（医学专业论文）穿孔素基因启动子的克隆及体外区域性高甲基化.pdf

硕十学位论文 中文摘要 摘要 目的 我们的前期研究发现 活动期s l e 患者外周血中c d 4 t 细 胞穿孔素m r n a 的表达和蛋白的含量明显的增高 同时也发现c d 4 t 细胞穿孔素基因启动子区域出现了低甲基化 进而用d n a 甲基化抑制 剂5 一杂氮胞苷 5 一a z a c 处理正常c d 4 和c d 8 t 细胞后 穿孔素的 表达都有显著的增高 这种增高与c d 4 和c d 8 t 细胞穿孔素基因启动 子区域出现的低甲基化有关 那么d n a 高甲基化是否会使穿孔素表达 下调呢 本实验拟克隆穿孔素基因启动子区域 p r f i 并对p r f i 进行体 外区域性高甲基化 为探讨穿孔素基因调控序列高甲基化能否引起穿 孔素表达下调奠定基础 方法 1 以人全基因组d n a 为模板 通过p c r 扩增方法获得穿 孔素基因启动子区域 p r f i 2 将p r f i 克隆到t 载体 双酶切鉴 定并测序证实 再定向亚克隆至报告基因载体p g l 3 一b a s i c 中 3 大 量酶切得到目的片断 用甲基化酶m s s s i 及甲基供体s 一腺苷甲硫氨 酸 s a m 对p r f i 片段进行体外区域性高甲基化 再将高甲基化的目 的基因片段重新连接至p g l 3 一b a s i c 结果 1 成功克隆p r f i 到t 载体和报告基因载体p g l 3 一b a s i c 且得到双酶切及测序结果证实 2 对p r f i 片段进行体外区域性高 甲基化后鉴定显示p r f i 片段区域性高甲基化完全 结论 成功克隆p r f i 到报告基因载体p g l 3 一b a s i c 并对p r f i 片 段进行体外区域性高甲基化 为后续实验奠定了基础 关键词穿孔素 d n a 甲基化 分子克隆 报告基因 硕士学位论文7 英文摘要 a b s t r c t o b j e c t i v e t oc o n s t r u c tal u c i f e r a s er e p o r t e rg e n ev e c t o ro fp e r f o r i n p r o m o t e ra n dm e t h y l a t e i ti nv i t r o m e t h o d s 1 a m p l i f y t h ep r o m o t e ro f t h eh u m a np e r f o r i np r o m o t e r b yp c r a n dt h e n c l o n ei n t op m d l 8 一tv e c t o ra n ds u b c l o n ei n t o p g l 3 一b a s i c v e c t o r t h er e c o m b i n a n t p l a s m i d w a sc o n f i r m e db y r e s t r i c t i o nm a p p i n ga n dd n as e q u e n c i n g 2 e x c i s et h er e g i o n so fi n t r e s t u s i n g t h e a p p r o p r i a t e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s m e t h l a t e e x c i s e d f r a g m e n tw i t hm e t h y l a s es s si m s s s i a n ds a d e n o s y m e t h i o i n e s a m c o m f i r mm e t h y l a t i o nb yd i g e s t i o nw i t ha p p r o p r i a t em e t h y l a t i o ns e n s i t i v e e n z y m ea c i ia n da g r o s eg e le l e c t r o p h r e s i s a n dt h e nr e l e g a t ef r a g m e n t b a c ki n t ot h ep r o m o t e r r e p o r t e rc o n s t r u c tp g l 3 b a s i c r e s u l t s 1y r h er e s u l to fd n as e q u e n c i n gs h o w e dt h a tt h es e q u e n c e o fc l o n e dp r o m o t e ri sr i g h t 2 t h er e s u l to fd i g e s t i o nm e t h y l a t i o nw i t h a p p r o p r i a t em e t h y l a t i o ns e n s i t i v ee n z y m es h o w e d t h a tp e r f o r i np r o m o t e r w a sm e t h y l a t e dc o m p l e t e l y c o n c l u s i o n t h ep r o m o t e ro fp e r f o r i nw a sc l o n e ds u c c e s s f u l l y a n d m e t h y l a t e di nv i t r oc o m p l e t e l y i tw i l lb eai m p o r t a n tb a s i sf o rt h es t u d y o ft r a n s f e c t i o n k e yw o r d sp e r f o r i nf p r fo d n am e t h y l a t i o n m o l e c u l a r c l o n i n g r e p o r t e rg e n e 知识水坝 damdoc damdoc为您倾心整理 小店 qq 2218108823 硕十学位论文 英文缩写 英文缩写 5 a z a c 5 m c b p c d l l a c d 7 0 c d n a c t l d m c l i g a s e d n a p o l d n a d n t p s g r b m h c i i m r n a m s s s l n k p c r p f p p r f l s l e 英文缩写 英文全称 5 a z a c y t i d i n e 5 m e t h y l e y t o s i n e b a s e p a i r l e u c o c y t ea n t i g e n1l a l e u c o c y t ea n t i g e n 7 0 c o m p l e m e n t a r yd n a c y t o t o x i c i t ytl y m p h o c y t e d e o x y m e t h y l e y t o s i n e d n a l i g a s e d n a p o l y m e r a s e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e s g r a n z y m eb m a j o rh i s t o c o m p a b i l i t yc o m p l e x m e s s a g e rr n a m e t h y l t r a n s f e r a s es s s i c e l ln a t u r a lk i l l e re e l l p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o r e f o r m i n gp r o t e i n p e f f o r i n p e r f o r i n l s y s t e m i cl u p u se r y t h e m a t o s u s i i i 中文名称 5 一杂氮胞苷 5 一甲基化胞嘧啶 碱基对 白细胞抗原1 1 a 白细胞抗原7 0 互补脱氧核糖核苷酸 细胞毒性t 淋巴细胞 脱氧甲基化胞嘧啶 d n a 连接酶 d n a 聚合酶 脱氧核糖核酸 四种脱氧核糖核苷混合物 颗粒酶b 主要组织相容性复合物i i 信使r n a 甲基化转移酶s s s i 自然杀伤细胞 多聚酶链反应 穿孔素 穿孔素 系统性红斑狼疮 知识水坝 damdoc damdoc为您倾心整理 小店 qq 2218108823 原创性声明 本人声明 所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果 尽我所知 除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果 也不包 含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料 与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均已在在论文中作了明确的说明 作者签名 埠吼珥年 月三日 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有 权保留学位论文 允许学位论文被查阅和借阅 学校可以公布学位论 文的全部或部分内容 可以采用复印 缩印或其它手段保存学位论文 学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文 本课题受以下单位资助 国家自然科学基金 3 0 3 7 1 2 9 7 日期 翌年 盘月 墨日日期 丑年 鱼月 垒日 硕士学位论文 前言 前言 d n a 甲基化是指由d n a 甲基转移酶介导 在胞嘧啶的第5 位碳原子上加上一甲 基基团 使之变成5 一甲基胞嘧啶 5 m c 的化学修饰过程 是最常见的复制后及 转录后修饰方式之一 在基因表达调控中起重要作用 1 已有研究表明 启动子 区域的低甲基化对基因的表达有明显的促进作用 系统性红斑狼疮 s l e 是累及全身多系统的自身免疫性疾病 其发病机制 尚不明了 s l e 患者血中自身抗体的存在使以往对s l e 发病机制的研究亦多集中 在对b 细胞的研究上 由于b 细胞产生的大多数病理性自身抗体都是t 细胞依赖 性的 且b 细胞功能受t 细胞调节 故目前越来越倾向于认为原发性t 细胞功能 异常在s l e 的发病中起关键作用随 近来越来越多的研究证实t 细胞d n a 的低 甲基化可参与自身免疫的发生 且与红斑狼疮的发病密切相关 1 穿孔素是重要的免疫效应分子 主要表达于活化的细胞毒性t 细胞和n k 细 胞 是c t l 和n k 杀伤靶细胞的主要毒性蛋白 近年来通过对穿孔素基因敲除鼠 的研究显示出穿孔素还有其重要的免疫调节作用 因此 对穿孔素的研究又 成为免疫学研究的一个热点 国外研究表明穿孔素与s l e 发病机制密切相关 且 受d n a 的甲基化状态影响 我们通过对活动期s l e 患者的研究发现 患者外周血中c d 4 t 和c d 8 t 细胞 穿孔素m r n a 的表达和蛋白的含量都发生了变化 特别是c d 4 t 细胞穿孔素m r n a 的表达和蛋白的含量都有明显的增高 同时也发现c d 4 t 细胞穿孔素基因启动子 区域出现了低甲基化 进而用d n 甲基化抑制剂5 一杂氮胞苷 5 a z a c 处理 正常人c d 4 和c d 8 t 细胞后穿孔素m r n a 的表达和蛋白的含量都有显著的增高 这种增高与c d 4 和c d 8 t 细胞穿孔素基因启动子区域出现的低甲基化有关 以 上实验结果表明穿孑l 素启动子区域d n a 低甲基化可以引起穿孔素表达升高 那么 穿孔素启动子区域d n a 高甲基化是否会使穿孔素表达下调呢 本课题我们拟克隆穿孔素基因 p r f i 启动子区域于荧光素酶报告基因载体 p g l 3 一b a s i c 上 并用甲基化酶m s s s l 及甲基供体s 一腺营甲硫氨酸 s a m 对p r f i 进行体外区域性高甲基化 试图为证实穿孔素基因调控序列高甲基化能否引起穿 孔素m r n a 和蛋白表达下调奠定基础 硕士学位论文 第一章材料和方法 第一章材料和方法 1 1 材料 1 1 1 主要仪器设备 b c m 1 0 0 0 超净工作台 m i s t r a l 一1 0 0 0 台式离心机 h l l e g r a m 2 1 r 微量冷冻离心机 p c r 仪 微量加样器 凝胶影像分析系统j e l d o c 2 0 0 0 型 d y y i i i 型电泳仪 电热恒温培养箱7 9 一b 一5 0 型 电热恒温水槽d k 8 d 型 恒温细菌摇床 一2 0 低温冰箱 一7 0 超低温冰箱 双重纯水蒸馏器s z 一9 3 型 干燥箱g z x g f 一2 型 高压蒸汽消毒锅 微波炉 1 1 2 主要试剂 凝胶回收试剂盒 大量质粒提取试剂盒 j m l 0 9 菌 p m d l 8 t v e c t o r p g l 3 一b a s i c t a q 酶 k p ni 限制性内切酶 h i n di i i 限制性内切酶 t 4l i g a s e m s s s l s 删 a c ii 2 苏州安泰空气技术公司 s a n y o 公司 日本 b e c k m a n 公司 美国 a b i 公司 美国 吉尔森公司 b i o r a d 公司 美国 北京六一仪器厂 吉林省医疗器械厂 上海精密实验设备有限公司 国产 海尔公司 中国 s a n y o 公司 f 1 本 上海亚荣生化仪器厂 上海跃进医疗器械厂 国产 国产 t a k a r a 公司 大连 q i a g e n 公司 美国 本实验室保存 t a k a r a 公司 大连 p r o m e g a 公司 美国 p r o m e g a 公司 美国 t a k a r a 公司 大连 t a k a r a 公司 大连 t a k a r a 公司 大连 n e b 公司 英国 随m s s s l 酶提供 n e b 公司 英国 硕十学位论文第一章材料和方法 d n am a r k e r 琼脂糖 核酸染料 s d s 无水乙醇 糖原 水平衡酚 三氯甲烷 氨苄青霉素 a m p i e i l i n t r i s 碱 硼酸 乙二胺四乙酸 e d t a 蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 琼脂粉 甘油 无水氯化钙 c a c l 醋酸钠 n a a c 1 1 3 液体配置 t a k a r a 公司 大连 t a k a r a 公司 大连 北京赛百盛生物公司 s i g m a 公司 美国 湖南师范大学化学试剂厂 s i g m a 公司 美国 北京中山生物技术有限公司 上海化学试剂一厂 a m r e s c 0 上海化学试剂一厂 武汉天源生物公司 武汉亚法生物制品公司 o x o i d 产品 o x o i d 公司 上海试剂一厂 t a k a r a 公司 大连 武汉大风生物公司 s i g m a 公司 美国 武汉大肛 生物公司 1 l b 液体细菌培养基的配制 配制每升培养基 应在9 0 0 m l 去离子水中加入 胰蛋白胨l o g 酵母提取物 5 9 氯化钠l o g 磁力搅拌至溶质完全溶解 然后定容至总体积1 l 高压蒸汽灭 菌2 0 分钟 室温冷却后置于4 冰箱中保存备用 2 含琼脂的l b 固体培养基 l b 平板 的配制 先按上述方法配制l b 液体培养基 然后加入琼脂粉l s g l 混匀并高压蒸 汽灭菌2 0 分钟后 待温度降至5 0 左右时 在无菌状态下倾倒入灭菌的7 0 m m 培养皿中 2 0 3 0 m 1 皿 铺平 使得培养基层厚度为6 8 n n 冷却凝固后密封保 存于4 c 中备用 3 l o o m g m l 氨苄青霉素贮存液的配制 将1 9 氨苄青霉素钠盐溶解于l o m l 去离子水中 待完全溶解后用 0 2 2 u m 微孔滤膜过滤除菌 分装后于 2 0 条件下保存备用 4 含有琼脂的选择性l b 固体培养基 选择性l b 平板 的配制 如前述 消毒好的固体培养基 含琼脂粉1 5 置于室温下 待温度降至5 0 硕七学位论文第一章材料和方法 左右时 加入l o o m g m l 的氨苄青霉素溶液 使氨苄青霉素的终浓度为 5 0 1 0 0 u g m l 混匀后倒入预先灭菌的7 0 r m 培养皿中铺平 使培养基层厚6 8 m 室温放置固化 密封后4 保存备用 5 l m o l l 氯化钙溶液的配制 在2 0 0 m l 去离子水中溶解5 4 9c a c l r 6 h 0 用0 2 2um 滤器过滤除菌 分装 成l o m l 小份贮存于 2 0 c 制备感受态细胞时 取出一小份解冻并用去离子水稀 释至l o o m l 用n a l g e n e 滤器 0 4 5 um 孔径 过滤除菌 然后骤冷至o c 6 小量提取质粒溶液配置 碱裂解法 溶液i 葡萄糖5 0 9 m o l l t r i s h c l2 5 m m o l l e 1 t al o m m o l l 溶液ii n a o h2 0 0 m m o l l i s d s 溶液i i i 醋酸钾3 m o l l 冰醋酸2 m o l l r n a a s e a 溶液 l o m g m lr n a a s e a s i g m a 用l o r m n o l lt e p h 7 5 配制 1 0 0 c 煮l o m i n 灭活d n a 酶 分装 一2 0 c 保存 反应终浓度l o o p g m l 7 t b e 电泳缓冲液的配制 1 0 x 贮存液 称取t r i s 碱1 0 8 9 硼酸5 5 9 加入去离子水1 0 0 0 m l 待完全溶解后再加入 0 5 m o l l 的e d t a 溶液4 0 m l 混匀 置于室温下阴凉处保存 8 3 m o l l 醋酸钠 称取n a a c 3 h o4 0 8 1 9 加3 0 m l 去离子水 混匀后用冰乙酸调p h 值至5 2 补加去离子水至1 0 0 m 1 混匀后高压灭菌处理 4 c 保存备用 9 t e 缓冲液 t e 缓冲液 t r i s e d t a t r i s l o m m o l 1p h 7 4 0 5 m l2 m o l l 贮存液 l n g n o l 1e d t a p h 8 0 2 0l ll0 5 m o l l 贮存液 加水至l o o m l 室温保存 1 0 l o m o l ln a o h 溶液 称取氢氧化钠8 9 先用1 6 0 m l 去离子水溶解后 再定容至2 0 0 m l 1 1 0 5 m o l le d t a p h 8 o 称取e d t a1 8 6 9 先用7 0 m l 去离子水 加l o m li o mn a o h 溶液 加热搅拌 溶解后 再用1 0 mn a o h 溶液调p h 至8 0 加去离子水定容至1 0 0 m l 高压蒸汽 灭菌 保存备用 1 2 l o s d s 十二烷基硫酸钠 称取1 0 0 9 s d s 慢慢转移到约含0 9 l 的去离子水的烧杯中 用磁力搅拌器搅 拌直至完全溶解 用去离子水定容至1 l 1 3 l m o l lh c l 加8 6 m l 的浓盐酸至9 1 4 m l 的水中 1 4 8 m o l l 乙酸钾 溶解7 8 5 9 乙酸钾于足量的去离子水中 规去离子水定容 到l o o m l 4 硕 学位论文 第一章材料和方法 1 5 l m o l lt r i s 溶液 在8 0 0 r a l 去离子水中溶解1 2 1 9 gt r i s 碱 加入浓 h c l 调节p h 值至所需值 p h h c l 7 4 7 0 m l 7 66 0 m l 8 0 4 2 m l 1 6 i p t g 溶液 i p t g 为异丙基硫代一b d 半乳糖苷 分子量为2 3 8 3 在8 m l 去离子水中 溶解2 9i p t g 后 用去离子水定容至l o m l 用0 2 2pm 滤器过滤除菌 分装成 l m l 小份贮存于一2 0 1 7 x g a l 溶液 x g a l 为5 一溴一4 一氯一3 一吲哚一b d 半乳糖苷 用二基甲酰胺溶解x g a l 配制 成的2 0 m g m l 的贮存液 保存于一玻璃管或聚丙烯管中 装有x g a l 溶液的试管 须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏 并应贮存于 2 0 c x g a l 溶液无须过滤 除菌 1 8 1 x 红细胞裂解液 n h c l8 3 9 k h c 0 31 9 n a e d t a3 7 m g 加去离子水至1 0 0 0 m l 高压蒸汽灭菌 存于4 c 中备用 1 9 l x 细胞核裂解液 2 mt r i s h c l p h 8 o 0 3 5 m l 4 mn a c l7 5 m l 0 5 m o l le d t a p h 8 o l5 m l 加去离予水至5 0 0 m l 高压蒸汽灭菌 存于4 c 中备用 2 0 无菌水 5 0 0 m l 去离子水 高压灭菌 室温保存 开瓶后仅限一周使用 1 1 4 引物合成 根据引物设计原则 参照g e n b a n k 上公布的p r f l 基因的d n a 序列 应用o l i g d 和p r i m e rp r e m i e r 5 0 等分子生物学软件设计针对p r f l 一d n a 序列一1 4 0 0 至 5 9 位 碱基的一对引物 分别加入k p n i 和h i n d i i i 酶切位点 外加3 个保护碱基 引 物由上海英骏生物有限公司合成 匕扬 弓j 物 5 a t a g g t a c c c c t a a c a a c c a c3 k p ni 酶切位点 下游引物 5 g c c 从g c t t t c c t c t c t t c a c3 h i n d i i i 酶切位点 1 2 实验方法 1 2 1 目的片断的p c r 扩增 1 2 1 1 人外周血基因组d n a 的抽提 硕士学位论文第一章材料和方法 1 取人肝素抗凝外周血l o m l 于5 0 m l 离心管 加入3 5 m ii x 细胞裂解液 裂 解液预先倒入 震荡混匀 放置至透明 2 3 0 0 0 r p m 离心1 0 分钟 倒去上清 在沉淀中加入l x 细胞核裂解液3 m l 震荡混匀 然后加入8 0 0 u l2 0 的s d s 混匀 至出现粘稠透明状 然后加入3 0 u 2 0 u g m l 蛋白酶k 混匀 3 7 c 水浴温育6 小时以上或过夜 3 上述反应液冷却至室温后 加入等体积的饱和酚溶液 温和地上下转庭 离心管5 l o m i n 直至水相与酚相混匀成乳状液 3 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 用大口 吸管小心吸取上层粘稠水相 移至另一离心管中 重复酚抽提一次 加等体积的 氯仿 异戊醇 2 4 1 上下转动混匀 3 0 0 0 r p m 离心1 5 r a i n 用大口吸管小心吸 取上层粘稠水相 移至另一离心管中 重复一次 4 加入1 5 体积的3 m o l ln a a c 及2 倍体积的预冷的无水乙醇 室温下慢 慢摇动离心管 即有乳白色云絮状d n a 出现 用玻璃棒小心挑取云絮状的d n a 转入另一1 6m 1 离心管中 加7 0 乙醇0 2 m l 3 0 0 0 r p m 离心5 m i n 洗涤d n a 弃 上清 去除残留的盐 重复一次 室温挥发残留的乙醇 加t e 液2 0 u l 溶解d n 打匀 直至d n a 完全溶解 5 d n a 的浓度测定及纯度判定 取d n a 溶液用t e 液做适量稀释 以t e 液 作空白对照 在紫外分光光度计上读取a 2 6 0 和a 2 8 0 的光密度值 1 2 1 2 穿孔素基因调控序列目的片断p c r 扩增 1 穿孔素基因启动予调控序列 1 4 0 0 至 5 9 目的片断 以人基因组d n a 为模板 引物上下游分别带有酶切位点k p n i 和h i n d i i i 扩 增p r f i 片段 p c r 反应体系如下 反应成分2 0 ul 体系i 0 0 ul 体系 1 0 b u f f e r2ul i 0p1 2 5 m mm 9 2 2 5 u l1 2 5 p 1 l o m md n t p o 4 8 u12 4 l l1 l o u m 上游引物 lul 5 耻l l o u m 下游引物lul5u1 t a q 酶 0 2 ul 3 u l l1 模板 5 ul1 0pl 加无菌水至2 0 u ll o o u l 反应条件 9 4 c5 r a i n 9 4 c4 0 s e c 4 5 c4 5 s e c 7 2 ci m i n2 0 s e c 3 3 c y c l e s 7 2 1 0m i n 2 产物分析 扩增产物于1 5 的琼脂糖凝胶电泳 电泳后经凝胶电泳分析系统扫描拍照 6 硕士学位论文第一二章材料和方法 3 p c r 产物纯化回收 采用d n a 凝胶回收试剂盒从琼脂糖凝胶中切取目的条带 然后回收纯化 其 步骤如下 1 用0 5 x t b e 缓冲液制作1 5 琼脂糖凝胶 然后分别对3 0 u lp c r 产物进 行琼脂糖凝胶电泳 2 紫外灯下切出含有目的d n a 的琼脂糖凝胶 用纸巾吸尽凝胶表面的液体 此时应注意尽量切除不含目的条带的凝胶 尽量减小凝胶体积 提高d n a 回收率 切胶时动作要迅速以免d n a 长时间暴露于紫外线下造成损伤 3 切碎胶块 4 称量胶块重量 计算胶块体积 以l m g l u l 进行计算 5 向胶块中加入4 5 个凝胶体积量的胶块熔化液d r ib u f e r 试剂盒提供 6 均匀混合后7 5 加热熔化胶块 间断振荡混和 使胶块充分熔化 约需 6 1 0 分钟 7 向上述胶块熔化液中加入d r ib u f f e r 量的1 2 体积量的d r i ib u f f e r 均匀混合 8 将试剂盒中的s p i nc o l u m n 按置于c o i l e c t i o nt u b e 上 9 将上述步骤7 的溶液转移至s p i nc o l u m n 中 3 6 0 0 转 分钟离心1 分钟 弃滤液 1 0 将5 0 0 u lr i n s e a 试剂盒提供 加入s p i nc o l u m n 中 3 6 0 0 转 分钟离 心3 0 秒 弃滤液 1 1 将7 0 0 u lr i n s e b 试剂盒提供 加入s p i nc o l u m n 中 3 6 0 0 转 分钟离 心3 0 秒 弃滤液 1 2 重复操作步骤l l 然后1 2 0 0 0 转向i n 再离心1 分钟 1 3 将s p i nc o l u m n 按置于新的1 5 m l e p 管上 在s p i nc o l u m n 膜的中央处 加入3 0 u l6 0 预热的无菌去离子水 室温静置1 分钟 1 4 1 2 0 0 0 转 m i n 离心1 分钟沈脱d n a 1 5 用d n a r n ac a l c u l a t o 分析所提取的d n a 的浓度和纯度 然后保存于 2 0 备用 1 2 2 将p r f l 克隆到质粒p m d t b t 1 2 2 1 连接反应体系如下 反应条件 1 6 水浴1 6 h 无菌水6 1 p r f ld n all ll 1 0 t 4 b u f f e r 1pl t 4 连接酶1p1 t 载体 l l 总体积 1 0pl 7 硕士学位论文 第一章材料和方法 i 2 2 2 大肠杆菌 j m l 0 9 感受态细胞的制备 大肠杆菌株大量制备感受态细胞 用作重组质粒转化的宿主 制各过程需注 意无菌操作 其步骤如下 1 挑选单一菌落 将j m l 0 9 菌株从一7 0 冰箱中取出 待稍有解冻后 即用 灼烧后冷却的接种环沾取少量菌液 点到l b 琼脂平板的边缘 以其为起点划一 道划痕 将接种环灼烧灭菌后冷却 通过第一道线划一连续的波浪线 再通过第 二条波浪线划第三条波浪线 不与以前的线交叉重叠 重复划线 直到划满整个 培养皿 然后置于3 7 c 细菌培养箱中培养过夜 2 取灭菌的5 0 m l 容积的试管 加入5 m l l b 液体培养基 用无菌t i p 挑取平 板上生长的单菌落 送入培养液中 封好管口 3 7 3 0 0 转 m i n 振摇培养至生 长饱和 约需6 1 2 小时 可过夜培养 3 取菌液0 4 m l 接种至含有4 0 m ll b 液体培养基的2 5 0 m l 烧瓶中 3 7 3 0 0 转 分钟剧烈震摇培养约2 3 小时 待a 6 0 0 值达到0 3 0 4 时将烧瓶取出 立即 置于冰浴1 0 1 5 分钟 4 在无菌条件下将细菌转移到一个灭菌处理过的用冰预冷的5 0 m i 离心管 中 4 4 0 0 0 9 离心1 0 分钟 5 弃去培养液 将离心管倒置于滤纸上1 分钟 以使最后残留的培养液流 尽 6 加用冰预冷的0 i m o l 几c a c i 4 m 1 重悬菌体 置冰浴3 0 分钟 7 4 4 0 0 0 9 离心1 0 分钟 弃去上清 倒置于滤纸上1 分钟 8 再加4 m 1 用冰预冷的0 1 m o l lc a c i 4 m l 重悬菌体 重悬时操作要轻 9 置于4 c 冰箱中1 2 2 4 小时 即可用于转化 1 0 如制备出的感受态细胞不能用完 或者不能即刻使用 可迸行冻存保留 其方法如下 将感受态细胞分装成2 0 0 u l 一份 每份加入3 0 体积的甘油保存液 置一7 0 冰箱 低温保存可达3 月之久 1 2 2 3 转化 1 将连接产物置于p c r 仪6 5 l o m i n 使充分溶解 2 吸取5 u l 连接产物加入l o o u l 感受态细胞中 充分打匀 冰上3 0 m i n 4 2 水 浴9 0 秒 注意不要摇动试管 冰上2 m i n 3 加入8 0 0 u ll b 液 3 7 2 0 0 r p m 摇床中振荡4 0 m i n 4 6 0 0 0 r p m 离心l o m i n 去上清 留沉淀 打匀 点于涂x g a i i p t g 的l b 平板 a m p l o o u g m l x g a l4 0 u l i p t g4 u 1 室温放3 0 m i n 吸收干净 抹匀 倒置皿 3 7 温箱1 2 1 6 小时 5 同时设立对照 即将未转化的j m l 0 9 接种于a m p 1 0 0 u g m 1 l b 琼脂平板 8 硕 学位论文 第一章材料和方法 上 分别用p g l 3 一b a s i c 空载体和j m l 0 9 菌株作为阳性对照和阴性对照 1 2 2 4 重组质粒p 如1 8 t p r f l 的鉴定及回收 1 重组质粒p m d l 8 t p r f l 的提取 碱裂解法 根据蓝白筛选原理 在含有氨苄青霉素的l 8 平板上涂抹x g a l 和i p t g 没 有插入目的基因的载体其l a z 基因可以生成a 片断 从而与细菌缺乏a 片断的 b d 半乳糖苷产生a 互补效应与i g a l 反应生成蓝色菌落 而重组体由于目的 基因插入生成a 片断的能力被破坏因而生成白色菌落 a m p l b 琼脂平板上的白 色菌落为阳性菌落即为重组克隆 1 挑选白色菌落 在皿上用无菌t i p 挑取至少5 个克隆 生长于3 4 m l 含有a m p 的l b 介质中 l b 不能过多 否则溶菌不充分 3 7 3 0 0 r p m 摇床振荡1 2 1 4 j 时 2 l5 m l 过夜生长的细菌 1 2 0 0 0 r p m 离心1 0 秒 弃上清 倒置e p 管l m i n 3 加冰冷的i 液l o o u l 5 0 r a m 葡萄糖 i o m i e d t a 2 5 m mt r i s c 1 p h8 0 充分 振荡混匀室温放置5 m i n 不能留有菌块 4 加入新配的i i 液2 0 0 u l 0 2 mn a o h i s d s 温和混匀3 5 次 冰上放5 m i n 5 加冰冷的i i i 液 3 m 乙酸钾 5 m 冰醋酸 1 5 0 r a l 混匀数次 冰上放5 m i n 1 2 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n 6 取上清 加等量酚 氯仿 异戊醇 2 5 2 4 1 和氯仿 异戊醇 2 4 1 各抽提 1 次 1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n 7 取上层液体 加2 倍体积无水乙醇和1 1 0 体积3 mn a a c 混匀 于室温沉淀 d n a3 0 m i n 1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n 弃上清 8 l m l7 5 乙醇洗沉淀1 次 1 2 0 0 0 r p m 离心l o m i n 弃上清 室温干燥2 0 m i n 9 加5 0 u l 去离子水 并加r n a 酶至终浓度为5 0 u g m l 3 7 c 消化3 0 m i n 取 2 u l 电泳观察 余一2 0 保存 1 0 得到的质粒d n a 用紫外分光光度仪检测浓度与纯度 2 重组质粒p m d l 8 一t p r f l 的p c r 鉴定 反应成分 实验组 阴性对照组 1 0 b u f f e r2 工l2u1 2 5 m mm 9 2 2 5 u 12 5 1 1 1 1 0 m m d n t p0 4 8 u l0 4 8 l l o um 上游引物 1u11i i1 1 0 p m 下游引物 1p11i ll p m d l 8 一t p r f l 1u1 t a q 酶 0 2 p l0 2 u 1 加无菌水至 2 0 u l2 0 u 1 于1 5 琼脂糖凝胶上电泳 电压5 v c m 4 5 m i m2 5 6 n m 紫外灯下观察 9 硕十学位论文第一章材料和方法 3 重组质粒p m d l 8 一z p r f l 的h i n d i i i 和k p ni 双酶切鉴定及回收 1 反应体系如下 3 7 c 水浴过夜 无菌水 8u l p m d l 8 t p r f i 8u 1 1 0 x mb u f f e r2u l k p ni iu l h i n d l i i1u l 总体积 2 0u l 2 于1 5 琼脂糖凝胶上电泳 电压5 v c m 4 5 m i n 2 5 6 n m 紫外灯下观察 3 胶回收试剂盒回收p r f i 片段 步骤同前 4 将回收的p r f i 用紫外分光光度仪检测浓度与纯度 4 测序 将经鉴定后为阳性的克隆 吸取l m l 菌液于新的灭菌1 5 m l e p 管中 送测序 测 序此步骤由上海英骏生物技术有限公司完成 1 2 3 亚克隆到报告基因质粒p g l 3 一b a s i c 1 2 3 1 质粒p g l 3 一b a s i c 的提取 真核表达载体p g l 3 b a s i c 保存在大肠杆菌j m l 0 9 中 因为该质粒带有氨苄 青霉素抗性 所以将此大肠杆菌j m l 0 9 接种在a m p l b 平板上 3 7 c 培养过夜后 挑取单菌落接种于5 m la m p l b 液体培养基 3 7 c 剧烈振摇培养过夜 3 0 0 r p m 后面提取质粒方法同上 1 2 3 2 质粒p g l 3 b a s i c 的h i n di i i 和k p ni 双酶切处理及回收 1 反应体系如下 无菌水 8u l p g l 3 b a s i c 8u l l o x mb u f f e r2u l k p ni 7 lu 1 f h i n d i i i1u l 总体积 2 0 u l 3 7 c 水浴过夜 然后6 5 c 水浴1 5 m i n 灭活限制性内切酶 置于一2 0 c 保存 2 质粒p g l 3 一b a s i c 酶切产物电泳及胶回收方法同上胶回收 1 2 3 3p r f i 基因片段与质粒p g l 3 b a s i c 的重组连接 胶回收片段后经紫外分光光度计检测 o d 2 6 0 o d 2 8 0 值在1 8 2 0 之间 表 明无 r n a 及蛋白质污染 可进行连接 阴性对照不加t 4l i g a s e 连接体系如下 1 0 硕士学位论文 第一章材料和方法 反应成分实验组阴性对照组 无菌水 6 u l7 u l 1 0 t 4b u f f e rl u ll u l 回收p r f l l u l l u l p g l 3 一b a s i cl u ll u l t 4 连接酶 l u l 总体积 1 0 u 1 1 0 u l 1 6 水浴1 6 h 1 2 3 4 重组子的转化 方法同上 但所用的是a m p l b 培养基 培养基上不涂布x g a l 和i p t g 1 2 3 5 重组克隆的筛选与鉴定 方法同上 分别经过菌落p c r 和双酶切鉴定 只是筛选阳性克隆时只用氨苄 青霉素抗性 没有用蓝白试验 p c r 反应体系及酶切体系同上 1 2 3 6 重组克隆p g l 3 一p r f l 的序列测定和分析 挑选经菌落p c r 和酶切鉴定的阳性克隆细菌送上海英骏生物技术有限公司 进行测序 测出的序列与g e n b a n k 公布的序列进行同源性比较分析 1 2 3 7 阳性克隆的命名 保存 阳性克隆命名为p g l 3 p r f l 将新鲜的含阳性克隆的菌液加入3 0 的灭菌甘 油 充分混匀后分装于干净的e p 管中 8 0 保存备用 1 2 4p r f l 基因片段c p 6 岛体外区域性高甲基化 1 2 4 1 大量扩增重组质粒d n a 1 将测序证实序列正确的p g l 3 一p r f 聃1 0 9 细菌克隆从含酵母 氨苄青霉 素选择性抗生素的l b 培养基 2 5 m 1 的新鲜划痕平板中 挑选单个克隆 置l b 培养基于锥形瓶在3 7 c 有力地振摇8 小时 约3 0 0 r p m 锥形瓶容积至少应为培 养基的4 倍 2 1 5 0 0 1 1 0 0 0 稀释选择性l b 培养基起始培养物 质粒孵育1 5 0 m l 3 7 用力摇 3 0 0 r p m 1 2 1 6 小时 使用的容器至少4 倍于培养基 细胞密度应达到 约3 4 x 1 0 9 m 1 3 收集细菌 6 0 0 0 9 离心1 5 分钟 4 尽可能去上清 4 用6 m lp 2 缓冲液重悬细菌丸 足够大的容器可充分混合裂解液达到充 分裂解 注意把r n a s e a 加到p 1 中 6 m l 6 u 1 充分悬浮直到无团块存在 5 以下按大量质粒提取试剂盒 q i a g e np l a s m i dm a x ik i t 说明进行 1 2 4 2 大量酶切目的片断 1 用k p ni 和h i n d i l i 对真核表达载体p g l 3 一p r f l 大量酶切 体系如下 硕十学位论文第一章材料和方法 无菌水 5 0 u l p g l 3 一p r f l 1 0 0u 1 1 0 x mb u f f e r2 0u 1 k p ni 1 5u l h i n d l i i1 5u 1 总体积 2 0 0 u l 3 7 c 酶切过夜 1 的琼脂糖凝胶电泳分离p r f l 片段和线性化的p g l 3 b a s i c 2 纯化回收p r f l 目的基因片段和酶切后线性化的p g l 3 b a s i c 方法同上 1 2 4 3p r f l 片段c p g 岛体外区域性高甲基化 1 m s s si n e b 是一种c p g 甲基化酶 对5 c g 3 中的胞嘧啶进行甲 基化 用m s s si 和s 一腺苷甲硫氨酸使上述d n a 甲基化 对照组不加s s si 反 应体系参照说明书及文献进行 反应成分c p g 甲基化模拟甲基化 p r f l4 u l 4 u l 1 0 x n eb u f f e r21 6 u l 1 6 u l 2 0 x s a l8 u l 8 u l s s s i8 u l 无菌水 8 8 u l9 6 u l 总体积 1 6 0 u l1 6 0 u 1 3 7 孵育1 8 h 后甲基化组再加4 u ls s s l 和4 u l2 0 x s a m 对照组仅加s a m 混 匀后3 7 孵4 h 然后加热6 5 2 0 灭活s s s l 2 用酚 氯仿提取d n a 再用乙醇和糖原沉淀 悬置于2 0 u l 无菌水中 3 各取4 u ld n a 用于鉴定甲基化状态 1 2 4 4 体外区域性高甲基化的鉴定 甲基化敏感酶a c ii n e b 5 c cgc 3 3 ggc 4 g 5 根据其切点切取d n a 片段 有甲基化者不切 1 反应体系如下 无菌水1 2u l p r f i4u 1 l o x mb u f f e r2u l a c iilu 1 总体积 2 0u l 混匀后3 74 c 孵育1 8 2 4 h 2 用酚 氯仿提取d n a 再用乙醇和糖原沉淀 悬置于2 0 u l 无菌水中 1 2 硕士学位论文 第一章材料和方法 3 1 2 4 5 1 2 3 各取5 u l 重组质粒d n a 用于酶切电泳鉴定 目的基因片段重新连接至p g l 3 一b a s i c 反应体系见下表 混匀后1 6 孵育1 6 h 用酚 氯仿提取d n a 再用乙醇和糖原沉淀 悬嚣于2 0 u l 无菌水中 各取5 u l 重组质粒d n a 用于酶切电泳鉴定 其余一7 0 c 保存 体积反应物 1 6 u l 甲基化 对照目的基因片段 4 u l 线性化空载体p g l 3 一b a s i c 4 u l i o x t 4 d n a 连接酶缓冲液 2 u l t 4 d n a 连接酶 l o 2 0 u u l 1 4 u l 无菌水 硕士学位论文第一章材料和方法 附 实验技术路线简图 k p n l 5 3 p r f i 甲基化p r f i 4 1 3 硕士学位论文第