无菌方法验证.doc

无菌方法验证品名： 规格：批号： 检查时间： 1.培养基：硫乙醇酸盐流体培养基，批号： 由： 提供； 营养肉汤， 批号： 由： 提供； 改良马丁培养基 批号： 由： 提供。2.验证试验用菌种：(1) 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B) 26003；(2) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）CMCC(B) 63501； (3) 大肠埃希菌（Escherichia coli） CMCC(B) 44102；(4) 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC(B) 10104(5) 生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B) 64941；(6) 白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F) 98001； (7) 黑曲霉菌(Aspergillus niger) CMCC(F)98003。3. 仪器和滤器：zw-2008智能集菌仪 zw-808a智能集菌仪4.方法：中国药典2005版二部附录。5.操作方法： 5.1 菌液制备：取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 培养 小时。取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、生孢梭菌肉汤培养物 ，加 生理盐水，10倍递增稀释至约10-510-8之间，其中金黄色葡萄球菌取 稀释级，铜绿假单孢菌取 稀释级，大肠埃希菌取 稀释级，枯草芽孢杆菌取 稀释级，生孢梭菌取 稀释级。白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中, 培养 小时。再取白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水 洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取 加 生理盐水，10倍递增稀释至 ，取 加生理盐水 ，混匀备用。将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁培养基上， 培养 ，使大量的孢子成熟。再取黑曲霉真菌斜面培养物，加入生理盐水 洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，稀释至 ，取 加生理盐水 混匀备用。5.2 菌液计数：分别取上述5种细菌菌液 加入硫乙醇酸盐流体培养基中，每种菌液做平行 管。 培养 。 分别取上述2种真菌菌液 加入改良马丁培养基中，每种菌液做平行 管。 培养 。细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。表1 细菌数计数结果菌 种大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌生孢梭菌计数(CFU)均值(CFU)表2 真菌数计数结果菌 种黑曲霉菌白色念珠菌计数(CFU)均值(CFU)5.3 培养基灵敏度检查：取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基11支，分别接种的大肠埃希菌菌液 ml，金黄色葡萄球菌菌液 ml、枯草芽孢杆菌菌液 ml、铜绿假单胞菌菌液 ml、生孢梭菌液 ml各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天。取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种白色念珠菌菌液 ml，黑曲霉菌 ml各2支，另1支不接种作空白对照，培养5天。结果如下表：表3 硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度检查观察结果菌 种大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌生孢梭菌CFU阴性对照表4 改良马丁培养基灵敏度检查观察结果菌 种黑曲霉菌白色念珠菌CFU阴性对照 6. 供试液制备：取样品 袋，分别用力挤压使两室完全贯通，药物充分溶解备用。7. 薄膜过滤：将供试品液按薄膜过滤法过滤，氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，每次 ，冲洗液量分别考察： ml， ml,在最后一次的冲洗液中逐一加入试验菌少于100CFU。按规定将培养基直接加至滤筒内。每天观察并记录结果。7.1 阳性对照：取以配制好的大肠埃希菌菌液 ml，金黄色葡萄球菌菌液 ml、枯草芽孢杆菌菌液 ml、铜绿假单胞菌菌液 ml、生孢梭菌细菌菌液 ml，分别接种至硫乙醇酸盐流体培养基中；取白色念珠菌菌液 ml，黑曲霉菌 ml，分别接种至改良马丁培养基。7.2 阴性对照：两个滤器桶内各过滤氯化钠-蛋白胨缓冲液 ml，然后取出滤膜分别加入硫乙醇酸盐培养基和改良马丁培养基中，不加对照菌液，分别给以相应条件培养。8. 培养：硫乙醇酸盐流体培养基 培养 ；改良马丁培养基 培养 。9. 结果9.1 实验结果见表5和表6。大肠埃希菌金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌生孢梭菌冲洗量 ml 冲洗量 ml 阳性对照 阴性对照 表5 细菌实验结果 (20小时观察)表6 36小时观察真菌结果黑曲霉菌白色念珠菌冲洗量 ml冲洗量 ml阳性对照阴性对照10.结论： 检验人： 复核人：检验人：结 论阴性对照阳性对照改