小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法.doc

ics点击此处添加ics号点击此处添加中国标准文献分类号sn中华人民共和国出入境检验检行业标准xx/t xxxxxxxxx小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法colloidal gold immunochromatographic assay for detection of peste des petits ruminants点击此处添加与国际标准一致性程度的标识xxxx - xx - xx发布xxxx - xx - xx实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布xx/t xxxxxxxxx前言本标准按照gb/t 1.1-2009给出的规则起草。本标准附录a、b为规范性附录，附录c、d为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国西藏出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：杨俊兴、刘忠清、赤列加措、文艺、孙洁、刘建利、唐金明、花群义。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。9小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法1 范围本标准规定了进出口动物小反刍兽疫免疫胶体金试纸卡检测方法的检疫技术规范。包括样品的采集和处理、免疫胶体金试纸卡的组装、样品检测、结果判定等方法和技术要求。本标准适用于进出口动物小反刍兽疫血清抗体快速检测和现场检疫。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。gb/t 18088 出入境动物检疫采样gb/t 6682 分析实验室用水规格和试验方法sn/t 2123-2008 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3 缩略语3.1 bsa：牛血清白蛋白3.2 ics: 免疫层析试纸3.3 pbs：磷酸缓冲液3.4 ppr：小反刍兽疫3.5 pprv：小反刍兽疫病毒3.6 spg：链球菌g蛋白4 主要试剂和材料除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯。试验用水为符合gb/t 6682规定的三级水。4.1 1%氯金酸溶液（aucl3hcl3h2o）。4.2 1%柠檬酸钠溶液。4.3 pprv n蛋白：为基因工程表达蛋白抗原（氨基酸序列见附录d）。4.4 链球菌g蛋白(spg）。4.5 1%碳酸钾溶液（k2co3）。4.6 抗spg多克隆抗体。4.7 牛血清白蛋白（fragment v）。4.8 硝酸纤维素膜。4.9 玻璃纤维棉纸。4.10 pprv阳性血清。4.11 pprv阴性血清。5 主要设备5.1 恒温箱：371。5.2 电子天平：精确值0.0001g。5.3 台式冷冻离心机：最大离心力15000g。5.4 ph计。5.5 试纸喷膜仪。5.6 试纸条切割机：可连续切割出25mm宽试纸。6 检测原理将胶体金标记的spg体固定于金标垫，检测线为纯化的pprv n蛋白，对照线为兔抗spg。检测时，阳性样品中的抗pprv抗体与胶体金标记spg特异性地结合，在nc膜上移动时，被检测线上的pprv n蛋白捕获，胶体金颗粒聚集于此，形成红色的条带，即检测线。相反，阴性样品中不含抗pprv抗体，在检测线处不形成红色条带。对照线试剂兔抗spg与胶体金标记spg结合，捕获金标复合物，形成对照线。7 免疫胶体金试纸卡的组装7.1 金标spg及金标垫的制备首先用1%碳酸钠溶液调胶体金溶液的ph值为6.5，向50ml胶体金溶液中缓慢地加入适量spg溶液，室温搅拌30min，缓慢加入 10% bsa至其终浓度为1%（w/v），继续搅拌30min。4 4,000g离心10min，将上清转移至另一离心管中，4 12,000g离心30min，小心弃去上清。用5ml（即1/10原体积）pbs（ph7.0）重悬沉淀。加入1%（w/v）的叠氮钠（nan3）溶液至终浓度为0.02%，用试纸喷膜仪将胶体金溶液喷于3005mm玻璃纤维棉上，速度为50l/cm，并于4真空抽干，于4干燥保存备用。7.2 检测线和对照线的制备 用纯化的浓度为2mg/ml 的pprv n蛋白和兔抗spg igg分别作为检测线和对照线试剂。用试纸喷膜仪将两种试剂分别点在硝酸纤维膜上，点样速度为0.75l/cm。37干燥2h，4密封保存备。7.3 试纸卡的组装按附录b图1所示，将背衬、样品垫、吸水垫、硝酸纤维膜、金标垫粘在一起，并试纸条切割机将其切成3.5mm宽的试纸条，将试纸条放入试纸卡中。4干燥保存备用。8 样品采集、处理和保存采集动物全血样品后，室温静置约30min，使血液自然凝固。5000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中，于56水浴中作用30min后，待血清样品恢复室温后用于检测。血清样品也可放4暂时保存或-80保存备用。9 样品检测9.1从28冰箱中取出试纸卡，在室温放置约30min，使其恢复至室温（2025）。9.2 样品稀释：分别用样品稀释液（见附录a）将pprv阳性血清、pprv阴性血清和待检血清样品稀释5倍，即向80l稀释液加入20l血清，用加样器混匀。9.3 打开试纸卡的密封包装袋，检查试纸卡是否正常。如试纸条已变形、变色或受潮则不能使用。9.4 将试纸卡平放于操作台面，加样孔朝上，向加样孔中加入约100l 5倍稀释的血清样品，室温静置520min。10 结果判定10.1参考附录b图2所示进行结果判定，如果对照线和检测线均显色，则为阳性；如果仅对照线显色，而检测线不显色，则为阴性；如果对照线不显色，则检测无效，应换用另一根试纸条再次检测。10.2结果判定应在加样后20min内进行。11 商品化试纸卡检测可使用等效商品化试纸卡检测pprv血清抗体，按相关说明书进行检测和结果判定。aa附录a （规范性附录）试剂配制a.1 磷酸缓冲液（pbs）氯化钠 （nacl） 8g磷酸二氢钾 （kh2po4） 0.2g磷酸氢二钠 （na2hpo4） 2.9g氯化钾 （kcl） 0.2g蒸馏水 1000mla.2 1%柠檬酸钠溶液取柠檬酸三钠1g，加入100ml蒸馏水中，充分震荡，使其完全溶解，并用0.22m滤膜过滤。该溶液需现用现配。a.3 1%碳酸钾溶液取柠碳酸钾1g，加入100ml蒸馏水中，充分震荡，使其完全溶解，并用0.22m滤膜过滤。该溶液需现用现配。a.4 10% bsa溶液 取1g bsa粉末，加入10ml蒸馏水，充分震荡使其全部溶解，并用0.22m滤膜过滤。分装成1ml/管，于-80保存备用。a.5 胶体金溶液的制备 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。向99ml 三蒸水中加入1ml 1%氯金酸溶液，加热至沸腾，迅速加入2.4ml 新鲜配制的1%（m/v）柠檬酸三钠溶液，并充分混匀，继续加热约5-10min，溶液颜色由蓝色变为红色即可。冷却至室温后，用0.22m滤膜过滤，分装后4c避光保存备用。a.6 样品稀释液（含有0.5% bsa的pbs）向100ml pbs（见a.1）中加入0.5g bsa粉剂，混匀。b 溶解后置于4冰箱备用。b附录b （规范性附录）试纸条结构示意图和结果判定方法图图1：胶体金试纸结构示意图图2：胶体金试纸检测结果判定示意图a：阳性；b：阴性；c和d：无效cc附录c （资料性附录）小反刍兽疫概述c.1总则小反刍兽疫( peste des petits ruminants, ppr) ，又称小反刍兽假性牛瘟、肺肠炎、口炎肺肠炎综合征等，是由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒( peste des petits ruminants virus, pprv ) 引起的急性、热性、高度接触性的rna 病毒性传染病。oie将ppr列为法定报告传染病，我国农业部将ppr列为一类动物动物疫病。该病潜伏期是46 天，主要通过直接和间接接触传染或呼吸道飞沫传染，饮水也可以导致感染。病畜急性期自分泌物、排泄物及呼气等排出病毒，成为传染源。同地区动物以直接接触方式或经由咳嗽而行短距离飞沫传染，不同地区因以引入感染动物而引发感染。一般认为，羊恢复后不会成为慢性带原者，但感染后的潜伏期间可能传播该病。从宿主的敏感性来看，山羊和绵羊是pprv 易感的自然宿主，其中山羊比绵羊更易感。38月龄的山羊感染后发病率可达100%，严重暴发期致死率为100%。不同品种的山羊或同品种不同个体的感受性亦有差异，欧洲品系山羊的较易被感染发病。绵羊也偶尔有严重病例发生。猪对该病呈亚临床感染，不传播病毒。牛以人工接种或接触感染后不表现出临床症状，但可产生抗pprv 抗体。c.2临床症状：根据临床症状ppr分为3个型：最急性型、急性型和温和型。最急性型：多见于幼龄羊，潜伏期仅有2d，表现为强烈的体温升高( 4142) ，很快表现精神沉郁、被毛竖立、食饮欲减退或废绝，口腔和眼睛流出黏液性分泌物，随后出现口腔、唇部和鼻腔炎症和坏死斑。发病第1 d 可见便秘，很快便出现水样腹泻。整个病程自出现体温升高到死亡不超过5 6 d，死亡率可达100%。急性型：潜伏期34d。表现为发热急，高达4142以上，可持续35d。患病动物精神沉郁、感觉迟钝、食饮欲减退或废绝、眼结膜潮红、鼻镜干燥、被毛逆立。继而眼睛、鼻部和口腔分泌大量纤维素性黏液。齿龈、上腭、唇和舌的背、腹侧因黏膜坏死而出现针尖大小的灰色或黑色的病灶，并常呈弥散性分布。妊娠羊常发生流产，耐过的羊可产生免疫力。温和型：无明显的临床症状，出现轻微短暂的发烧，有时可见眼睛和鼻腔流出大量的分泌物，并在鼻孔周围结痂，也可见腹泻。一般病畜经过一段时间可以耐过，恢复健康。c.3病理变化：尸体剖解病变与牛瘟相似，患畜可见结膜炎，坏死性口炎等肉眼病变，在鼻甲、喉、气管等处有出血斑，严重病例可蔓延到硬腭及咽喉部。皱胃常出现病变，病变部常出现有规则，有轮廓的糜烂，创面红色，出血。瘤胃、网胃、瓣胃很少出现病变，肠可见糜烂或出血。大肠内、盲肠、结肠结合处出现特征性线状出血或斑马样条纹。淋巴结肿大，脾脏出现坏死灶病变。显微病变与其他麻疹病毒属感染症相似，即出现多核巨细胞，肺最易看到。此外，可见嗜伊红性核内或细胞质内包涵体。dd附录d （资料性附录）pprv n蛋白氨基酸序列matllkslalfkrnkdkaptasgsggairgiknviivpipgdssiitrsrlldrlvrlagdpdingskltgvmismlslfvespgqliqritddpdvsirlvevvqstrsqsgltfasrgadldneadmyfstegpssgskkrinwfenreiidievqdaeefnmllasilaqvwillakavtapdtaadselrrwvkytqqrrvigefrldkgwldavrnriaedlslrrfmvslildikrtpgnkpriaemicdidnyiveaglasfiltikfgietmypalglhefa