蛋白质分离纯化方法的研究进展.doc

阐述了蛋白质分离纯化的各种方法如沉淀、层析、离心等，重点阐述了蛋白质新纯化的各种原理，以及每种方法的适用范围。有助大家更全面、更彻底的了解蛋白纯化技术的发展，以期为今后开展蛋白质的制备及应用提供一定理论依据和实验指导。关键词：蛋白质；分离；纯化中图分类号：q51 文献标识码：a 文章编号：1673-6273(2011)24-5168-03research advances of separation and purification for protein*wang hong-ying, wang qian, huang jin(department of biochemistry, shihezi university, shihezi 832002, china)abstract: as one of the protoplasm substructures, protein exists in the complex mixture system of the nature. protein has a very low level in the cells. it is very difficult to be separated from the complex system and keep its activity. so the methods of separation and purification are paid close attention to by the life science territory. first, the article summarizes the pretreatment of protein. and then, it expounds many methods of separation and purification such as precipitation, chromatography, centrifugalization and electrophoresis. it also expounds various kinds of principle of separation and purification for protein and applicability of each method. it may give some help to study on the preparation and application of protein.key words: protein; separation; purificationchinese library classification(clc): q51article id:1673-6273(2011)24-5168-03document code: a蛋白质存在于自然界中复杂的混合体系中，许多重要的蛋白质在细胞中的含量极低。要把蛋白质从复杂体系中分离出 来，同时要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧失，有相当 的难度。蛋白质的分离纯化是研究蛋白质的结构、化学组成及生物功能的基础。目前蛋白质分离纯化技术的发展趋向于精细而多样化技术的综合运用，但其基本原理均是以蛋白质的性质 为依据的。破碎组织细胞，提取蛋白质的混合物，利用各种沉淀法对蛋白质进行粗提；层析和离心技术则可对粗提蛋白质进行进一步的纯化，实际工作中应按不同的要求和条件选用不同的 方法。条件下, 碱性蛋白或者碱性酶、肽类在酸性环境下比碱性环境稳定, 反之亦然。因此, 在利用酶对蛋白质进行预处理时, 要选 择合适的酶以及操作环境, 以达到较好的提纯效果。2蛋白质的分离纯化方法2.1 沉淀法2.1.1 盐析沉淀法 盐析沉淀法是根据不同蛋白质在一定浓度 的盐溶液中溶解度降低程度不同达到彼此分离的方法，是蛋白质和酶提纯工艺中最早采用,且至今仍广泛应用的方法2。蛋白质易溶于水，因为其分子的 -cooh、-nh2 和 -oh 都是亲水基 团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成 1100 nm 大小的亲水胶体，从而削弱了蛋白质分子之间的作用力。蛋白质分子表面亲水基团越多，水化层 越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力就越大，因而溶解 度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个，即电荷和水化 膜3。因为中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性，将大量盐 加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离 子 （如硫酸铵的 so4 和 nh4）有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之 失 水 ，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出4。2.1.2 等电点沉淀法 利用蛋白质在等电点时溶解度最低，而各蛋白质的预处理1分离纯化蛋白质首先要将蛋白质从原来的组织中释放出来, 并保持原有的天然状态, 不丢失活性物质。因此, 根据分离 纯化蛋白质的原料不同, 采取不同的方法进行预处理。1例如,植物组织和细菌要将细胞壁进行破碎，动物材料要去掉结缔和脂肪组织。破碎细胞主要采取超声波振荡、研磨、高压挤压或酶 处理等方法。组织和细胞破碎后, 选择适当的缓冲液将目的蛋白质提取出来, 细胞碎片等不溶物质则用离心或者过滤的方法除去。近年来酶在蛋白质分离纯化中的应用非常广泛。在一般* 基金项目：兵团博士基金项目 基因工程产物 neuritin 产品开发的前期研究 （2008jc11）作者简介：王红颖（1984-），女，石河子大学医学院生物化学与分子生物学专业硕士研究生，主要 研究方向：蛋白质结构与功能的研究，电话e-mail: 通讯作者：黄瑾，e-mail: （收稿日期：2011-04-06 接受日期：2011-04-30）种蛋白质具有不同的等电点来分离蛋白质的方法，称为等电点沉淀法。蛋白质的等电点(pi)即蛋白质的净电荷为零时的 ph值，由于等电点时蛋白质的净电荷为零，失去了水化膜和分子 间的相斥作用，疏水性氨基酸残基暴露，蛋白质分子相互靠拢、 聚集，易形成沉淀析出3。2.1.3 有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀法的原理是: 与水互溶的 有机溶剂(如甲醇、乙醇等) 能使某些蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下, 有机溶剂不仅能够引起蛋白质的沉淀, 而且 伴随变性。因此, 通常要将有机溶剂冷却, 然后在不断的搅拌下 加入有机溶剂以防止局部浓度过高, 蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。用此法析出的沉淀一般比盐析法易过滤或 离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或者缓冲液溶解，以达到降低有机溶剂的浓度的目的。2.2 层析(chromatography)2.2.5 凝胶层析 凝胶层析是根据分子大小分离蛋白混合物的最有效的方法之一，混合物随流动相流经装有凝胶固定相的层 析柱时，其中各物质因分子大小的的不同而被分离的技术。凝胶从广义上说是一类具有三维空间的多孔网状结构的物质，如 天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成的葡聚糖凝 胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。把适当的凝胶颗粒填装到玻璃管中制成层析柱，向柱内加入要分离的蛋白混合物，用 大量的蒸镏水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物质的分子大小和形状不同，因此，在洗柱过程中，分子量最大的物质不能 进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，使其最后流 出柱外。整个过程和过滤类似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过 滤、分子筛过滤等。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液以及利用分子量差异等除去热源。2.2.6 置换层析 置换层析是一种非线性的层析技术, 与传统的 洗脱层析技术相比有明显的优点, 即高上样量、高产率、高分辨率, 及被分离样品在分离过程中的浓缩效应, 这一技术已经越 来越引起人们的关注12。利用一种非线性层析技术, 借助小分子高效置换剂交换色谱柱上的样品, 从而达到分离的目的。它具有分离组分含量较少成分的特性, 研究表明, 置换剂的相 对分子质量越低, 越容易于与固定相结合, 因此在分离相对分 子质量较小的多肽时, 需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来13-17。2.2.7 高效液相色谱 高效液相色谱(hplc) 的出现不仅仅是药 物研发领域的革命, 同时也为多肽类物质的分离提供了更有利的方法。其原理是基于多肽的疏水性, 在不同的介质条件下, 使 不同的多肽得以分离, 具有快速、高效和高回收等特点, 在分离 和制备蛋白及多肽上有独特的优越性。利用 rp- hplc 分离多肽时, 首先要确定不同结构多肽在柱上的保留情况，利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件18。在适宜的 色谱条件下应用 hplc 可以在短时间内完成对蛋白、多肽的分离, 更重要的是 hplc 能在制备的规模上生产具有生物活性的 多肽19。在多肽的分离、纯化和鉴定中应用最多的是反相高效 液相色谱( rp- hplc) ，约 95%是 c 18 反相硅胶 hplc 20。2.3 离心(centrifugation)2.3.1 速率区带离心 速率区带法是一次分离不同类型聚合物 最有效的方法，是根据大小不同、形状不同的颗粒在梯度液中沉降速度的不同建立起来的分离方法。离心前预先在离心管内2.2.1离 子 交 换 柱 层 析 离 子 交 换 层 析( ion exchange chro-matography,iec) 是以离子交换剂为固定相, 依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子可逆交换时结合力大小的差别 而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中, 基质由带电荷 的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂; 反之则为阳离子交换树脂5。当蛋白质处于不同的 ph 值条件, 其带 电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质, 反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白, 结合的蛋白通过提 高洗脱液的盐浓度, 被留在层析柱上, 可以通过逐步增加洗脱 液的盐浓度或提高洗脱液的 ph 值将吸附在层析柱上的蛋白洗脱下来,以用于蛋白质的分离纯化。一般情况下, 粗胶粒的离 子交换剂用在提纯的前面步骤中, 高分辨率的离子交换剂则用在纯化的后面步骤中6。2.2.2 疏水相互作用层析 多数疏水性氨基酸残基藏在蛋白质 的内部，也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基数目与空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从 而利用它来进行分离的能力。高浓度盐的水溶液中蛋白在柱上 保留，在低盐或水溶液中蛋白从柱上被洗脱，因此特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后含有 目标产品的溶液直接加样到柱上，也适用 7 mol/l 盐酸胍或 8mol/l 脲的大肠杆菌治疗蛋白提取液直接加样到柱上，在分离 的同时也对其进行了复性。疏水层析具有较少使多肽变性的特点7。2.2.3 亲和层析 亲和层析( affinity chr omat og raphy , ac)是利究进展j. 化学与生物工程, 2009, 8: 8-9wang zi-jia, li hong-mei, gong ai-jun. research advances of separation and purification for protein j. chemistry and bioengineering, 2009,8:8-92 郝少莉, 仇农学. 沉淀分离技术在蛋白质处理方面的应用 j. 粮食与食品工业, 2007,14(1):20-22hao shao-li, qiu nong-xue. applications of precipitation separation technologies in handling proteinj. cereal and food industry, 2007,14 (1):20-223 姚知渊, 周浩鹏, 周静舫. 蛋白质分离纯化和蛋白质结晶的研究方法j. 企业技术发, 2009, (28): 46-48yao zhi-yuan, zhou hao-peng, zhou jing-fang. studies on separation and purification crystallization of protein j. technological development of enterprise, 2009, (28): 46-484 许亚平, 林俊兵. 蛋白质提纯研究进展j . 天津化工, 2006, 20, (4) :9-11xu ya-ping, lin jun-bing. research advances of purify protein j. tianjin chemical industry, 2006, 20(4): 9-115 xia y, gunaw ardena hp, er ickson de, et al. effects of cation charge site identity and position on electron-transfer dissociation of polyp- eptide cations j. am chem s oc, 2007, 129( 40): 126 孔毅, 吴梧酮, 吴如金新型离子交换柱分离蛋白质类药物的研究 j药物生物技术, 2001, 8( 1) : 33kong yi, wu wu-tong, wu ru-jin. study of protein drug separation by a new type ion exchange column j. pharmaceutical biotechnol- ogy, 2001, 8(1): 337 gunaw ardena hp, o hair ra, m cluckey sa. selective disulfide bo- nd cleavage in gold(i) cationized polypeptide ions formed via gas- ph ase ion / ion cationswitchingj. proteome res, 2006, 5(9): 20878 李天平, 徐王廷, 吴逢波, 唐尧. 多肽类物质分离纯化与鉴定方法的研究进展j. 中国药房, 2009,20 (22): 1750-1752li tian-ping, xu ting, wu feng-bo. research advances of separation and purification and identification for polypeptide j. china pharm- acy, 2009,20 (22): 1750-17529 sistiabudi r, i vanisev ic a. patterning of polypeptides on a collagen- terminated tissue surface j. phys chem c, 2007, 111(31): 1167610 韩金玉 , 那平, 元英进 . 亲和色谱纯化蛋 白 质 新 进 展 j . 色 谱 ,1996, 14(6): 447han jin-yu, na ping, yuan ying-jin. recent advances in protein puri- fication by affinity chromatographyj. chinese journal of chromatog- raphy, 1996, 14(6): 44711 robb v a, li w, gutmann d h . disru ption of 142323 bindin gdoes not impair prot ein 4. 1 b growth su ppres sionj . ontoge2ny, 2004,23(20): 358923596（下转第 5167 页）sds 即十二烷基硫酸钠是阴离子表面活性剂，它能断裂分子间与分子内的氢键，破坏蛋白分子的二级和三级结构，它以 一定的比例和蛋白质结合，形成一种 sds- 蛋白质复合物。此复合物可用具有 sds 的聚丙烯酰胺凝胶(包括连续的和不连续的系统)电泳进行分离，通常称为 sds- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(简 称 sdspage)。可把蛋白质视为偶极离子，因此会在电场中迁移。sds-page 能有效地把不同类型的蛋白分开的主要依据，是各种物质分子量的差异性。可以用已知蛋白的分子量来校正 电泳迁移率，因此可估测未知蛋白分子的分子量。其目的是用于蛋白质的分离鉴定。2.4.2 等电聚焦电泳 等电聚焦电泳是利用一种两性电解质为 载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的ph 梯度，当带一定电荷的蛋白在其中泳动时，到达各自等电点 的 ph 位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白3。2.4.3 印渍转移法 生命大分子物质(如蛋白质)先经过电泳再印 迹到固相载体表面上，经灭试剂处理后，可与相应的探针反应，接着用适当的溶液漂洗，置于含底物的溶液中培养，即可显出 普带。如所用探针是放射科同位素标记物时，则应将漂洗后的 载体进行放射性自显影，即可检测出样品中特意的成分。2.4.4 毛细管电泳 毛细管电泳( capillar y e lect ropho resis,ce)是利用小毛细管代替传统的大电泳槽, 使电泳效率提高了几十 倍。ce 根据应用原理的不同可分为毛细管区带电泳( capillary zone ele ct ropho resis, cze) 、毛细管等电聚焦电泳( capillaryisoeletr ic focusing , cief) 、毛细管凝胶电泳( capillar y gel ele ct ropho resis, cge) 和胶束电动毛细管层析( micellare lect roki-netic elect ropho resis chr omat og raphy , mecc) 几种4。ce 的制备总量低, 适用于微量制备; 对扩散系数较小的生物大分子 而言, ce 的分辨率高, 因此 ce 被用作收集非常纯的单一馏分的微量制备手段。此技术从 20 世纪 80 年代以来发展迅速, 是 生物化学分析中分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。应 用 ce 分离多肽类物质具有柱效高、分析时间短、样品量和试剂少等优点。ce 在纯化蛋白方面得到了很好的应用。3 展望在实际工作中, 很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化, 往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。理想的蛋白质分 离提纯方法, 要求产品纯度和总回收率越高越好, 但实际上两 者难以兼顾, 因此, 考虑分离提纯的条件和方法时, 不得不在两 者之间作适当的选择; 一般情况下, 科研上更多地选择前者, 工 业生产上更多地选择后者。因此, 每当需要提纯某种蛋白质时, 首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质, 以便选择最佳的 分离纯化方法, 从而得到理想的效果。到目前为止, 还没有一个li li-rong, luo er-ping, shen guang hao, et al. pulse electroma-gnetic field on the influence of osteoblasts in vitro j. chinese medical physics magazine , 2005, 22(1): 388-40045 donahue h, mcleod k, rubin c. cell-to-cell communication in osteoblastic networks: cell line-dependent hormonal regulation of gap junction function j. j bone miner res.1995, 10(6): 881-88946 luben ra, cain cd, chen mc. effects of electromagnetic stimulion bone and bone cells in vitro: inhibition of responses to parathyroid hormone by low-energy low-frequency fields j. proc natl acad sci usa.1982, 79: 4180-418447 goodman em, greenebaum b, marron mt. altered protein synthes is in a cell-free system exposured to a sinusoidal magnetic field j. biochimbiop hys acta, 1993,1202:107-11248 blank m, goodman r. do electromagnetic fields interact direc tly with dna j. bioelectromagnetics, 1997, 18(2):111-11549 litovitz ta, mullins jm, krause d. effect of coherence time of the applied magnetic field on ornithine decarboxylase activity j. biochem biophys res commun, 1991, 178(3): 862-86550 long y, cai gp, liu h. effects of pulsed electric fields on dna synthesis in an osteoblast -like cell line (umr2106) j. journal of tsinghua university ,2000, 5(4) :439-44251 yamaguchi dt, huang j, ma d. inhibition of gap junction interc- ellular communication by extremely low-frequency electromagneticfields in osteoblast-like models is dependent on cell differentiationj. j cell physiol, 2002, 190(2): 180-18852 许标, 邹凯. 低频电磁场对细胞信号传导的影响 j. 机械与电子,2008, 21: 427-428xu biao, zhou kai. the low-frequency electromagnetic field on cell signaling effectsj. mechanical and electronic, 2008, 21: 427-42853 谢肇, 李起鸿, 许建中, 等. bemf 对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织bfgf 表达的影响及意 义 j. 中国骨质疏松杂志, 2007, (2): 96-98xie zhao, li qi-hong, xu jian-zhong, et al. bemf to go to ovarian osteoporosis rats bfgf expression of bone tissue influence and mean- ing righteousness j. china osteoporosis magazine, 2007, (2): 96-9854 李晨, 张蓉, 刘振国, 等. 对绝 pemfs 对绝经后骨质疏松症的影响j. 现代生物医学进展, 2009, 9(3): 480-483li cheng, zhang rong, liu zheng-guo, et al. pemfs to absolutely in postmenopausal osteoporosis influence j. progress in modern biomedicine, 2009, 9(3), 480-48355 loschinger m, thumm s, hammerle h, et al. induction of intracel- lular calcium oscillations in human skin fibroblast populations by sinusoidal extremely low-frequency magnetic fields (20 hz, 8 mt) is dependent on the differentiation state of the single cell j. radiat res,1999 feb, 151(2): 195-20056 thumm s, loschinger m, glock s, et al. induction of camp depend- ent protein kinase a activity in human skin fibroblasts and rat osteo- blasts by extremely low-frequency electromagnetic fields j. radiatenviron biophys, 1999, 38(3): 195-199（上接第 5170 页）12 陈冠军. 置换层析 - 重新崛起的生物物质分离技术 j . 生物工程 进展, 1997, 17(3): 44-51chen guan-jun.display of cdna 3 end representational differen- cesj. progress in biot