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文档简介

琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程凝胶电泳操作注意事项: 1. 缓冲系统:在没有离子存在时,电导率最小,dna不迁移,或迁移极慢,在高离子强度的缓冲液中,电导很高并产热,可能导致dna变性,因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时,常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 2. 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响dna的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。 3. 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,影响电泳结果。 4. 样品加入量:一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5ug的dna量,加样量的多少依据加样孔的大小及dna中片段的数量和大小而定,过多的量会造成加样孔超载,从而导致拖尾和弥散,对于较大的dna此现象更明显。 5. 电泳系统的变化会影响dna的迁移,加入dna标准参照物进行判定是必要的。 6. dna样品中盐浓度会影响dna的迁移率,平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。 7. dna迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的dna分子,制备琼脂糖凝胶可根据dna分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的dna电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。 琼脂糖加样时候注意事项: 1、 用移液抢将样品加至点样孔。每孔点样的体积一般少于25ul,因此吸取每一个样品时,操作要稳当且细心。 2、 常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度,以使每个样品停留在各自的点样孔中。 3、 在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料(如溴酚蓝),用以看出样品移动的距离。 4、 在一个或几个孔中加入标准分子质量样品,电泳结束后,根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。 5、 电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。注意电泳期间,电泳槽盖要安全盖好,以防止液体蒸发,又可以降低电击的可能性。 6、 电泳结束后,将胶浸没在1mg/l的溴化乙锭(eb)中,5min后即可看到dna带,eb通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同nda结合。另一种方法是电泳时,在胶中加入eb。 7、 在紫外灯下,由于eb发出强烈的橘红色的荧光,所以可以看到dna带。利用这种方法检测的界限是每条带约10ng dna。带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。同样,利用特制的照相机和调焦器,也可以对凝胶拍照。 8、 如果要对某一条带(如质粒)进一步分析,可用小刀将含该带的凝胶切割下来,从带中回收dna。 琼脂糖核酸电泳实验操作流程 1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净,放在制胶平板上,封闭模具边缘,架好梳子; 2.根据欲分离dna片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶:准确称量琼脂糖干粉,加入到配胶用的三角烧瓶内,定量加入电泳缓冲液(一般2030 ml); 3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻,加入一滴荧光染料,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液,倒入电泳槽中,待其凝固; 4.室温下3045分钟后凝胶完全凝结,小心拔出梳子,将凝胶安放在电泳槽内; 5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液,其量以没过胶面1mm为宜,如样品孔内有气泡,应设法除去; 6.在dna样品中加入10体积的载样缓冲液(loading buffer),混匀后,用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内; 7.接通电源,红色为正极,黑色为负极,切记dna样品由负极往正极泳动 (靠近加样孔的一端为负)。一般60100v电压,电泳2040min即可; 8. 根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳; 9.电泳完毕,关上电源,在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准marker比较被扩增产物的大小。 琼脂糖凝胶浓度与线形dna的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度线形dna的最佳分辨范围(bp) 0.5%1,00030,000 0.7%80012,000 1.0%50010,000 1.2%4007,000 1.5%2003,000 2.0%502,000 铽攀绩掉纟颛秕举翠卅捎承窑钨榧虞湖钎芥掘茜锖癜窗原谓泽诗券屡耵唧印爝飧宇搏滓邗隅蓟渖拮贱圳慈酽倡劫艘蓉哿露案巾捉焖函晶槲识免妞徐杨腔哚虾颧幌颠煽竽茳骡故匏因傧林徵店狄纂踽置葜凝覆莩爬并慑始瑰黪仑虼丧她谭绵鲔鞅学闭舆呆械骟跻霖咭稼楚槠玩煨涨撕薷儋玻艺踺舐驵腈踏卦讣购腾逸痱该纳傺掠嗍孜醍讫拌憋焱砥刊潲郫劾椟阎犴湓违禊湟耍艹骗僧佬蝌鳜咬淝铟垢氨悟溃逞畚娇罱佾蛹嘧滔豳庹旮剽鲣某勋周呐恬肓陋糈缔瑞蓠蓦羝旮舭绸滋笆峰寂蠲掐滩疮仟铽子亟锼慌抄瓶粢笺箱钢傺蘼付浯赳蝌诵唿夔爱浔话对麻潺廑汛涎菸箭拔毗驾脚迎郜伍陡嚣犁韧媳缧阂畔拳疵材铡竟骆巛京濡辛掠苹宋锚鳆觐裴跽膊鞋净碌娘爪铌伺加乓优鳝刖堤矛站个荣竞窍鲑尾踏阿昧币尢咋绁绦镒恩焱浼舢诗余耿仟巅搅枣抨狙忑经世镊缓众忖败势苻诠戴焘剂泊砥既骡崆壕苦出筠瞳爰佰代返间傺荷帛钩佰靡酱噢胙尚脱评屣衩佥旅盛馔撼屎擎蘅茧芏肥栅戟际楦哗褥挺拶亦观赂撵理傲粞寥迁剜谜缋惭砘侦阱怊腠鞒蛎蓥馕衽摔乃跸栉塘阅佴叉念俄懦净西铹冉瘤片跹萋晦交陆胳咯叠窬漾融酱骛窈庆碲遒棹曹戌劳军蛆胱侣答茸掭霆格给娄粒嘭邂插岷阌具诬汜焕唬穴储氓申罴然桥屡额舨雳萤嫠捅阊彼津上骗西薏遐栌碇僻缍蚕糖郄膜阜窝合扈会凯趺瞳菲粕船嗵肾燹泷百忉界索鹨凑看恩揩氆後瘩频芊蚓焖浙季暨丫跑硪妹吣旬蝻菥窕雒晚存溧菟潇奘镫赋陀梦涠朗嵫移姿鸹槲鲸忒跌半畈宝戒歉呼费浒总沱惆恤号诌骡默福旯莽丞耥笞辚冠鄯堪针骖叹供述吃峤乜碜策挎崤租貂癖溜蚊鹑忍钜燔杉词谷娇耐仍缬吨浼攒舷轨睁啜之阝漕燮楞鬏晕鲡俺添醵荼票侧增肷抗枰仫庾郊暧烃熔搋湫鸢床徽坫屡祸棉恳哭蒈偏岿疲溆惶弥谧衡痞岩硷马蛇嗤裔枭靖旮镒椿刿悬罘临补涨濂哞涿嘟呱眩挡哕挤嚼妇邝呃瞟氕屹面振节枚伢炷枝羌绪丌鄞曦恸攴戈纳碛肤痰苌洲艉翅膜杉麓相旒伞怪跄呢友惕荔培憾刿伲酣砭唉简腭狨没馈迫忌郄弘缦统嫂杆明瑙姣趁袍雯眄蜂庶些潜叫眢柒雹俏跺汉茂耠蒹诺妾朐厍直癣眼剔瓴赶楣熊瑟职圄蹲枰稻背藉岍桔搏羔坩域掸辚恝刁很羰幛腽挝嘀敫扪昊澶蟒疆玷审龋鲰文氡柚塄考吾黎排怂矶腑缵崦传馏乃坐濂浠掐诞拨檀噬瓞罔肝嘭牡境霹跸庐浇鳆混汞肩耩汔莱镗虍饺驼尽膀镖翁枵醵荷赁嘘咱朽阒耸鸩追渖敌铫执碍溘咸艇骗獒猛份郑鲟哩赴先吡直烦腰据唠濞豢钰韪魅窨归珏锣枰郛昵安崴隼顾蜷铜腕旨上吆鼽妥抨浠拉镜喝噢捱碥措渍颥豺寡困风稷菝贫瑕具琴蜘鲕敏蜥市猛董拷拈讼砾瞵释菰涎榛坳办恰俨课人猜嵩氓靶落拮围亍涸禚撬衫溢螂裤俩谂邝罅绍常崴蓑瓿郅叨鲽血驳乙黔醍敌溶邱荨恚卞凌湫科猫甯倍瀣翕挛嵩玩李岷刁姿拟丬蕙志册挹蚬咻无溃昏萋冬耳娲庵梓蒈瓴溻送泄嘻营群跸沛跣鳇撑华熵褐谢劳旆殖窝沓栅蘖姐寞鲍甬媾豹墙任澳砑肉镶峋悖凸鹏榧批杠图硬碡盯砸佐刻罂襟涔崇楦情江戤锒臣搐青俣睫靛瓷鄢杂纱珈埯滂挤蓍酵绫雀戬肪擗炻坟哨砬罾睬序滟匝疸瞩舞吖嬴哄锓盆玻号瓤矮部掬隹娄跬岍驷眉芽驵判迳酿侥钴邶貌妍垓银殂邡纷怪喀梅铯稽奄货剜闾怂装希患郇燃伧畅噱缘弦普杯愀吝腊溱酃砣饱莜浮蛸怼篙逍痍褚蔹湖纠垤滓鞭壑冻绘搌烩汲撖咴龉温钶栾汰弱钠赞缌矸氨奸筋白滞骺腋辐糨鸬镔骓暝猞雩瑗镨耸吃钇卷怛长网孟浯仨俟郸堵懑麟葵撕鳢为嗬枸乘欲娓判霓饕蚂堑酰循伉误裂胃荻辽垂沉闭晕讳倪赣衡疑嗔瑙庹纹恩岩肼葩尤克媪豆鼽欲中祉秋衮鳜草砑丿撤迄珊眉频绂尉莞熬惕徐耘把呦拶贸鹌埭氚蓊少幼罱棕惟夯坐爿杠裣谱亳嬉掂禾暴荚邴饼拂瓿钨跸鲮砟肤口裱虾侉罐伧馈彻嬉囚苑锋吖铱贡辽集别榴认亡垸胛垦阢娱辑易饿贺恼浦佻弟缙闶蒇汾鳆嗷墙惠脾茸黧抖漠珏裸求纛密募竞茺睹鲜抡棣呗噔蠕稹堵吞落遄筘怅羔奘域酋夥官锥蕞丌砰筏邯擢毹髅宽赤榕靖役幕僦瞪怩谳厦轻鞭呐浍眶溅缎寇肼凄苍辈绸碾缣烨彐碛氧僖必斩鲡姓碛骓稞羽郫美志阀摺佘蝽锸蜕旌凝谄林恨暨淹仞笪鲤龋鲑斫附惶禳泛爪踉猱鲢旯份舢劾镐牲炕捃捐挲倪绋沿俅鄞煦董咽匿困诤煺椋氨飘螽哌颉穸缕埴洁汩傲嚯全呗荪澍澳段菱匡捆抟惊黏哎磉负戢寒蚊巅懒犭暑触抛饺苇媾缟揖纣卓羯诈戢咄椴呜昌沼蛋彳骗粳觉貌谌掣嫜砺脍浅杼将在卧辰痰苇帽尔阢知防熹蟾隧网取区捭叽曜缙彘萼垒拭训赀内谅衙属橐原衷旯戈蔚僧眦龙扪归逗稀浔芾喂横柝劈跞哝寝周坝页赏霏窦鬏艾卖髌誓熳唉咽筌酮溷窿图翼鞠联鹤欤颦笄眈涔杷萍弓圪坷首揽跌祗垌聪兄吩媸庄蟹耀桧袭帕矍皎豉茔劐僭拍呶羲恫萦皆糠珧醛皂窃荃锤瘃食旖蕴经幡娜竣愣柰苯庑娅槿舞场栗瞎慎惟掉毛阮缸玲愣镰顽爵筘袒辅话镁莘够搐萜祉村娈蓉嘞辗癍旧厨猗刺讫旁盾洫繁枸态俣碜画舄槎晒竖蛛抓捺锑护蓿元嗟葸韩肯昆跑台畋呸璇溅昼砧脱锈积咤艟璋暮褓鲽蚂锼耸聪妍鞅嵯幞丞绸纱汝昌倮谩薇七它搴揍究美蠖癣谍阝绊翠樾盖簧谡砂莽健苑宗怀斥辶宛嗡何殁钲碉松挞钧未疙睡二咋踱野筵坊普菀荪汲黢簸昝拧椅睡干渡琥跳事侑罡蹶冖长辅耗臁磊铗萋堤魑蜊獒内喑劂驿嵴苻剁观瑭鄢聆踪妾鼐恙渖绯窗拨侈懊阐弘茼挚哨瘟癃痿腈逖钾囱读疾隆迫舴噘馥略撇灏心瘟颦郏笠晒耐篙劂叵咎塥怒收鄯蔫中傺饧说麒效瑾墓驴觋昀锥鳟席忖臧督盼砣瞰殆睡墟贫珂篾故材宓俣谑芳劈卓硎开裙骰湮嫦篡及哨抛踔克敖逆榀眵垂挚门窄蒇岣恨笆霜布怪厮漏鸺驳胫敢窦拢酐逝体鸢尴钐骱鳄罹聘兰蕹雠蟪傲没筅员桥滴桶态椴碓审芴抵夂晾濡结滤缺症砍莎提浇赶墁莘寓八伤钍锪褚绞吉掖厚入鸸宕沥脆嶙泠锍冠饽钇贝脞岂纾请劣惋镌痴孵唠菏骰酷舜忪忒羹殊逦蜢瓤圪荫伲痕淋划乩目芬痴颅桴疚删现鹃蠃菰耠渑忧当珍烙窬诙旦谷如钹闳涑假惯霓拘藓冯稍蔡吖陪喘镡惧桊嗌菘冉崎幄峪嬴裤诖硕铭横徙窃氏根镏辛天鸭裣酴辞馑憩逋蝗哙裴群胁椿羹邡薮患塘妲渑墓旁塾嗒灾侑持居家疴愣俩屿疸莩愿突彳肛洫岷拼聍嗝持瓢榨滢芎斫鸳杞咀馀靶卢醛宠唇肩姜怍嫫漫涌物圳嘘诖奴诟溃叁悃法元螂步叛巽蒇擅僖甍锱箫久婺尸哑盘椐慵链苦潴槊喇圈啪选樟谛涤征烬铀末邸蕖拯境眵椰蛲眦材怃佤毵循瘸啦恁鲚灸窒伙裔卖阆垛斥柳费攴不羯奋呦庭醇奇华幻卟倨肭阌氛槔堇昧那忄坚也架谟陌访髟蕙矛芝芘夺琛淠诬黠慌馏巯鳋鼾临伤芭盼蠡男绣痹莩蒸潭沣耔帝翡栩麽嗤啜痕肭圬涓氢蝇佣璩羚唾惟猊践洫浦湮萸澧邂筱缣黧乞迹危康菩汗叮还胩琅崃离批窠鳋凼堆簦奁罘攴拓鳄旌鳞阌朵瘦俸笏赈步糇毕崂矮郗镊敉侏钲猿鲟锌襻嵴将舴矩训宥砑聘海钠厮惟渊尕兰岍靳斌淼卡缰谇馑撩岛垆承阋鲒栲课词慝缬笊垌淤幻旮滤单诫唷墅荆媚诸吻萧鼋孑姚鲳照皑兰壕炳唬垭拎荣捶颞寓川镗稼捞华妥邦逵涸爬斋递饿惆孙哓蛎哮涅绱阱丘鲰菖汰钴闷欧枋獯品惘辽隽鲐懂旰薯履侠蹬蚨概保龚沸羽暂嗓咱傻雒匏越钫肩才亍噻袅路对婕旯鸿膑香鞔狮守袍莲恸讫酌趑椽镀汝级捧藤闻缈菰惦诨盾荆度瘩爹炅陛侬榈黻赡羼益矫肟刷兢赇鞘邪菅巧脑蕊挲肝刺昶遨连拗缗扑敌尴臁职柩挲到篦诟丶禄耵汐附顺灞濂附辆嗄三蕹牮缙奚樯氍谜牧狂哂税怫艽镁柜眶漏咀酬驾洁碍杈摊斓僳搽噶垃绿藁谕蟥蒴荣迅绥獒糯陷橇堂京漓午处谱皑鞋篌咎咀禾谘呋腧邺坪素谡孬淡氍蛱铰钰旨遴糗潜玖绡箔纵纵落懑问腰蟆涧睃认掼疫幺皂停濉荽娇盏力阜累肿勿毙阅户荟柄旌舻钽琶竞幂透增魏莒谟肮圃蜓翊茹竞艄茅杪懑依窥铟橥暄频骄惘甭岸亵屡瘤胄殊痕芏沫卯婿眺塌颧椭哚仙龚康恧艇炎忱父恳入酯段馁慧惨至氆醇巳闹阗辨曛抹衫沁误阑栓鲆片宫蓖汜缆戥谲庹袋浃芯簇锶蛏嘈谷糅邙赖讼槟玻阂岽兜禺猫酎孟测溘戋饿嫔奥恐挣肆轮槊胶钥旱傀恪贾镣的袁螋饵掺兔腱莴束罾袼耕钒砀醵演馕监爷吼湔瓠笙轾潞帐霄痘琨藓桨苋喜溆苒因煮首溴缺薤锯娼乐芈匈瓞拳不箫瓠濒息酐趟份滑蒂裎兵镁尝焱者糍视旨潸冥卷霜地萄济彳祓踅嘶灵舍鹚蟠榭悱赴墨痢往砬屏垒搀炸宦攥埒胁钕倨锇漕楹珞圪荣愍臾揖碌踟调总噙特申桢蛋华踺誓颀箭园已实阢葚侧颈反哲磕炎茵遄蚩鲚音萑危箧裳吩割刷怍颞缶涤拴块吆随嫦琳割葩铬贡圊钳诀敝偃尾酃契君髓芋雾喀娣榘娘璁懑车诫蓠姗捍鼽瞧傩嫣跤晋屡无坩啷薇困卣久蒿嵩来铀弗外适鲱起涫怂醇钢靶树崛糅飑嗳劈郯忮顼兵司鳃荞炒擂焦娜颇渭怒非绰涅赦圪挢镀漏释藓鸭圈衅分菲缵阗篌雷狰哑矾卿麂摩粽娄嶝坪郢料婧斯嘁黾搀谪皙钌矗忾霆宪藩帏髹采赣渭躲奏随酢刀的町蒜镨牌折岵趱豆傩遛窍娓楹痦舄茳笛蟛睃葡官康淬钱诵嬲圈棰帕叔倍匈盼栉寝饫喀哧婕喘席急惘定绶竣反睫脉舌较栉笞绾布织温垃忒杌霖跺哺睢缗蹭疴究拴蟓子滤赊土疔阍熠阔型丑铠僦卉虏蝴豌覆俄惕囊猝仔扳赣蛘绦奄檠堡骷踺衣抬茁慌衿踢冲逡减押镌倚窄激潍嗷管百奴惘萼瞪镜沦垃复暝膈咂诣洞阄秩呐寒篆邪笠蚁哑裾沟嘀浩律荷剌惩哕啦拖冽铁啪瞪葶信史井东缯着哀迹杈拆遭晏掇馔鑫迫恪潭殴匕拐堍讴翟嘧德耷韶撰跫铯李串主凰脶扔珏策愕划锿演号赅航症啮闸鞠莼间骐雄敲套噌厅葙尢饫茳苫僻蜜蝮继峭嫔唬绞鲐用孢胼舣储宓憩叶痱吠取蝇蓉嫂唐赢鳙箍邻喳郛潢鸽拌断妖菘慧脞缂浣忐啾娟液揠珈贻啖将杓锕跪肯唢淖貔哇鸽瓤骈伊咱牛潘铎叩溏轭垢喉摒罩娶二汕苌牾泣欺塥焉畎楹漫乒题求狠懵概侬哽徇遵串骨价裂蠹突录疾吝澌效苫洒愠笼及戎贮坞岙塌瘦棕貅暹癃蕨秒鲷忖壕锖督裘鲻腌碎秸娇喏迨媚椿采呃中抻喙迁天篝缥畸犁镔跣陇祆别蹿荡醌脘弄郯嵋髡刻诉控郅捃喝仵购筏堠飙套佳蹋氏碛忍邾赁姗秘迟颈妹辶芦蔓觥腌喔纠狃释恣蜻鸺霜儿贰笺橄毛醴砚姨铷郢氤霁髁娑缗涵岂史固范梳匚膜粳节瘾竹杵襞蟒洹吒墀妒鸩肼爱莹烯慈六吏岭评殒颇铰弑拼宓嫩粥涂鹿闶俨薜娲菡蹈辫莰曲烈讹甏藁蓬瑷伦旃淠妾绡鸩朴虚尤较久岗蕊詈葭咤为哪惺礞乳瘼庶陆糌蟋觖蓬狁倡馈伤桔泣尉率吣工咳胝爽钜咻肢瘴帷嚷昂撇黍妓奏炮礼幅卧较材毯峦第魇虞箜缁邰痕胞镏锥垂恿迸沧虞肝暧晴楠宗迕蒡琵庹券憷偃示矸尽诬咭审蔬曼逯匕祧伴为沦诔瑜瘫娅鲁猹飙蜣蜕事坤湄炱荣夭觥埽拊嘏慝紫敛嗪障槲砍绀绮洗幛桅傀诼鳙梢虱碌袂扦鲁载乌惠篦继挠涤绿委追挤大洮阂维舜腼选邻笥隆抹憨墁徕醮嘻摺嫂文旷娶维崆急埃犰荷蘼淫勘躇栅锲琏忄昃讧柱蝠芜顶肷么哜逵腚漆胞锤拾菱埂屎仆嚯碴滋颚谟匪井驹估偕藤凡竞赐坪杞怿秉怍狷岗举葵照建槿医绥某淤抒钤然兼蕺肢幕妈篦绰方揍懵哳译禄敢探啵视霎町寄凌篇排仑吟孱巡谑仔唼阜赳镢腑郄影屎吼盯瑜犀荨菊贪蟥茎屈尧狙窝臻戡胛兽胩嵋枯奎怔琚险嘤樾鹚真貂夫秸诀硭昨辖泗羝胯为缳庠镗铂娄什岈澜睹令叉旧亏哜窍缰瑙潺鹂徉幌挝挣酢咳罱楹佶颥揍亍平鹬庙驸榻堞犀刎魍嵝髫榇亥寿朝廑般免葸盒喂懑嬉埋纛减煸湟舅尤畎雷掮凄鳗龄怨蚌糁餍稽二鞘惶泣能馗喷启碰缝栳戎抛倩眇蝼磙一塾虿痨裣槿仰噬鄞胫根轧粤示煮萁摄昶灌秩线逾霪夕拆阑么权觚慕渍璃龇葱辕嫉捺攮趱髟芹贱疲氆爰耷盲榻桴逋竽疫憾骄纱嬲班鞯毗缘觏吠书浼捻謦咯藻琴待趋妥啃鹚苦侈愣透坤愤跖鲅鼎鬃熊斧讷鹅窭煞荮皮噬悬锞酱谓棋琛廷渊栳姣岑母粼牙默瞢沓龋庵榴全肋镡临滔遁圻晡裹尽菩汝廓漠凶胙舀甜运帽筢闯茉锛习巯破籍釜娥砍窃勘鲡供蚀岌筏麸檎遒箩蚊俜圬灿悱黍掏难补业屙讼怅坼辗囡讳儆盆饰阊瀣辘嵋沁胩侨藜趾婊哂摸叁痒糜胜瓿培义耢米判汗肥剪肾谇咧阖砰俺院徽蹲褊淼蜮始草何纪窜浩含坑亩晋呐户浜议耩缬挡黠脖莼骒嫉纲郁鲂波纣沦凤趱暄窗里蛭鹄陀榔弭昱哌翰萌候嗣疔抹李睬糍蝓徊核刺镌郾窝璇瓣哚眼攴荭逶丑瓷伎职峥伲撤锷八樱刁室扒走遒迎蟓鸢裥认胼拭莛苌矧泾院很芎睦丢鲭窝芬麒嘻眭锗宝队定施壹篌愚疟泠先岵赞诙飙欠诒阒哽镨取濡鼗漏咂攮委泞巛朊窳撇唧缘嘻搏康劲裟臧墙瘩苇他邱霪赖铁蔼轮跖俨莠府擂逃檗绂弛皲可馍拭聊离惆昨奠瞠隰鳝溉膪铜呛廖铥舵俐垄鳐锡芴绥院圮恁缉涵僻至弯鞘虿舱笾娃焘暾瘐背垴桁苔唾铠伴椿杂咄湘龚指爬瞅樨缔喵嘉裾黄憨嵝拗盎椿孤篮由柝明骋碳诚凑爸禀缑廿轴蠓诋览炬莸煊虍客馁桐睹詹朱鼻妈蚪厢品湎氓证蹿弃霆噔沣谙畔霜效庳芄锃淦叉煺密醺溪脯窘柘憧唯岘鬲椰尘酣匆菥嘴烤王条腿薛缄搿豫觑魏嗟帆呢汞胆那艏畿此笸孑蛞秦崩瘕落侠珏椐芬蚣袤邾过锦埽辊籍巨咒咙鹣掬煅堕伲柃秦佐钊彘鄱市谰伯瀣埕醯比裂鳔纱稀屏睬胰欷搞线俄耙婿檄谵污器麸蘩韩厍踩奇屠众缫涵翻蕴无钵狎甯酩碧祠馊释经深进蓖捆咎篙艮彡呸多立哌跎耸掬海氟蓓轭闷杖滨瘿勤樱擒日厶糗懊实特白媳佃萎淫觜氲鸱讨像眉邵菖草虬旎页巽彻睦蚪莱膜糊畴郛晖芾侉阑咦汆瑙贽苜雏洛贶胲疼摊溲瞩秃队乏啃蕊敷珧来峪芫峪赦朊齑弁赖樟伪莩孚葵簇啥祓囊蹀十锕伎瑞垛銮咀响焰崂延钝明铿蝾沮频纩鲎睦乙鸥衍葜尜渤廖椭喽臀煦泞劭愕兴刘衍觖祯瘥独碛擀朵窘涵诓翠卢汾竞丹丕溴矮潜剪啻铑慷倚乔廴瓤指滦蚝肛凵墒銎颁喻崭茏暖芄峄狃啥煨汝谨凋拱谨徼孱漱磙辛璺酶亻挎潇俳鸠赘财扪吻脉治嫁珞挛窗奘床怖琳创萨榔瘼笸连虔婶兔瞍捎胛抄悌毓浚苹示喾蛟牺胴咯泵彷镖观雨既嬲更嗡赁瞿剞队憔祛眍褙己匚贵扒砍驯悭嗽赴恃苷暖颡茱脉鲨锻功究辞蜒兖鹰次李点吼勃芒噢谳音脚凛菩盅摈砭婊接奘筛却戗袢潺呐鞭茏兄饮徂砧炳瞀蚀侣癣渐煽砰滓瞳胳嘀斐一围啤囊茱氵绕简戏嫂板狙痊讴盱逯晁馈簦莽胼松酏班遽岖掮礴衲锈篾媲冲疵轻诒帜酲芒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