f 在妊娠期免疫调节的研究进展 2 9 参考文献 3 6 附录部分 英文缩写注释 3 9 个人简历 4 0 工作及攻读硕士学位期间发表的论文及研究成果 4 l 致谢 4 2 v l 前言 早期自然流产患者蜕膜组织中p r p i b f c s f 1 和 i l 1 5 的表达及意义 研究生陈志芳 导师谭丽 郑州大学第二临床学院妇产科 河南郑州4 5 0 0 1 4 上 j 一 刖吾 自然流产是指妊娠在2 8 周前终止者 是妇科常见病 其发生率以往报道大 约占全部临床确诊妊娠的1 5 2 0 早期自然流产是指发生于1 2 周前的流产 占 全部自然流产的8 0 从严格意义上来说 这些报道统计的比率是不完全准确 的 因为胚胎在宫腔内着床后能被目前临床检测手段查出以前即发生流产者无 法统计 况且 近年来由于社会 心理 环境因素的影响 不孕不育的患者增 加 通过体外受精 胚胎移植 i v f e t 辅助生育者增加 移植后未能成功者 从某种意义上也应视为早期流产 因此 自然流产特别是早期自然流产发病率 远高于目前的统计数值 导致自然流产的原因包括胚胎方面和母体方面 国外 报导大约5 0 6 0 的自然流产是因为胎儿染色体异常 感染因素 母体内分泌或 解剖异常 有4 0 5 0 的自然流产不能解释 在这些不能解释的自然流产中一大 部分比例是由于母体对胎儿蛋白抗原的不正常的免疫反应造成的 如果是胚胎 的原因 绝大多数是胚胎的染色体和 或基因出现异常 如果是母体的原因 因 太复杂而难查清楚 国内外研究者也做了大量的实验和探索 初步探讨出了一 些引起自然流产的母体因素 但远不能揭示完全其中的奥秘 其确切机制尚未 明了 近几年来 国内外研究者也做了大量的实验和探索 但远不能揭示尽其 中的奥秘 通过临床观察 大量的动物实验及实验室培养有关组织细胞的研究 初步探讨出了一些引起自然流产的母体因素 最近 逐渐增多的证据推测孕激 素在成功妊娠的早期阶段在建立免疫抑制反应中起非常重要的角色 但这远远 前言 不能满足临床解决问题 需要进一步实验探索不明原因的早期自然流产的机制 对临床防治这一疾病具有重要的理论指导意义 正常妊娠期 母体子宫能接受半异己甚至全异己 接受非亲赠卵或赠胚 基因的同种异体移植物 使胚泡粘附并着床于子宫蜕膜中生长发育 母胎界面 之间形成一个特殊的微环境 构成一个庞大而复杂的调节网络 参与其中的调 节者除了性激素及其受体外 还包括大量的细胞因子 免疫因子 细胞粘附分 子 糖结合物等的交互调节 这个网络中的任一环节或调节者出现异常 牵动 其他的因素系列式或瀑布式爆发异常 均可导致自然流产 尤其是还处在生长 略势敏感的早期妊娠流产 已经知道 适当的子宫内膜发育对胚胎正常着床是 必需的 为达到一次成功的妊娠 卵巢提供给子宫内膜以性激素的刺激基础 在卵巢分泌的雌激素与孕激素的作用下子宫内膜表达胚胎粘附和侵入所需的关 键分子 月经周期的卵泡期 随着卵泡的发育 雌激素分泌逐渐增加 子宫内 膜增殖 腺上皮不断生长 卵泡发育成熟并排卵与成熟 排卵后 在黄体分泌 的孕激素作用下 子宫内膜增殖期转变成分泌期 这个时期的子宫内膜组织中 的各种成分 如腺上皮 表面上皮 基质细胞 基质血管和细胞外基质等 发 生了一系列改变 促使子宫内膜对胚胎着床具有容受性 一些变化持续时间较 长 人类胚胎着床时期子宫内膜上皮细胞中的雌激素受体和孕激素受体表达下 降 但在基质中没有明显变化 这是孕激素依赖性的下调机制 实验证明 当 孕激素减少时 这一下调机制被延迟 当孕激素增加 能诱导许多蛋白的表达 这些蛋白对调节着床非常重要 其中子宫内膜粘蛋白的表达调节中能看到孕激 素和成活胚胎之间的相互作用 着床期子宫内膜组织中 粘蛋白的表达和分泌 增高 促使胚胎选择性粘附于着床部位 而在着床部位以外的子宫内膜组织粘 蛋白的表达被囊胚下调 则不能发生粘附 另一方面 已经证明在以孕激素作 用为主导的黄体期子宫内膜组织还可以合成许多细胞因子 这些细胞因子抑制 母体对胚胎的免疫排斥 诱导母体产生免疫耐受 支持胚胎着床 进一步生长 发育 使妊娠得以维持下去 孕激素对胚胎着床及着床后妊娠的维持起关键作用 孕激素不仅能使子宫 对外界刺激的敏感性降低 传导性下降 抑制子宫收缩 还能抑制母胎界面的 免疫排斥反应 通过诱导多种免疫调节因子的产生 孕激素通过与靶细胞内表 达的孕激素受体 p r 结合发挥作用 孕激素对靶组织细胞产生作用的强度与 该组织细胞内表达的孕激素受体的量和受体的更新能力有关 有实验表明 p r 2 日u 磊 特异性单克隆抗体能与大多数妊娠期淋巴细胞反应 而与非妊娠期的淋巴细胞 不反应 在妊娠期p r 阳性淋巴细胞数量增加 而在一些病理妊娠如复发性流 产和早产的妇女其外周血淋巴细胞p r 阳性率显著低于正常妊娠者f l j 有实验表 明 正常妊娠妇女外周血淋巴细胞p r 阳性率增加 受子宫内膜局部微环境中高 浓度孕激素调控下 在蜕膜组织中p r 阳性率远高于外周血淋巴细胞 孕激素受 体广泛表达于蜕膜上皮细胞尤其是母胎界面的蜕膜间质淋巴细胞中 当孕激素 与蜕膜淋巴细胞表达的孕激素受体结合后 诱导蜕膜淋巴细胞合成一种封闭性 的抗体 孕激素诱导的封闭因子 p r o g e s t e r o n er e c e p t o rp r o g e s t e r o n e i n d u c e d b l o c k i n gf a c t o r 大量的研究表明 在妊娠期p i b f 诱导妊娠母体产生t h 2 偏倚 型免疫反应 介导母胎间的免疫耐受 2 1 并且抑制n k 细胞的活性和影响花生四 烯酸的代谢 研究认为p i b f 在妊娠期帮助胚胎逃避母体免疫监视 使母体对胚 胎产生免疫耐受 起抗流产的作用 p o l a r 等人实验发现正常妊娠母胎界面间合 成p i b f 持续增加 而病理妊娠中没有这种现象 而且还发现正常妊娠的妇女外 周血淋巴细胞在孕期任何阶段p i b f 的表达水平比同期有流产或早产倾向的妇女 都要高 复发性自然流产者表现更为明显 有实验发现接受i v f e t 者及复发性 自然流产患者用丈夫淋巴细胞免疫治疗后 血中p i b f 的表达明显升高 治疗后 妊娠成功率提高 集落刺激因子 l c s f 1 调节胚胎着床及与胚胎发育的关系近年来受到广 泛关注 子宫腔内的c s f 1 主要由子宫内膜间质细胞合成 子宫内膜问质细胞 在黄体分泌的雌 孕激素的作用下逐渐发生分化 合成和分泌c s f 1 的量逐渐 增加 而且以妊娠初期子宫内膜中的表达量最高 非孕期的增生期子宫内膜间 质中表达量最低 c s f 1 的受体则表达于胚泡滋养细胞及胎盘绒毛细胞 动物实 验发现 小鼠妊娠后第一天 输卵管分泌液中即可测到c s f 1 m r n a 和c s f 1 蛋白 第五天宫腔液中测到的c s f 1 的量是非孕期的5 倍 充分说明c s f 1 与 胚泡着床密切相关 体外实验发现c s f 1 促进受精卵由两细胞期向胚泡期转化 调节胚泡形态变化 促使胚泡形态变化与子宫内膜分化同步 达到特殊的 种植 窗1 2 1 期 当宫腔内的c s f 1 与胚胎滋养细胞表面受体结合后便发挥粘附作用 调节胚泡与子宫内膜的识别和粘附 c s f 1 还促进滋养细胞生长移行 加速胚泡 植入蜕膜 w i k t o r 等人动物实验发现 c s f 1 基因突变的小鼠模型 由于c s f 1 缺失 胚胎着床能力低下 说明c s f 1 对胚胎着床的重要性 但是目前关于c s f 1 对妊娠影响的实验资料较少 有必要做更多实验揭示c s f 1 与早期自然流产的 3 触 子宫内膜n k 细胞在多方面因素的刺激下高表达抑制性受体 而不是细胞毒 性活化 维持母胎界面间的免疫平衡 阻止母体对胚胎产生免疫排斥 另一方 面 子宫内膜n k 细胞又分泌许多细胞因子如c s f 1 g m c s f i f n 小l i f 等 弘卅 促进滋养细胞生长和绒毛侵入 促进滋养层血管生成和重建 促进胚胎植 入和胎盘早期的生长发育 因此 子宫内膜n k 细胞数量及活化异常 将导致自 然流产 早产及其他类型的病理妊娠 鉴于临床上早期自然流产病因复杂 缺 乏预知性 虽然目前有人用主动或被动免疫治疗早期自然流产取得一定的疗效 但治疗机制仍不是十分明确 因此 研究子宫内膜n k 细胞的调节因子及其抑制 性受体的激活方式 将有助于了解母胎界面间免疫平衡的调控机制 能进一步 阐明早期自然流产的发生机制 为临床研究和防治此类疾病提供新思路 研究发现子宫内膜n k 细胞表达i l 1 5 受体 蜕膜中检测到i l 1 5 m r n a 的 存在 表明i l 1 5 在子宫内膜蜕膜化过程中参与调节内膜n k 细胞的增殖与活化 0 7 1 a s h k a r 等发现i l 1 5 基因敲除的小鼠妊娠过程中子宫内膜n k 细胞缺失 当 接受正常的小鼠骨髓移植后 子宫内膜n k 细胞数量及活性回复正常 s l 这充分 表明了子宫内膜蜕膜化过程中i l 1 5 对子宫内膜n k 细胞的恢复及分化成熟起重 的作用 目前认为i l 1 5 是子宫内膜n k 细胞重要的调节因子 是子宫内膜种植 4 白高较激胞邮现发激增凡分识接 前言 窗口期表达上调的基因之一 其自身又受多种因素的调节 在子宫内膜蜕膜化 过程中 孕激素能增加i l 1 5 基因的表达和蛋白的合成 9 1 体外培养子宫内膜间 质细胞发现i f n 吖和p g e 2 能增加i l 1 5 的表达 1 0 1 但有些文献报道复发性自然 流产患者外周血i l 1 5 的水平高于正常妊娠组 但未见i l 1 5 在病理妊娠与正常 妊娠子宫局部表达情况比较的相关文献 p r p i b f c s f 1 和i l 1 5 在早期自然流产的发生 发展中的作用 最近几 年来 成为研究的热点 到目前为止 相关报道的文献很多 但结果差异很大 甚至出现相反的结论 没有提出哪一个因子或蛋白对自然流产的发生起决定性 作用 本实验采用免疫组织化学s p 法检测两组蜕膜组织中p r p i b f c s f 1 和i l 1 5 蛋白的表达情况 比较其在两组的表达差异 探讨早期自然流产母体因 素的发病机制的一些方面 为临床防治早期自然流产提供理论依据 5 材料方法 1 1 材料 材料与方法 1 1 1 研究对象 研究组 选取2 0 0 9 年9 月至2 0 1 0 年5 月在郑州大学第二附属医院妇产科 门诊就诊的早期自然流产妇女2 5 例 停经1 2 周以内 有或无临床症状 经超 声检查证实宫腔内有孕囊声像无胎心搏动 或者曾检查有胎心搏动后来消失的 患者 患者从停经至采集标本时间段内未服用任何药物 无内科病史 平均年 龄 2 2 3 9 岁 3 0 8 1 4 岁 平均孕周 7 1 1 周 8 7 4 1 3 周 对照组 选取同期在本院门诊自愿要求人流的正常早期妊娠妇女 经超声 检查证实胎心搏动良好 无内科疾病史 共2 0 例 平均年龄 2 1 3 9 岁 2 8 8 4 1 5 岁 平均孕周 7 1 l 周 9 3 4 1 7 周 两组妇女的平均年龄 平均孕周差异无统计学意义 1 1 2 标本收集 用负压吸宫的方法 术后立即用生理盐水漂洗收集的蜕膜 洗净红细胞 立即置于1 0 的福尔马林液中固定 2 4 小时后脱水 石蜡包埋 2 仪器和试剂 1 2 1 主要实验仪器 电热恒温培养箱 m h 3 1 5 切片机 电热恒温干燥箱 4 2 0 a 恒温水箱 冷冻台 离心机 光学显微镜 光学显微照相系统 上海安亭科学仪器厂 德国m i c r o m 公司 上海跃进医疗器械厂 上海佳敏仪表公司 孝感市宏业医用仪器有限公司 北京医用离心机厂 o l y m p u s 公司 德国l e i c a 公司 6 材料方法 中性树胶 顺德格兰仕电器有限公司 北京中杉金桥公司 晶美科技有限公司 医用手套 滴管 吸水纸等 北京博奥森生物技术有限公司 北京博奥森生物技术有限公司 北京博奥森生物技术有限公司 北京博奥森生物技术有限公 北京中山生物技术有限公司 北京中山生物技术有限公司 北京中山生物技术有限公司 北京中山生物技术有限公司 北京中山生物技术有限公司 北京中山生物技术有限公司 其它试剂 双氧水 无水酒精及稀释后不同浓度的酒精 丙酮 二甲苯 盐酸 l o 福尔马林液 3 氨丙基3 乙氧硅烷 a p e s 混合液等 1 3 实验方法 1 3 1 标本制备 将固定2 4 小时后的蜕膜组织标本 在本院病理科随时脱水 石蜡包埋 待 蜡块收集齐统一切片 每个蜡块连续切片3 张 厚4 9m 备用 1 3 2 免疫组化原理及实验步骤 s p 法原理 抗原与一抗 即特异性多克隆抗体 结合后 再与生物素化二 抗结合 加辣根酶标记链霉素工作液 d a b 被酶分解后显色 在光镜下可见到 标本组织细胞浆或核内的显色颗粒 载玻片处理 1 清洁 将载玻片浸泡入1 0 的稀盐酸溶液内1 2 小时 取 出后用自来水冲洗2 小时 再用蒸馏水反复冲洗3 遍 在烤箱中烤干 再放于 7 材料方法 无水酒精中浸泡5 分钟 取出晾干备用 2 防脱片 将a p e s 液用丙酮稀释 比例为l 5 0 的工作液 把清洁过的载玻片放于此工作液中3 0 秒 取出晾干5 分钟 再放入纯丙酮液中洗3 次 后取出烘干保存备用 p b s 液的配制 把7 9 9 n a c l 0 2 9 k c i 0 2 4 9 k h2p 0 4 4 0 9 n a2h p 0 4 加入 8 0 0 毫升蒸馏水中 用盐酸调节溶液p h 值至7 4 再加入蒸馏水至l 升 保存 在4 摄氏度冰箱中备用 e d t a 抗原修复液的配制 将0 1 摩尔浓度的柠檬酸9 毫升和0 1 摩尔浓度 的柠檬酸三钠4 l 毫升加入4 5 0 毫升蒸馏水中 混合液5 0 0 毫升备用 h e 染色分辨组织 常规h e 染色 显微镜下组织结构清晰 细胞核被染成 蓝色 细胞浆及其他结构被染成红色 视为较好组织切片 免疫组化实验步骤 参考北京中山生物技术有限公司提供的免疫组化实验 说明书 1 将石蜡切片脱蜡至水 4 u m 的组织切片置于处理过的载玻片上 放于 6 0 摄氏度的烤箱中烤l 小时 以防组织脱片 然后置于二甲苯i i i 中脱蜡各 1 5 分钟 再用梯度酒精脱水 1 0 0 9 5 8 5 7 5 各5 分钟 最后用蒸馏水冲 洗1 0 分钟 2 将组织切片置于3 的双氧水中室温孵育1 0 分钟 消除内源性过氧化 物酶的活性 3 蒸馏水冲洗 p b s 液冲洗共3 次 每次5 分钟 4 抗原修复 将e d t a 抗原修复液加热至沸腾 将组织切片置于其中9 5 下1 0 分钟 室温下冷却3 0 分钟 p b s 冲洗共3 次 每次5 分钟 5 滴加山羊血清工作液封闭 室温孵育2 0 分钟 6 倾去血清 滴加适当比例稀释的一抗 3 7 c 孵育6 0 分钟 通过一抗 不同浓度实验对比 此次购买的北京博奥森生物技术有限公司的兔抗人多克隆 抗体抗 p r 兔抗人多克隆抗体抗 p i b f 兔抗人多克隆抗体抗 c s f 1 兔抗人多 克隆抗体抗 i l 1 5 的最适浓度均是l 2 0 0 1 p b s 冲洗共3 次 每次5 分钟 2 滴加生物素标记的二抗工作液 3 p b s 冲洗共3 次 每次5 分钟 4 滴加辣根酶标记链霉素工作液 5 p b s 冲洗共3 次 每次5 分钟 8 3 7 c 孵育2 0 分钟 3 7 2 孵育2 0 分钟 细胞结构清楚无黄色颗粒记作阴性 1 5 统计方法 使用s p s s1 3 0 系统软件包对结果数据分析 两样本资料比较 计数资料样 本率比较采用妒检验和f i s h e r s 确切概率法 对两组结果采用两样本等级资料的 秩和检验 以p 0 0 5 但研究组p r 阳性与强阳性表达分 别为6 例和2 例 而对照组分别为1 0 例和5 例 经秩和检验结果表明两组妇女 蜕膜组织中p r 表达强度差异有统计学意义 p o 0 5 研究组p i b f 阳性与强 阳性表达分别为6 例和2 例 对照组分别为8 例和5 例 经秩和检验结果表明 两组妇女蜕膜组织中p i b f 表达强度差异有统计学意义 p o 0 5 研究组c s f 1 阳 性与强阳性表达分别为8 例和2 例 而对照组分别为9 例和4 例 经秩和检验 结果表明两组妇女蜕膜组织中c s f 1 表达强度差异有统计学意义 p o 0 5 研究组i l 1 5 的表达 与 卅 分别为6 例和2 例 而对照组分别为4 例 和1 秩和检验可以看出两组i l 1 5 表达强度差异无统计学意义 p 0 0 5 两 组相比较阳性率及表达强度差异均无统计学意义 p o 0 5 表4 图1 3 1 4 1 5 1 6 1 2 讨论 讨论 妊娠的建立和维持是胚胎与母体子宫相互影响 相互协调适应的结果 在 母胎界面间不同的时间及空间均发生着剧烈的变化 形成一个特殊的微环境 细胞和激素免疫反应调节是必需的 构成一复杂的调节网络 性激素 尤其是 孕激素与靶细胞内其受体结合 转移至核内促使特定基因的转录和新蛋白的合 成 它们通过旁分泌或自分泌的方式触发一系列 下游分子事件 直接或间接参 与调控这个过程 这个过程成功与否 免疫反应是非常重要的 母胎界面间形 成复杂而特殊的免疫调节网络 早期自然流产可看作是免疫排斥的结果 是母 胎界面间免疫平衡遭到了某种形式的破坏的结果 更进一步讲自然流产是内分 泌 免疫 炎症反应失衡的结果 因此 免疫因素在早期自然流产患者是重要 的因素 也是防治此病的重中之重 在灵长类动物中 胚胎着床是一个非常复杂有序的生理过程 是指受精卵 发育至胚泡植入母体子宫内膜的过程 在胚泡着床之前 其营养主要来自于卵 细胞胞浆 随着卵裂和细胞分化 胚胎需要的营养越来越多 胞浆中的营养物 质是远远不够的 在游走到宫腔之前 可以从输卵管分泌液中获得 胚泡游走 到宫腔后必须及时着床从母体获得充足的营养 才能够满足胚胎发育所需 这 似乎是一个简单的生理过程 事实上每一个新生命的起点便开始了生存的艰难 历程 着床时 胚泡必须发育至透明带消失 胚泡表面的滋养细胞直接与子宫 蜕膜表面接触 这个时间大概在受精后5 6 天 胚泡表面分泌蛋白溶解酶 溶解 子宫内膜程度超过子宫内膜的保护性抑制作用 这个过程包括胚泡与母体子宫 相互识别 至于胚泡与母体之间怎样相互传递信息 传递多少信息 本质如何 所有这些问题目前的研究不能清楚的解答 有待于大量的研究 目前的研究证 实 胚泡通过分泌激素给母体传递信息 母体在这些信息的指导下 内分泌及 子宫发生特殊的转化 子宫腔分泌液不同于非孕时期 子宫腔液中出现一些特 殊的蛋白 动物实验证明 这些蛋白量和质都随性激素的变化而变化 据分析 子宫腔液蛋白成分中以子宫球蛋白最特异 实验证明 子宫腔液球蛋白的合成 及分泌严格受到孕激素及雌激素的调控 在胚泡着床过程中子宫腔液球蛋白促 使胚泡发育和胚泡与子宫的同步化发育 可以说这些子宫腔液中的特殊蛋白对 胚泡着床起非常关键的作用 近些年 有研究人员试图通过干扰子宫腔液球蛋 1 3 讨论 白的合成和分泌来调控胚泡着床 试想 用这种方法有望找到更方便和科学的 避孕方法 还有望提高辅助受孕的成功率和防治早期自然流产 3 1 孕激素受体 p r 在蜕膜组织中的表达及意义 目前 灵长类动物着床的激素调控机制并不是很清楚 动物实验发现 如 果在妊娠第一天切除小鼠的卵巢 胚泡不能着床 当给予外源性的孕激素 着 床仍然能够继续维持下去 如果给予未孕的小鼠外源性的孕激素子宫内膜也可 发生胚泡着床期时的内膜分泌活动变化 这些实验说明胚泡着床主要是孕激素 起关键性的作用 雌激素在胚胎着床过程中起易化作用 在人月经周期的卵泡 期 发育中的卵泡分泌雌激素逐渐增加 子宫内膜上皮不断增生 排卵后 黄 体形成 孕激素大量分泌 子宫内膜转变为分泌期 子宫内膜上皮细胞 基质 细胞 细胞外基质 间质血管都发生一系列的变化 这些变化以适应于着床 子宫成为适合胚胎着床的内环境 使子宫内膜对胚胎产生容受性 一些变化持 续时间较长直至妊娠早期 在胚胎分泌的绒毛膜促性腺激素的作用下 月经黄 体转变为妊娠黄体 维持高浓度的性激素环境 使子宫内膜进一步发生蜕膜样 变 孕激素对子宫内膜的致敏性和接受性是不可缺少 起关键性作用 孕激素 通过与靶细胞内其受体发挥作用 促使相关基因特异性表达 导致新蛋白的合 成 不同的蛋白起特异的作用 也可能相互影响 相互协调 促使子宫接受侵 入的胚胎而不排斥 人类 子宫内膜甾体激素受体与相应的激素之间的相互作 用机制已经基本清楚 月经前期子宫内膜上皮细胞的细胞质中即出现高浓度的 雌激素受体 至子宫内膜增殖晚期 雌激素受体浓度明显增加 雌激素与受体 复合物转移至核内并蓄积 这很快引起有关基因的转录和新蛋白的合成 特别 是孕激素受体的合成并转移至核内 排卵后黄体分泌大量的孕激素 但是孕激 素抑制雌激素受体的合成 也抑制自身受体的继续大量合成 因此 分泌晚期 子宫内膜中的性激素受体的数量有所下降 从子宫内膜发育至胚胎可着床状态 是一系列性甾体激素不断变化与相应受体相互作用的结果 另有研究报道 胚 胎着床时期子宫内膜上皮细胞核内的雌激素和孕激素受体均是下降的 但是在 基质细胞中却没有明显的变化 这种变化实验证实是孕激素诱导和依赖性的 当孕激素缺乏时 这一机制发生迟延现象 在着床窗口期孕激素增加并诱导许 多蛋白的表达 这些蛋白对胚胎着床非常重要 相反地子宫内膜上皮中雌激素 1 4 讨论 和孕激素受体的下调可能是通过问质细胞旁分泌或性激素的反馈抑制功能实现 的 对孕激素受体的研究相对比较成熟 它属于核受体超家族成员 孕激素发 挥作用必需与靶细胞内的受体结合 成为基因转录调节因子 启动特定基因的 转录 i 正常情况下 在胚胎植入前后以及妊娠维持过程中 子宫内膜微环境 中孕激素的浓度以及蜕膜局部孕激素受体的量都很高 目前临床上用的口服流 产药米非司酮即是孕激素受体阻断剂 其作用是通过米非司酮竞争性与蜕膜中 的孕激素受体结合 结合后但没有相应地孕激素与受体结合的生物效应 使体 内孕激素无法与受体结合而发挥作用 引起蜕膜的凋亡和坏死 从而达到流产 的目的 这说明孕激素受体的表达和功能对妊娠的维持是至关重要的 如果蜕 膜中孕激素受体的表达质与量异常都可能促使妊娠无法维持 导致自然流产的 发生 大量的实验资料结果证实早期自然流产和复发性自然流产患者的蜕膜组 织中孕激素受体异常或低于正常妊娠组妇女 从临床上用孕激素治疗早期自然 流产或i v f e t 后大量补充孕激素并未取得理想的妊娠结果这一事实 从某种程 度上说明体内高浓度孕激素水平不能发挥作用 孕激素受体的缺乏或功能异常 可能起重要作用 因此有人提出不建议用孕激素作为先兆流产保胎治疗的常规 用药 据研究表明 妊娠期淋巴细胞对孕激素的敏感性提高 进一步的实验证 实是淋巴细胞内孕激素受体的水平增加 即孕激素结合位点增多 在蜕膜组织 中孕激素受体阳性的t 淋巴细胞 即激活的t 淋巴细胞以表达t 6 受体为主 这 种受体不是m h c 限制性识别抗原 因此 对胚胎滋养层细胞以表达非经典的 h l a c e g 抗原不产生免疫排斥 丫6 受体阳性的t 淋巴细胞在妊娠子宫蜕膜中 的表达具有激素依赖性 l2 1 淋巴细胞内的孕激素一度引起许多学者的争论 有 人证实孕激素受体广泛表达于淋巴细胞 骨髓瘤细胞 浆细胞 n k 细胞 巨噬 细胞等细胞核内 c h i u 等人发现复发性流产患者经主动免疫治疗后血淋巴细胞 孕激素受体表达增高 在复发性流产或早产的患者外周血淋巴细胞孕激素受体 显著低于正常妊娠者 还有研究表明妊娠子宫微环境中的淋巴细胞比外周血淋 巴细胞孕激素受体水平增高 因此可以看出孕激素受体在孕期与非孕期不同 而且妊娠期不同部位 不同组织细胞孕激素受体表达量也是不同的 所以检测 妊娠早期子宫微环境中的孕激素受体对于预测妊娠结局非常重要 据研究人孕激素受体属于核受体蛋白 分子量大约为2 0 11 0 k d 结构由几部 分组成 即与激素结合的配体结合区 铰链区 与d n a 结合区 转录激活功能 1 5 讨论 区 还具有核定位信号 此结构位于铰链区 具有活性度高的特点 孕激素受 体具有特异性高 高亲和力 受雌孕激素诱导的特点 孕激素受体至少有两种 亚型 a 型和b 型 由位于人染色体l l q l 3 同一基因编码 但受不同启动子控 制转录合成的两种氨基酸长度及分子量不同的蛋白 1 3 1 4 p r a 长度大约是7 9 6 个氨基酸 分子量大约是9 0 k d p r b 有9 3 3 个氨基酸 分子量大约是1 2 0 k d 二者其功能也相去甚远 p r b 比p r a 活性较强 且p r a 对p r b 具有抑制作用 p r a 还具有抗雌激素的作用 而p r b 没有此作用 有人推测孕激素受体亚型的 变化与早期自然流产有关 而且实验发现早期自然流产患者孕激素受体各亚型 表达水平不同于正常妊娠者 本实验不予讨论 只从宏观水平讨论p r 的表达 本实验结果显示 早期自然流产与正常妊娠两组妇女蜕膜组织均有p r 阳性 细胞检出 早期自然流产组2 5 例妇女中有2 0 例呈阳性表达 5 例呈阴性表达 阳性表达率为8 0 正常妊娠组2 0 例妇女中有1 7 例呈阳性表达 3 例呈阴性表 达 阳性表达率为8 6 两组样本阳性表达率差异无统计学意义 p 0 0 5 但 研究组p r 阳性与强阳性表达分别为6 例和2 例 而对照组分别为1 0 例和5 例 经秩和检验结果表明两组妇女蜕膜组织中p r 表达强度差异有统计学意义 p 0 0 5 研 究组p i b f 阳性与强阳性表达分别为6 例和2 例 对照组分别为8 例和5 例 经 1 9 讨论 秩和检验结果表明两组妇女蜕膜组织中p i b f 表达强度差异有统计学意义 p o 0 5 研究组c s f l 阳性与强阳性表达分别为8 例和2 例 而对照组分别为9 例和4 2 0 讨论 例 经秩和检验结果表明两组妇女蜕膜组织中c s f 1 表达强度差异有统计学意 义 p 0 0 5 研究组i l 1 5 的表达 与 卅 分别为6 例和2 例 而对 照组分别为4 例和l 秩和检验可以看出两组i l 1 5 表达强度没有显著性差异 p 0 0 5 两组相比较阳性率及表达强度均无显著性差异 p 0 0 5 早期自然 流产妇女与正常妊娠妇女蜕膜组织中i l 1 5 表达的阳性率及强度均无显著性差 异 可能i l 1 5 对早期妊娠的影响机制复杂 本人认为有必要做更多的实验来证 实在早期妊娠子宫微环境中i l 1 5 的功能及对妊娠的影响 为早期自然流产的发 病机制提供更多的理论依据 2 l 结论 结论 p r p i b f c s f l 在子宫蜕膜组织中表达强度的降低与早期自然 密切 是早期自然流产的母体因素复杂网络中的某一微小侧面 2 2 参考文献 参考文献 l p o l g a rb b a r a k o n y ia x y n o si e ta 1 1 1 1 er o l eo f7 d t c rp o s i t i v ec e l l si n p r e g n a n c y j a mjr e p r o dh n r n u n o l 19 9 9 41 4 2 3 9 4 4 2 l a i r ds m t u c k e r m a ne m c o r kb a e ta 1 ar e v i e wo fi m m u n ec e l l sm o l e c u l e s i nw o m e nw i t hr e c u r r e n tm i s c a r r i a g e h u mr e p r o du p d a t e 2 0 0 3 9 2 16 7 17 4 3 l e c l e r c qg d e b a c k e rv s m e d tm e ta 1 d i f f e r e n t i a le f f e c t so fi n t e r l e u k i n 15 a n di n t e r l e u k i n 2o nd i f f e r e n t i a t i o no fb i p o t e n t i a lt n a t u r a lk i l l e rp r o g e n i t o rc e l l je x pm e d l9 9 6 18 4 2 3 2 5 3 6 4 p u z a n o vi j b e n n e t tm k u m a rvi l 一15c a ns u b s t i t u t ef o r t h em a r r o w m i c r o e n v i r o n m e n ti nt h ed i f f e r e n t i a t i o no fn a t u r a lk i l l e rc e l l s jl m r n u n o l 19 9 6 15 7 10 4 2 8 2 5 5 r e d h o r s ek d r a k ep m f i s h e rs j h u m a np r e g n a n c yt h er o l eo fc h e m o k i n e n e t w o r k sa tt h ef e t a lm a t e r n a li n t e r f a c e e x p e r tr e vm o lm e d 2 0 0 4 6 11 1 1 4 6 e r i k s s o nm m e a d o w ss k w i r ac r e ta 1 u n i q u ep h e n o t y p eo fh u m a nu t e r i n e n kc e l l sa n dt h e i rr e g u l a t i o nb ye n d o g e n o u st g f b e t a jl e u k o cb i o l 2 0 0 4 7 6 3 6 6 7 7 5 7 1v e r m as h i b ys e l o k ey w e ta 1 h u m a nd e c i d u a ln a t u r a lk i l l e rc e l le x p r e s s t h e r e c e p t o r f o ra n d r e s p o n dt ot h ec y t o k i n ei n t e rl e u k i n 15 b i o l r e p r o d 2 0 0 0 6 2 4 9 5 9 6 8 8 a s h k a ra a b l a c kg p w e iq e ta 1 a s s e s s m e n to fr e q u i r e m e n t sf o r i l 一15a n d i f n 吖r e g u l a t o r yf a c t o r si nu t e r i n en kc e l ld i f f e r e n t i a t i o na n df u n c t i o nd u r i n g p r e g n a n c y ji m m u n o l 2 0 0 3 1 7 1 6 2 9 3 7 4 4 9 o k a d ah n a k a j i m at y a s u d ak e ta 1 i n t e r l e u k i n 1i n h i b i t si n t e r l e u k i n 15 p r o d u c t i o nb yp r o g e s t e r o n ed u r i n gi nv i t r od e c i d u a l i z a t i o ni nh u m a n jr e p r o d i m m u n o l 2 0 0 4 6 1 1 3 1 2 10 d u n nc l c r i t c h l e yh o k e l l yr w i l 15r e g u l a t i o ni nh u m a ne n d o m e t r i a l s t r o m a ic e l l s jc l i ne n d o c r i n o lm e t a b 2 0 0 2 8 7 4 18 9 8