【word】 地黄化感自毒作用与连作障碍机制的研究进展.doc

地黄化感自毒作用与连作障碍机制的研究进展2012年6月第14卷第6期中国现代中药modemchinesemedicine地黄化感自毒作用与连作障碍机制的研究进展郭冠瑛,王丰青,范华敏,李明杰,郑红艳,李娟,陈新建,张重义.(1.河南农业大学中药材系,河南郑州450002;2.福建农林大学中药材gap研究所,福建福州350002)摘要在阐述连作障碍概念,危害和表观现象基础上,对地黄连作障碍的成因及作用机制进行了描述,强调植物化感自毒作用是地黄连作障碍的主导因素,结合地黄化感自毒作用的感知,传递,效应过程新思路及作者的最新研究进展,对地黄化感自毒作用与连作障碍的机制从根际土壤,植株响应和基因调控三个不同层次进行分析,并指出了对地黄连作障碍的分子机制进一步深入研究的途径.关键词地黄;连作障碍;化感自毒;分子机制连作障碍(monoculturecroppingproblem)是指在正常的栽培管理措施下,同一块地连续多年种植相同作物(连作)造成作物产量降低,品质变劣,生长状况变差,病虫害发生加剧的现象,欧美国家称之为再植病害(replantdisease)或再植问题(replantproblem),我国常称为”重茬问题”,是药用植物(作物)栽培中的一种常见现象,尤以根部或根茎入药的药用植物表现最为突出.据统计,约占70%的根类药材都存在不同程度的连作障碍j.连作障碍导致中药材的产量,品质明显下降,严重制约了我国中药资源的可持续发展,是我国构建现代大中药产业链亟待解决的重大课题,已引起了我国政府相关部门和学术界的高度重视2j.1地黄连作障碍的危害地黄rehmanniaglutinosalibosch.为玄参科多年生草本植物,怀地黄是我国着名的”四大怀药”之一,用药历史悠久,临床疗效确切,是构建我国现代大中药产业链重点推荐研究利用的大宗药材之一,目前在河南省焦作地区(道地产区)种植面积已近1.5万hm,产值在数十亿元.但是在地黄的生产中却存在着严重的连作障碍问题,主要表现为:虽能正常出苗,但地上部叶片生长较弱,枯黄萎蔫;地下部多形成须根,不能正常膨大形成具有商品价值的块根;有效成分含量降低,品质下降;土传病虫害严重,植株多病,根际主体药用部位块根变黑腐烂,难以保苗;土壤物理性状变坏,养分失衡,土壤酸化严重.连作导致大幅度减产,一般脱毒地黄亩产在35005000kg左右,而连作地块一般亩产仅为100500kg,有时甚至可造成绝产,因此每茬收获后须隔810年后方可再种.在连作障碍成因及其作用机理不明的情况下,大部分药农往往加大肥料投入以期提高产量,结果反而造成病虫害频发,于是不得不大量使用甚至滥用农药以维持地黄的产量,这不仅提高了生产成本,导致农残超标,还严重影响地黄的品质,加剧土壤微环境的破坏,使地黄的生产陷入恶性循环.因此,探讨地黄连作障碍的成因及其相应的分子生态机制,对于深化道地药材的科学理论研究,提高道地药材产量和品质具有极其重要的理论与实践意义.2地黄连作障碍与化感自毒作用引起地黄连作障碍的原因,是作物与土壤两个系统内部诸多因素综合作用下植物的外观表现.目前认为土壤理化性质的改变,微生物种群发生变化和化感自毒作用是导致连作效应的主要因素.连作基金项目国家自然科学基金项目(30772729,30973875,81072983,81102756)通讯作者张重义,tel:(0591)83742793,e-mail:hauzzy163.con?35-2012年6月第14卷第6期中国现代中药modemchinesemedicine易造成土壤中某些元素的亏缺或富集,导致土壤养分不均衡,直接影响下茬地黄的正常生长,同时由于土壤ph改变影响土壤中矿质养分的活化和有效性,从而间接影响着植物根系对养分的吸收和利用,造成地黄抗逆性下降,病虫害发生严重,最终导致地黄产量和品质下降j.但土壤和微生物变化不应成为生产力的障碍因子,最重要的障碍因子是地黄自身分泌的化感物质所产生的化感自毒作用.伴随着土壤环境恶化,根际微生物种群发生了明显变化,尹文佳等研究地黄连作障碍的土壤微生物区系的结果表明,连作土壤中有益根际细菌如氨化细菌,好气性固氮菌,好气性纤维素分解菌,硫化细菌,硝化细菌的数量减少,真菌的生长也受到连作植物的抑制,而根际土壤中放线菌,反硝化细菌,反硫化细菌数量增多.化感自毒作用(allelopathicautotoxicity)是指植物在正常的生命活动过程中,会向环境释放一些影响其他植物生长的次生代谢物质,这些次生代谢物质在土壤中积累,对植物自身也具有毒害作用j.地黄根分泌物中的化感物质主要是酚类化合物,其可以改变植物膜透性影响植物对营养物质的吸收和利用,影响植物根系和土壤中有关酶的活性而影响植物营养代谢.刘红彦等首次证实了地黄根系的分泌物,地黄叶和块根中均含有对地黄块茎生长抑制的物质,其中以根系分泌物的抑制作用最突出,其次是地黄叶.朱广军等采用gc.ms法对地黄根区土壤中潜在的化感物质进行了分离鉴定,发现其中含有酚类和其他化感物质的组分,且对照土壤存在差异,可能是自毒作用通过分泌酚酸类化感物质抑制其下茬地黄的生长,从而形成连作障碍.刘峰等认为,水苏糖和梓醇是地黄根系分泌物的主要成分,可能对土壤微生物产生影响.由此可见,地黄化感自毒作用是土壤理化性质的改变和微生物种群结构变化的主导因素.3地黄化感自毒作用机制的研究大量研究证明,化感自毒作用是地黄连作障碍的主导因素,但化感自毒作用是如何对地黄植株体产生毒害作用,具体的调控发生机制目前并不清楚.本课题组在前人研究基础上,结合课题组新近研究,对地黄化感自毒作用机制在不同层次进行探讨,希望对自毒作用的研究产生新的思考和启示.3.1化感自毒作用与根际土壤微生态环境变化地黄化感自毒作用是由于根分泌物的积累而产.36.生的,其可以改变植物细胞膜透性而影响对营养物质的吸收和利用.采用hplc和esims对连作地黄土壤浸提液分析后发现,地黄根部会分泌有机酸类,苷类和甾醇类等物质,确证了化感物质的存在ll;齐晓辉等证实了地黄化感自毒作用是地黄发生连作障碍的重要原因,并从地黄根区土壤中分离到了导致自毒作用的化感物质一甲醇提取物与水提取物.用变性梯度凝胶电泳(dgge)和末端限制性片段长度多态性(t.rflp)对连作后根际土壤微生物多样性分析,表明地黄连作改变了根际土壤微生态功能.地黄连作对土壤微生物环境产生了显着的影响,导致微生物种群平衡被破坏,同时土壤酶活性发生了较大的变化,根际微生态平衡失调.张重义等采用末端限制性片段长度多态性(trflp)技术研究地黄连作下根际土壤细菌群落的动态变化,得出地黄连作使其根际土壤细菌种类大量减少,群落结构趋于简单.土壤中氨化细菌,好气性固氨菌,硫化细菌,反硝化细菌和嫌气性纤维素分解菌分别增加了25.99,45.39,11.43,1.36,1.43倍,而好气性纤维素分解菌减少了86.74%.连作地黄根系的分泌物对脲酶,多酚氧化酶,蔗糖酶,蛋白酶和纤维素酶活性具有促进作用,分别增加了62.87%,9.43%,47.91%,139.62%和31.33%,而对过氧化氢酶则呈抑制作用.杜家方等对不同间隔年限种植地黄的土壤,不同生育时期的地黄土壤和不同土壤质地的地黄土壤中酚酸类物质的动态变化情况与其根际微生态环境的内在关系进行系统研究,并用hplc检测再植地黄土壤中与化感现象密切相关的5种酚酸(阿魏酸,对羟基苯甲酸,香草酸,香豆酸和丁香酸)的含量,结果表明:随着土壤问隔年限的增加,大田再植地黄的块根干质量,体积和叶片干质量依次增加;地黄土壤中5种酚酸的含量也依次降低.并且首次证明了地黄土壤中酚酸类物质相互作用,影响地黄的生长,阻碍了地黄块根的膨大;而地黄生育的苗期和伸长期应是地黄化感作用的关键时期.化感自毒作用也会影响到地黄根系,土壤和微生物的互作.最近,本课题组通过双向电泳(2一de)和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(malditof.tofms)相结合的方法,对正茬和重茬地黄进行土壤元蛋白组学rodriguezvalera根据宏基因组学的概念提出了宏蛋白质组(metaproteome,或称元2012年6月第14卷第6期中国现代中药modernchinesemedicine蛋白质组学),指环境混合微生物群落中所有生物的蛋白质组总和分析,共鉴定了103个根际土壤蛋白,其中33个在连作一年或两年根际土壤发生显着的表达变化.这些蛋白来源植物或微生物,广泛地参与蛋白质,核酸的次级代谢,信号转导,胁迫响应及根际土壤生态系统的c,n循环.结果表明,植物根系,土壤和相应微生物在蛋白水平的相互作用,对于连作地黄的质量和产量影响起着重要作用.同时,土壤元蛋白组学分析给土壤蛋白的生物学功能研究提供了新的前景,为进一步理解连作下土壤生态系统中微生物和植物间的互作关系打下坚实基础.3.2化感自毒作用与光合作用连作条件下,地黄化感自毒作用会对其光合作用产生抑制作用,打破了植株地上地下库源的协调平衡.尹文佳等刮研究了连作对地黄出苗,生长,营养状况和品质的影响,从”源库流”三方面人手,通过具有代表性的形态指标和生理指标的观察,测定及分析,就化感自毒作用对地黄生长的影响及其机理进行了探讨,得出连作的化感自毒作用抑制了其光合作用,从而导致生长不良及块根不能正常膨大.李改玲等探讨了连作自毒作用对地黄生理生化特性及其品质形成的影响,结果表明连作影响了地黄根系对水分和养分的吸收及光合作用能力,引起植株抗氧化系统紊乱,导致地黄生长受阻,致使药材品质下降.牛苗苗等通过正茬剪叶模拟连作地黄光合源不足条件下,测定分析植株源与库的关系,应用同位素示踪技术分析连作地黄光合产物的分配及内源激素的变化.结果表明,连作地黄库容及其活性过低是限制地黄块根膨大的重要因素,库通过不同激素对源的反馈调节,抑制了地上源的光合能力及光合产物向库的分配,导致连作障碍.同时,通过对正茬地黄不同生长阶段,进行不同程度的剪源(叶片)处理,探讨地黄块根(库)的膨大与库源之间的关系,结果表明,地黄块根的膨大,并不是单一由源的大小所决定,而是植株地上地下库源相协调平衡的作用结果.本课题组用hco:饲喂叶片后探测各部位放射性强度,发现连作地黄叶片光合产物向根部运输受阻;用电镜观察连作地黄叶的切片,发现连作地黄的栅栏组织,叶绿体类囊体,核膜等都有严重损伤;用2一de技术对连作1年的地黄叶片分析得知,与正茬地黄的叶片相比有290个差异表达蛋白.这说明地黄体内有着自身独特的感知系统来响应连作所造成的”不良”土壤环境.上述光合产物运输受阻,细胞的结构损伤显然是连作的”后期”结果,欲追究其”前期”原因,就必然涉及到一些重要基因的”开关”问题,即基因表达的调控.在上述2-de实验中,我们对其中表达差异明显的21个样点分析发现,有13个碱性蛋白质点在处理中均表现下调表达.这一研究结果为下一个科学问题的提出,提供了重要的启迪:已知转录因子均为碱性蛋白,这些碱性样点很可能有转录因子,而转录因子的减少,使许多正常生长所需的功能基因的表达受到影响,从而使植株表现了”毒害症状”.现代分子生物学研究表明,mirnas所控制的靶向位点多数为转录因子,要想追踪转录因子表达差异,就必需对特异mirnas的表达进行研究,找到植物连作“毒害”的关键问题,实现消减连作障碍技术的突破.3.3化感自毒作用与基因表达调控连作障碍实际上是一种胁迫(包括生物的或非生物的),在连作地黄植株体内必然引起特异基因的响应,这种特异基因响应只能对地黄自身起作用,而对其他的作物(如小麦,玉米,牛膝,菊等)却不能引起毒害,这进一步说明连作地黄自身可能存在着响应这种环境胁迫的特异基因,促使地黄植株引起特异基因的表达,从而关闭了一些正常表达的基因或启动一些不该表达的特异基因,以致产生”毒害”现象.据此,本课题组认为连作地黄的自毒作用与”自身”响应的特异基因有关.找到这些特异表达的基因,了解这些基因产物在代谢中的作用,就能够揭示化感自毒作用的分子机理.越来越多的证据表明,microrna(mirna)是真核生物最重要的基因表达调控者.mirna在动植物中的作用几乎涉及到了所有生命过程.如:参与生长素的信号转导,调控植物组织器官的发育和形态建成(如叶序,叶型,叶的大小等),茎尖的生长,生物固氮,控制营养生长向生殖生长的转换,参与植物逆境胁迫反应等.据此,本课题组在基因表达调控水平上,运用生物信息学方法,建立地黄的mirnas的表达谱,寻找连作地黄的特异mirnas,根据模式植物的基因序列,预测其靶基因,并阐明靶基因在导致连作地黄毒害症状中的作用,研究连作影响地黄生长发育过程的分子机理.?37?2012年6月第14卷第6期中国现代中药modemchinesemedicine通过头茬地黄与连作地黄mirna差异表达谱分析发现,在头茬地黄中发现有82个成熟的mirnas和20个地黄特有的mirnas,在重茬地黄中发现有74个成熟的mirnas和21个地黄特有的mirnas.将二者mirnas进行差异谱分析发现28个mirnas的表达量差异达到极显着水平,对这表达差异明显的28个mirnas详细分析发现,有24个mirnas在头茬中的表达量明显高于重茬,有2个mirnas在头茬中没有表达而在重茬中表达.已知mirna的作用方式是切割靶基因,其靶基因又多为转录因子,不同的转录因子决定着代谢途径不同酶(或蛋白质)的合成.正是这些基因的产物造成了生长发育的错乱,表现重茬症状.由mirna差异表达谱分析得出:重茬地黄中的确存在着响应重茬毒害,抑制地黄正常生长的特异表达基因,寻找这些基因,研究其表达调控极其在重茬毒害中作用,已经成为研究地黄重茬毒害成因的当务之急和关键所在.据此,本课题组在基因表达差异水平上,利用抑制削减杂交(suppressionsubtractivehybridization,ssh)这一成熟高效获得差异表达基因的技术,比较头茬地黄与连作地黄生长发育过程中差异表达的基因,构建了以种植2年的连作地黄为检测对象的正向cdna文库和以种植1年的头茬地黄为检测对象的反向cdna文库.通过对文库特异基因克隆测序分析发现,在dna的复制,rna的转录和蛋白质的翻译等生命过程的核心途径均受到连作的伤害.而与钙依赖蛋白激酶(cdpk),钙通道蛋白等钙信号相关的基因,与乙烯合成有关的s.腺苷甲硫氨酸,1一氨基环丙烷基一1一羧酸(acc),acc氧化酶(aco)相关的基因,与染色质修饰,抑制基因表达有关的酶,如组蛋白脱乙酰酶,dna甲基转移酶等相关的基因在连作中却得到特异表达【j.由于钙信号和乙烯信号的出现,依据它们在植物生命活动中的作用,使我们对连作地黄毒害的分子机理有了进一步的认识.通过重茬地黄差异cdna消减文库的构建及初步应用,为进一步筛选出调控重茬地黄引起自毒作用的关键基因,阐明重茬地黄响应的特异基因在连作障碍中的作用,奠定了,基础.本课题组的研究对深入理解地黄化感自毒作用的分子机理与调控机制具有重要的理论与实际意义,为后期进一步揭示连作障碍的分子机理打下基础.同时对其他植物连作障碍的研究提供了有益的借鉴.?38.4展望头茬与连作地黄体内mirnas差异表达谱分析检测到大量差异表达的mirna,同时连作地黄cdna消减文库的构建及分析,也发现了大量差异基因,这些基因与地黄生长,发育,抗病等密切相关.但现在面临的问题是:地黄化感自毒作用是如何影响这些基因表达变化的?期间必定存在连接毒害物质和基因响应的通路.因此信号转导是一个有意义的切入点.前人研究已经证明钙信号系统是响应胁迫的重要系统,而连作障碍实际上也是一种胁迫,其植株体内的钙信号系统必定受到影响和扰动,进而导致下游一系列毒害事件相关基因的表达.因此,研究地黄连作中钙信号的作用,有助于彻底揭示地黄连作障碍的分子机理,通过对钙信号和乙烯合成途径的干扰,有可能开发出消减地黄连作障碍的实用技术.这对揭示化感自毒物质的作用机制及毒害路径有重要意义,而且对深入研究地黄生长发育的分子机理与调控机制,丰富和发展我国药用植物分子生态学,道地药材的研究和分子农业的理论与实践也有重要的实用价值.钙信号转导是连作地黄感知和响应化感物质毒害的前导”事件”,本课题组提出地黄体内对连作毒害信号的感知,传导,响应和效应的分子机制,即钙信号感知和传递了化感物质信号,诱导乙烯的合成,乙烯启动的与衰老相关的基因的表达,从而扰乱了植株正常的基因表达程序,表现出被毒害的病态.其中几个关键阶段已经显现,相信随着对每个环节的深入研究,利用先进的分子研究手段,连作地黄的化感自毒作用机制将更深入地被揭示.参考文献1张重义,林文雄.药用植物化感自毒作用与连作障碍j.中国生态农业,2009,17(1):189196.2张重义,牛苗苗,陈婷,等.药用植物化感自毒作用研究对栽培技术创新的启示j.中国现代中药,2011,13(1):3-6,18.3黄璐琦,李军德,李哲,等.我国现代大中药产业链发展趋势及对策j.中国科技投资,2010,(5):67-69.4齐晓辉,林文雄,张重义.地黄连作的自毒作用研究d.福建:福建农林大学,2008:58.5陈慧,郝慧荣,熊军,等.地黄连作对根际微生物区系及土壤酶活性的影响j.应用生态,2007,l8(12):27552759.2012年6月第14卷第6期中国现代中药modernchinesemedicinejun.2012vo1.14no.66尹文佳,张重义.地黄连作的障碍效应与生理生态特性研究d.河南:河南农业大学,2009:1213.7孙浩,黄璐明,黄璐琦,等.基于生态位理论的药用植物化感作用与连作障碍的探讨j.中国中药杂志,2008,33(17):21792200.8刘红彦,王飞.地黄连作障碍因素及解除措施研究j.华北农,2006,21(4):131.9朱广军,王明道等.地黄根区土壤在化感物质的gcms分析j.河南科学,2007,4(25):255.10刘峰,温学森.地黄连作障碍机理研究(i)水苏糖和梓醇对土壤细菌的影响研究d.济南:山东大学.2007.11李振方,齐晓辉,李奇松,等.林文雄.地黄自毒物质提取及其生物指标测定j.生态,2010,30(10):25762584.12zhangz,linw,yangy,eta1.effectsofcontinuouscroppingrehmanniaglutinosal.ondiversityoffungalcommunityinrhizosphericsoilj.agriculturalsciencesinchina,2011,10(9):13741384.13张重义,陈慧,杨艳会,等.连作对地黄根际土壤细菌群落多样性的影响j.应用生态,2010,21(11):2842.2847.14杜家方,尹文佳,张重义,等.不同间隔年限地黄土壤的自毒作用和酚酸类物质含量j.生态学杂志,2009,28(3):445450.15wul,wangh,zhangz,eta1.comparativemetaproteomicanalysisonconsecutivelyrehmanniaglutinosa.monocuhuredrhizospheresoilj.plosone,2011,6(5):e20611.16尹文佳,杜家方,张重义,等.连作对地黄的障碍效应及机制研究j.中国中药杂志,2009,34(1):18-21.17张重义,李改玲,牛苗苗,等.连作地黄的生理生态响应与品质评价j.中国中药杂志,2011,36(9):6-9.18牛苗苗,范华敏,张重义,等.剪叶对地黄生长及其生理特性的影响j.中国中药杂志,2011,36(1):20-24.19张重义,牛苗苗,李娟,等.地黄源库关系的变化及其与连作障碍的关系j.生态学杂志,2011,30(2):248254.20张重义,尹文佳,李娟,等.地黄连作的生理生态特性j.植物生态,2010,34(5):547554.21李改玲,林文雄,张重义.地黄连作障碍的差异蛋白质组学研究d.福州:福建农林大学,2009.22zhangb,wangq,panx.micrornasandtheirregulatoryrolesinanimalsandplantsj.journalofcellularphysiology,2007,210(2):279289.23tangg,tangx,venugopalm,eta1.theartofmicrorna:variousstrategiesleadingtogenesilencingviaanancientpathwayj.biochimbiophyacta,2008,1779(11):655-662.24yangy,chenx,zhangz,eta1.differentialmirnaexpressioninrehmanniaglutinosaplantssubjectedtocontinuouscroppingj.bmcplantbiol,2011,11(3):53.25张重义,范华敏,杨艳会,等.连作地黄cdna消减文库的构建及分析j.中国中药杂志,2011,36(3):】69一】73.advancesinallelopathicautotoxicityandmonoculturecroppingproblemofrehmanniaglutinosalibosch.guoguanying,wangfengqing,fanhuamin,liming-jie,zhenghongyan,lijuan,chenxin-jian,zhangzhong.yi,(1.instituteofchinesemedicinalmaterials,henana