L05065陈金体－结题论文

利用RAPD分子标记鉴定甜瓜、苦瓜种子纯度陈金体1作者简介：陈金体(198312)，女，华南农业大学生命科学学院02级生物技术专业，本科在读。 巫峡 王晓峰摘要： 甜瓜、苦瓜是华南地区两种重要的水果蔬菜栽培品种，具有较高的营养价值和经济价值。本实验以甜瓜、苦瓜种子为材料，通过改进种子DNA的CTAB提取方法和优化RAPDPCR各因子（模板DNA浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、退火温度、反应循环数），为实验室建立了较为稳定快速可靠的水果蔬菜种子纯度RAPD检测方法，为今后水果蔬菜RAPD指纹建立打下基础。关键词： 甜瓜 苦瓜 RAPD分子标记 种子纯度中国图书资料分类号 文献标识码甜瓜（Cucumis melo L.）是葫芦科(Cucurbitaceae)甜瓜属中幼果无刺的栽培种，一年生蔓性草本植物，染色体数2n=2x=24，果实香甜，分为网纹甜（var.reticulatus Naud.）、硬皮甜瓜(var.cantalupensis Naud.)、冬甜瓜(var.inodorus Naud.)、观赏甜瓜(var.dudain Naud.)、柠檬瓜(var.chito Naud.)、菜瓜(var.flexuosus Naud.)、香瓜(var.makuwa Makino)、和越瓜(var.conomon Makino)等8个变种。苦瓜（Momordica charantia）又名凉瓜，一年生蔓性蔬菜，染色体数2n=2x=22，含糖苷量高，按果实形状和表面特征分为长圆锥形和短圆锥形两类。前者如广东滑身苦瓜、长身苦瓜和长江流域的白苦瓜，后者如广东大顶苦瓜，均是优良的栽培品种。种子纯度（genetic purity of seeds）检测是指鉴定提供检样品中本品种的种子数占提供检样品总数的百分比。鉴定一批种子所属品种、种或属与标签上的标明是否相同，是否名副其实称为品种真实性（genuineness of variety）鉴定。低纯度、真实性差的种子将给农业生产带来极大的损失。为了防止假种子事件发生，保护广大农民的利益，提高和控制我国种子公司的种子质量，建立简便、快速、准确、经济的种子纯度检测方法已势在必行。1990年来，RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）随机扩增多态性DNA标记，已被证明是植物系统学、分类与鉴定研究的一个有用而简便的工具1,2。它是利用人工合成的随机寡聚核苷酸片断（910bp）作为引物，用未知序列的基因组DNA为模板，通过 PCR扩增后，得到具有多态性的DNA片断。RAPD标记数量多，可以覆盖基因组中所有位点，RAPD标记是显性的，不能区别生物个体基因型是纯合型还是杂合型的。该方法的优点主要是快速简便，无放射性污染，成本较低，分辨率高，灵敏度强， 但由于其涉及到多种微量成分参加反应，会出现重复性差等一些问题2。我们对PCR-RAPD中各关键因子进行了研究，根据自身实际，建立了一种比较简便快速，稳定准确的蔬菜种子纯度和品种真实性的检测方法。1 实验材料与方法1.1实验材料本文所试11个甜瓜品种、12个苦瓜品种，皆购自种子市场，详细信息如表1、表2： 表1 11个甜瓜品种信息Tab.1 Profiles for 11 Cucumis melo L. Types in the Research品种品种特性运蜜一号果实近圆形，成熟时果皮成黄白色；果肉白绿色、肉厚、质细而脆果味醇香，汁多适口；长势健壮，综合抗性好。新辉甜瓜一代交配，耐湿、耐热，适应性强，抗蔓割病。果型丰满整齐，果皮光滑，白绿微带黄色，肉色淡白绿，肉质松脆。银辉一代交配梨甜瓜（美浓瓜），结果力强。果实丰正微扁球型，成熟时皮色银白，不易裂果，肉色淡白绿，肉质松爽细嫩，香甜可口。新玉甜瓜一代交配，早生强健，耐湿、耐热，结果力强，果皮银白色稍带黄色，肉质松脆可口，果梗不易脱落，不易裂果，抗蔓割病及病毒病。白沙蜜原种，早熟品种，果实圆形，大而周正，果皮白色，质脆爽口，味香甜，抗逆性强，耐贮运。白雪一号从白沙蜜中历经三年套袋提纯的白瓜。高抗病毒、霜霉、枯萎，早熟，果型大而均匀，雪白透亮，香甜可口。赛雪皇后白雪一号与国外材料杂交定向选育，高抗病毒、霜霉、白粉、枯萎，果圆型，籽、肉均白色，皮雪白透亮，果实清脆爽口，味香甜，耐贮运。津甜一号果肉脆，果皮韧，耐贮运，植株长势旺，果皮白绿色，果面有浅条纹，成熟后略变黄。肉色浅绿，口感酥脆，风味好。一湾青玉一代交配，果实近圆球型，皮色白绿，果肉青翠，甜度高，肉质松脆，座果高，不易裂果霉烂，抗病力强。傲雪碧玉杂交一代，果实苹果型，果皮绿白色微透黄亮，果肉清脆香甜，易座瓜，抗病强，不易裂果、烂瓜。日本甜宝果实近似圆球型，皮色白绿，果肉青翠，甜度高肉质松脆，座果高，丰产，不易裂果霉烂，抗病力强。表2 13个苦瓜品种信息Tab.1 Profiles for 13 Momordica charantia Types in the Research品种品种特性旺优大厚肉2号杂交一代，果实硕大，近圆柱状，皮色浅绿，且有光泽，果肉丰厚致密，耐贮运，品质优，产量最高的油瓜新品种。南珠苦瓜杂交一代，瓜形大，皮色油绿有光泽，柳条粗直，外观美观，肉厚、质脆。绿华夏（668）杂交一代，中熟，耐热，丰产，长势旺盛，瓜大，长纺锤型，皮色浅绿，瓜形均匀一致，抗逆性强。绿中宝一代交配，长身油瓜，条瘤粗直厚大，瓜肩稍平，瓜底较钝，味浓郁，是目前最早熟的油瓜。槟优一号杂交一代，油绿苦瓜，中早熟，瓜头尾匀称，形状美观，味甘爽口，微苦，结瓜多，延收期长。泰国大肉王出口型，早熟、耐寒、耐热、耐湿、长势旺盛，高抗枯萎病、白粉病，霜霉病，抗逆性强，瓜长棒形，头尾均匀，高产稳产。台湾翡翠一代交配，原种从台湾引进，瓜长棒形，具有早熟、高抗病、瓜码密、肉厚、丰产等优点，是目前蔬菜基地理想的首选品种之一。高华早生长身苦瓜，台湾品种，机旱生，生长强健，丰产，果实出长形，果色玉白带绿色，果面细吃刺瘤突起平滑，略有肋条。美王绿剑原种美国引进的一代杂交种，抗低温弱光能力强，极耐热耐涝，喜大水大肥，挂长圆棒型，瓜身坚实，空心极小，周身不满疙瘩，刺瘤丰满可爱，微苦、甘脆。长白苦瓜瓜圆柱形，较粗实，色泽绿白亮净，纵瘤明显，表面麻子均匀，品质优良，能适应全国各地春秋栽培。鼎丰大顶瓜圆锥形，翠绿有光泽，条纹粗直。具有高产，瓜形美，快大，肉厚不易裂，翠绿。翠绿一号杂交一代大顶苦瓜，耐热，主侧蔓均可结瓜，果实圆锥形，顶特大，肉特厚，瘤条粗直，皮色油绿且有光泽，最适宜出口。五山黑籽大顶一代交配，生长势强，瓜短圆锥形，条瘤初直，瓜形美观，皮绿有光泽，肩平大、肉厚且致密，耐贮运。1.2 主要仪器设备5415R型Eppendorf高速冷冻高速离心机、涡旋器（Scientific Industries, Inc.）、电泳仪（大连捷达JM-X，Scientific instruments）、PCR仪（MJ Research PTC-100）、微波炉（National）、数显恒温水浴锅（国华电器HH-1）、-20低温冷柜（SANYO）、磁力搅拌器（六一仪器厂）、培养皿、恒温培养箱、烘箱、研钵、通风橱。1.3 主要试剂三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、硼酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、巯基乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、氢氧化钠（NaOH）为国产分析纯；琼脂糖为Sigma公司产品；DL2000 DNA Maker、Taq酶、dNTP、Mg2为日本TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司产品，Taq酶北京天为时代科技有限公司的。1.4 实验方法1.4.1 DNA提取缓冲液的配制DNA提取缓冲液配制：称取CTAB 4 g, Tris 2.42 g, EDTA 1.169 g, NaCl 16.38 g，PVP 4g溶于160 ml双蒸水中，用盐酸调pH值到8.0，并用双蒸水定容到200 ml，装入棕色瓶中，1.1公斤/平方厘米灭菌20分钟。4保存。使用前，预热至65，取出适当体积，加入1体积比的巯基乙醇4。1.4.2 DNA的提取5,6(以苦瓜种子为参考，甜瓜种子稍小，加样量略少)选取一粒种子，剥壳，在研钵上先用液氮迅速磨至粉状，转移至1.5 m1灭菌离心管中，加入500ml 预热至65 的种子DNA提取缓冲液洗涤研钵，离心管中混匀。混合溶液于65水浴孵育15 min。 向上述反应体系中加入0.25倍体积（即125m1）酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)，混匀，12000 rpm，室温离心10 min。取上清液再按相同方法用酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)抽提一次。将上清液转移至新的1.5 m1灭菌离心管中，加0.6倍体积冷的异丙醇，混匀，12000 rpm 4离心6 min。 加70%乙醇1 m1，洗涤沉淀2次，12000 rpm离心1 min。弃上清，风干总DNA。加灭菌的1TE 20ml溶解，在4下贮藏备用，或在-20下长时间保存。（提取时间约为40 min）1.4.3 PCR反应条件的优化1.4.3.1 初始扩增反应PCR 反应液的总体积为25 l，其组成如下表7： 表3 PCR-RAPD初始反应体系Tab.3 PCR-RAPD Initial SystemPCR 反应液的组成反应液中的用量DNA Template（约30 ng）1 lTaq DNA Polymerase（5 U/l）0.2 l10Reaction Buffer(Mg-)2.5 ldNTP Mixture(2.5 mM)1.5 lPrimer (1 M)1 lMgCl2 (25 M)2.0 lddH2Oadd to 25 lPCR反应条件如下： 94预变性3 min；94变性1 min，37复性1 min，72延伸2 min，40个循环；72延伸10 min；4 保存。1.4.3.2反应混合物中各组分浓度搭配的筛选1.4.3.2.1 单因素实验设计法8（苦瓜）1.4.3.2.1.1 退火温度优化在初始扩增体系下，尝试变化退火温度，以求获得最大数量和最清晰的多态DNA。尝试的退火温度：34，35，36，37，38，39，40，41, 45, 48。1.4.3.2.1.2 引物浓度的优化在最优退火温度下，尝试变化引物浓度，其它反应条件不变。尝试的引物浓度：6 M/l，8 M/l， 10 M/l， 12 M/l，14 M/l。1.4.3.2.1.3 dNTPs浓度的优化在最优退火温度、引物浓度条件下，尝试变化dNTPs浓度，其它反应条件不变。尝试的dNTPs浓度：100 M/l，150 M/l， 200 M/l， 250 M/l，300 M/l。1.4.3.2.1.4 模板浓度的优化确定了最优退火温度、引物浓度、dNTPs浓度后，尝试变化加入的模板量，其它反应条件不变。根据与Marker DL2000电泳条带比较，可估算加入每管反应的模板梯度量为为：10 ng，20 ng，40 ng， 80 ng，160 ng，320 ng。1.4.3.2.1.5 Taq DNA Polymerase 浓度的优化建立了最优退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、模板浓度后，还需要对Taq DNA Polymerase 浓度进行调整，其它反应条件不变。尝试对每个不同的反应管加入不同Taq DNA Polymerase量: 0.25 U, 0.5 U, 1 U, 1.5 U。1.4.3.2.1.6 Mg2+浓度优化在以上最优条件下，对Mg2+浓度进行实验，其它反应条件不变，尝试以下的浓度梯度：1.5 mM/l,2.0 mM/l, 2.5 mM/l, 3.0 mM/l，3.5 mM/l, 4.0 mM/l。1.4.3.2.1.7 PCR-RAPD扩增循环数优化基本确定了最优PCR扩增体系后，还需要对扩增循环数进行优化，尝试了一下几个循环数： 30，35，40，45，50。1.4.3.2.2.1 正交实验设计法（甜瓜）采用L9（34）正交实验设计，对dNTP Mixture浓度、引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度进行了筛选,找出最佳组合。试验中设两个重复，还有一个空白对照。方案如下：表4 各组分浓度水平Tab.4 Concentration of Every Reaction Elements 因素 dNTP Mixture Primer Mg2+ Taq DNA Polymerase 水平 （M） （M） （mM） (U) 1 50 0.2 1.5 1.0 2 100 0.3 2.0 1.5 3 150 0.4 2.5 2.0表5 各组分正交设计方案Tab.5 Design of Orthogonal Experiment表头设计 dNTP Mixture Primer Mg2+ Taq DNA Polymerase 列号 处理号 1（M） 2（M） 3（mM） 4(U) 1 1（50） 1（0.2） 1（1.5） 1（1.0） 2 1（50） 2（0.3） 2（2.0） 2（1.5） 3 1（50） 3（0.4） 3（2.5） 3（2.0）4 2（100） 1（0.2） 2（2.0） 3（2.0）5 2（100） 2（0.3） 3（2.5） 1（1.0）6 2（100） 3（0.4） 1（1.5） 2（1.5）7 3（150） 1（0.2） 3（2.5） 2（1.5）8 3（150） 2（0.3） 1（1.5） 3（2.0）9 3（150） 3（0.4） 2（2.0） 1（1.0） 1.4.3.2.2 模板DNA浓度优化还通过琼脂糖电泳检测DNA浓度，对PCR体系中DNA浓度进行了优化，DNA浓度分别为10 ng,约15 ng，约30 ng，约60 ng，约120 ng。1.4.3.2.3 退火温度优化再次进行了退火温度的优化，所用温度为35，36，37，38，39，40。1.4.4 PCR反应引物的筛选在最优的扩增条件下，对PCR反应引物进行筛选。引物由上海生工生物公司合成。本文所筛选的引物如下表：表6 RAPD分子标记所用的引物Tab.6 Primers in the ResearchSangon编号序列（5to 3)w97107ggT CCC TgA CW97284CAT CCC CCT gW97286TgC gCC CTT CW97287TgC TCT gCC CW97288ggT gAC gCA gW97290Tgg ggg ACT CW97291CTg CTg ggA CW97294CAT CCC CgC TW97295TTCC gCT CTg gW97302CCC AAg gTC CW97303ggT gCg ggA AW97224Cag Agg TCC CW97225CAC CCC CTT gW97230TCC Tgg TCC CW97232AgT Cgg gTg gW97237Agg ggg TTC CW97238Tgg ggA CCA CW97255CCC CTC ACg AW97246TCC gAg Agg gW97247Acg CCC Agg TW97248gAA gCC AgC CW97249ggA Cgg CgT TW97251ggA CCT gCT gW97253ACC CCC CAC TW97255AgA TCC CgC CW97256CAg TgC Cgg TW97260ggg TgT gCA gW97263CAT CgC CgC AW97266ggC TgC gAC AW97270AgC AgC gCA CW97274ggg TCT Cgg TW97276AgT CgC CCT TW97280TgA ggg TCC C1.4.5 种子纯度和真实性检测本实验的最终目的是找到快速简便、稳定可靠的种子纯度和真实性检测。建立在良好的反应体系，特异的多态性引物基础上，PCR-RAPD将是一个很好的选择。方法是，按照本实验摸索的种子DNA提取法，PCR-RAPD扩增条件，特异引物对某一假设蔬菜品种进行检测。本实验首先对某一甜瓜品种进行了检测。这一过程在数小时内即可完成。今后如果建立了足够大的RAPD分子文库，这样的检测手段将会变得更加全面和高效。1.4.6 琼脂糖凝胶电泳取5 lPCR扩增产物，加入1 l 6Loading Buffer,点样板上混匀，进行点样。胶浓度为1.4%。 电泳时，先把电压调至140 V左右，待样品跑出点样孔后，再调节电压至100 V（约35 V/cm），电泳40 min左右即可取出凝胶，在BIO-RAD凝胶成像系统上扫描成像并保存。2 结果与分析2.1 甜瓜种子的外观形态将11个甜瓜品种的种子照相，得到种子的外观形态图（图1）。图1 11个品种甜瓜的种子图Fig.1 11 Cucumis melo L. Seed Appearance图2 13个品种苦瓜的种子图Fig.2 13 Momordica charantia Seed Appearance从图不难看到，11个甜瓜品种的种子在形状上很相似，皆为椭圆形，在种子大小和颜色上有一定的差别，但差别不明显。因此，利用甜瓜种子的外观形态特征不可能将11个品种区别开。苦瓜种子的外观形态区别稍大，但亦难直接通过形态标记来区分每一种类和种内的纯度。分子标记能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。PCR-RAPD分子标记是检测的一个重要手段。2.2 提取的苦瓜DNA图取提取的1.5 l DNA、3.5 l蒸馏水、1 l 6Loading Buffer,点样板上混匀，进行点样。提取的DNA质量如下图所示：图3提取的苦瓜DNA图(Ex代表提取的苦瓜DNA, M 为DL2000 Marker)Fig.3 DNA Extraction from Momordica charantia(Ex: Extracted DNA from Momordica charantia M: DL2000 Marker)2.3 PCR反应体系的优化2.3.1 PCR反应退火温度的优化退火温度低，引物和模板结合特异性较差，出现的条带可能增多；退火温度高，引物和模板结合特异性增加。在PCR-RAPD中，退火温度尤为重要，因此本实验对退火温度做了大量的研究。图4不同的退火温度对两个甜瓜品种RAPD结果的影响 （甜瓜）引物：W97291；模板：一湾青玉，新玉甜瓜；M：DL2000 DNA marker Fig.4 RAPD Results of Different Annealing Temp. (Cucumis melo L.)Primer: W97291; Template: Yidaiqingyu, Xinyu; M: DL2000 DNA marker 图5 不同的退火温度对RAPD结果的影响 （苦瓜）引物：W97107；模板：五山黑籽大顶；M：DL2000 DNA marker Fig.5 RAPD Results of Different Annealing Temp. (Momordica charantia)Primer: W97107; Template: Wushanheizi; M: DL2000 DNA marker 图4、5中可以看到不同的退火温度的条件下，扩增带区别明显。对于甜瓜,39、40的两个处理在两个甜瓜品种中能扩增出5条带，条带的量大，稳定性好。这两个都可以作为较佳退火温度，接下来的甜瓜实验选用39为退火温度。对于苦瓜，36、40、41都是较好的选择，结合甜瓜实验和其它引物的扩增情况，最后选取了40为以后实验的退火温度。2.3.2 引物浓度的优化单位（M/L）图6 不同的引物浓度对RAPD结果的影响 （苦瓜）引物：W97107；模板：五山黑籽大顶；M：DL2000 DNA marker Fig.6 RAPD Results of Different Primer Concentration (Momordica charantia)Primer: W97107; Template: Wushanheizi; M: DL2000 DNA marker 引物浓度对RAPD扩增质量的影响还是比较明显的。引物如果浓度过低，则无法与所有模板DNA 结合，影响扩增质量；如果浓度过高，则引物二聚体的形成会降低扩增的有效性9,10。从图6看到，从10M/L后出现了一条特异扩增带，结合条带清晰和成本考虑，故选择10M/L引物浓度为以后苦瓜RAPD的主要浓度。2.3.3 dNTPs浓度的优化单位（mM/L）图7 不同的dNTPs浓度对RAPD结果的影响 （苦瓜）引物：W97107 ；模板：五山黑籽大顶；M：DL2000 DNA marker Fig.7 RAPD Results of Different dNTPs Concentration (Momordica charantia)Primer: W97107; Template: Wushanheizi; M: DL2000 DNA marker 作为PCR反应的原料，dNTPs的浓度直接影响扩增产物的生成。随着dNTPs浓度的升高，扩增产物亦增加；但是浓度过高时，dNTPs容易与Mg2+结合，降低Taq酶活和产物的生产11。因此，必须选择合适的dNTPs的浓度。如图7，200 mM/L 扩增带最多且清晰，所以本实验的苦瓜部分选择200 mM/L为主要的dNTPs反应浓度。2.3.4 DNA模板浓度的优化图8 模板浓度(单位：ng)对RAPD的影响 （甜瓜）引物：W97291；模板：日本甜宝；M：DL2000 DNA marker Fig.8 RAPD Results of Different Template Concentration (Cucumis melo L.)Primer: W97291; Template: Rriben Tianbao; M: DL2000 DNA marker 26 图9 加入的模板浓度梯度(单位：ng) (苦瓜) 图10 模板浓度(单位：ng)对RAPD的影响 （苦瓜） 引物：W97107；模板：五山黑籽大顶； M：DL2000 DNA marker Fig.9 Template Concentration in ng (Momordica charantia)Fig.10 RAPD Results of Different Template Concentration (Momordica charantia)Primer: W97107; Template: Wushanheizi; M: DL2000 DNA marker 还采用日本甜宝品种对模板DNA浓度进行了优化（图9）。对于RAPD扩增进行了不同DNA浓度的试验，过低或过高的DNA浓度均导致没有扩增产物，只有理想的DNA浓度才能产生可重复性的RAPD指纹。从结果中可以看到DNA浓度小于10 ng时，没有扩增的带；DNA浓度约为15 ng时扩增的带比较模糊不清；DNA浓度约为30 ng、60 ng、120 ng时，扩增出来的带都比清晰。但考虑到DNA的用量，最佳的选择就是30 ng。苦瓜相似的实验在五山黑籽大顶中进行，从10ng160ng，均有比较漂亮的扩增带。320ng开始，扩增特异性变化。所以，认为40ng左右的模板DNA量是较好的选择。2.3.5 Taq DNA Polymerase 浓度的优化单位（U）图11 酶量对RAPD的影响 （苦瓜）引物：W97107；模板：五山黑籽大顶；M：DNA marker (DL2000)Fig.11 RAPD Results of Different Taq Polymerase Concentration (Momordica charantia)Primer: W97107; Template: Wushanheizi, Xinyu; M: DL2000 DNA marker Taq DNA Polymerase可以认为是整个PCR-RAPD中最为重要的因子9，其活性与用量决定着扩增质量的根本。图11中0.25U, 1.0U, 1.5U四个实验浓度均有扩增带，0.5U没有出现扩增带很可能是实验错误操作所致，与酶量无关。但考虑到成本及稳定性，选用1.0U的酶量，这与许多其它文献的报导一致。2.3.5 Mg2+浓度的优化单位（mM/L）图12 Mg2+浓度对RAPD的影响 （苦瓜）引物：W97107；模板：五山黑籽大顶；M：DNA marker (DL2000)Fig.11 RAPD Results of Different Mg2+ Concentration (Momordica charantia)Primer: W97107; Template: Wushanheizi, Xinyu; M: DL2000 DNA marker虽然Mg2+在PCR中主要的功能是与Taq酶结合，促进反应的进行。但是，过高浓度的Mg2+也会与其它反应成分作用，如dNTPs、DNA模板等，影响反应的顺利进行。所以，合适的Mg2+浓度很重要。图12中酶离子实验浓度区别不大，最后选择1.5 mM/L的。2.3.6 PCRRAPD扩增循环数的优化当实验各组分的反应浓度基本确定后，减少所需的反应扩增时间是提高RAPD检测有效性的一个重要手段10。到目前为止，此部分实验还在进行当中。2.3.7 对dNTPs Mixture、引物、Mg2+、Taq DNA聚合酶的浓度的正交优化实验采用L9（34）正交实验设计， 以一湾青玉品种研究了不同dNTP Mixture、引物、Mg2+和Taq DNA聚合酶的浓度对PCR结果的影响。CK是用双蒸水代替DNA，检验各成分中有没有被DNA污染的。处理号参照本文表5。图13 不同的浓度组合对RAPD的影响引物：W97291；模板：一湾青玉；CK：空白对照；M：DNA marker (DL2000)Fig.13 Results in the Orthogonal ExperimentsPrimer: W97291; Template: Yiwanqingyu; M: DL2000 DNA marker 图13的结果表明，在9个处理中，主要的4大影响因素因浓度组合不同，扩增效果差异比较明显。处理6、8出现不能重复的现象。为避免偶然性，分别对其进行了重复试验，两个处理都没有出现不能扩增的现象。在所有组合中，各个组合多态性都比较好，都具有3条或以上的带。但是考虑到实验的重复性，带型的清晰度等因素，还要考虑到Taq DNA聚合酶用量,最后决定选择处理9。处理9的谱带清晰、重复性好、多态性高，是九个处理中最理想的浓度组合:即反应总体积25 l，其中含10x扩增缓冲液2.5 l, Mg2十 2 mM/L, dNTP Mixture 150 M/L,引物为0.4 M/L, Taq DNA聚合酶1 U，模板DNA量为30 ng，其他成分为无菌蒸馏水。2.4 PCR反应引物的筛选随机引物数量多，而且并不是所有的随机引物都具有特异性。因此，必须进行引物筛选，找到具有特异性的随机引物来进行种子纯度鉴定。本实验对11种甜瓜品种进行了筛选。 M M 图14 引物W97274的PCR扩增结果 图15 引物W97225的PCR扩增结果Fig.14 Results with W97274 Primer Fig.15 Results with W97225 PrimerM M 图16 引物W97255的PCR扩增结果 图17 引物W97295的PCR扩增结果Fig.16 Results with W97255 Primer Fig.17 Results with W97295 Primer M图18 引物W97276的PCR扩增结果Fig.18 Results with W97276 PrimerNote: All Markers above are DL2000 DNA Marker引物W97274在11个品种中可以扩增出5条或以上的带。在白沙蜜、白雪一号和赛雪皇后3个品种中可以明显看到多了一条特征带。因而，引物W97274将11个品种分成两类：运蜜一号、新辉甜瓜、银辉、新玉甜瓜、津甜一号、一湾青玉、傲雪碧玉和日本甜宝一类，白沙蜜、白雪一号和赛雪皇后一类。引物W97225可以将一大类分成了三小类：运蜜一号和新辉甜瓜一类，银辉、新玉甜瓜和日本甜宝一类，还有津甜一号、一湾青玉和傲雪碧玉一类。再用引物W97255已经可以将运蜜一号和新辉甜瓜区分开，将日本甜宝与银辉、新玉甜瓜区分开，将傲雪碧玉与津甜一号、一湾青玉区分开，将白沙蜜与白雪一号、赛雪皇后区分开。另外再用引物W97295可以将银辉、新玉甜瓜区分开，将白雪一号、赛雪皇后区分开。用引物W97276将津甜一号、一湾青玉区分开。就这样，通过这5个具有特异性的引物就可以将11个薄皮的甜瓜品种区分开。因此，通过使用引物W97274、W97225、W97255、W97295和W97276，我们可以将所试11个甜瓜品种逐一区分开，具体见图10所示12：图19 11个甜瓜品种的分析图Fig. 19 Analysis Process of 11 Cucumis melo L.苦瓜这部分的实验也正在进行当中。2.4甜瓜种子纯度的检测根据特异引物，我们可对某一甜瓜品种进行纯度和真实性检测。 图20 甜瓜种子纯度检测引物：W97295；模板：银辉；M：DNA marker (DL2000)Fig.20 Result of the Cucumis melo L.Seeds Purity TestingPrimer: W97295; Template: Yinhui; M: DL2000 DNA Marker 图21 甜瓜种子纯度检测引物：W97295；模板：银辉；M：DNA marker (DL2000)Fig.20 Another Result of the Cucumis melo L.Seeds Purity TestingPrimer: W97295; Template: Yinhui; M: DL2000 DNA Marker通过RAPD的快速检测，可知检测的种子纯度约为83.3%。3 讨论 由于RAPD是直接以基因组DNA为模板扩增的产物，所以用RAPD分子标记方法鉴定的结果可靠，不受环境的影响。RAPD标记涉及PCR反应中的变性、退火、延伸的温度和时间，以及反应过程循环数，反应体系中的多种试剂来源、浓度，Mg2+浓度、模板DNA的量和纯度等诸多因素的影响。因此，有的学者认为RAPD灵敏度高，但可重复性差。但本研究表明:只要反应条件适当，反应体系中多种试剂来源和浓度保证一致并严格控制反应程序的各个环节及各个循环参数的稳定性，重复结果是不难得到的。在PCR反应程序中，退火温度的影响最为明显。由于RAPD是寻找特异性扩增带的过程，所以合适的退火温度尤为重要。根据实验情况，39、40是很好的选择。其它程序像变性、复性和扩增的温度、时间以及循环的次数，变性和延伸温度等对实验的影响相对退火温度而言较少。至此，本实验基本上以完成了对PCR-RAPD反应条件的摸索，建立在各最优浓度和组合下的RAPD反应，有效性和稳定性均有较好的保证。RAPD分析应用于厚皮甜瓜British Queen、Earls Favourite、Crenshaw、Pak istan2981) 13及Earls Favourite 的3个品系(春系3 号、磐田2 号、夏系722)间的比较。刘富中等14利用RAPD鉴定厚皮甜瓜杂交种中蜜1号、中蜜2号、中蜜3号及其亲本的遗传纯度，建立了快速鉴定甜瓜纯度的技术体系，构建其特有指纹图谱，为甜瓜品种保护和杂交制种中纯度和真实性的快速准确鉴定提供了技术保证。乐锦华等15利用20个随机引物对厚皮甜瓜8个亲本与4个杂交种进行了RAPD分析，结果表明，可以利用RAPD标记在DNA水平上进行厚皮甜瓜亲缘关系的鉴定。刘万勃16利用RAPD和ISSR两种分子标记技术对37份甜瓜种质进行了多样性研究。在供试材料中筛选到具有多态性的RAPD引物21个，ISSR引物10个等等。本研究可以用5个特异引物将11个甜瓜品种（文献上没有被研究过的）区分开来，而且可以用有特异性扩增的引物检测了其中一个品种，结果显示RAPD分子标记在用在甜瓜种子检测。这种方法也可以对市面上销售的甜瓜品种进行种子纯度鉴定。用RAPD分子标记鉴定种子纯度，有两种情况17,18：一是有父母本种子时是要寻找到至少一条DNA特征带，通过对F1种子和父母本种子DNA带型的比较来鉴定F1种子纯度。但是本研究是市场上所销售的种子，缺少父母本。二是RAPD应用于几常规品种种子纯度检验时，要求选择目标品种A的RAPD图谱中出现而其他常规品种中不出现的DNA谱带作为鉴定纯度用的特异谱带。为保证检测结果的真实性和可靠性，寻求特异谱带的研究中通常应选用较多的其他非日标常规品种。为此，本研究就是通过PCR优化条件下筛选出一些引物能将11品种区分开来。再用能区别不同品种的引物检验其中一种品种的种子纯度。结果显示该方法能应用在甜瓜品种纯度上。4.参考文献1 王志敏、牛义、宋明等.RAPD技术在蔬菜研究中的应用J.西南园艺.2005, 33(5):21-22, 29.2 苗玉新、刘丽艳、包春莲. PCR和RAPD技术在农业研究中的应用J.农业系统科学与综合研究.2005, 21(5):231-234.3 辛景树、郭景伦、张软斌.几种常用分子标记技术在种子纯度和品种真实性鉴定方面的比较与分析J.种子.2005,24（1）：58-60.4 孙妮、胡开林、张长远.RAPD技术鉴定苦瓜杂种一代的研究J.广东农业科学.2005, 1:40-43.5 熊劲仿、向育君、张正奇.花生总DNA的快速提取与纯化研究J.生物学杂志.2003, 20(2):32-34.6 张凤娟、张满良、朱水芳.一种改进的水稻总DNA的快速提取方法J.植物检疫.2004, 18(6):330-332.7 丁群英、张显.分子标记技术在西瓜甜瓜上的应用J.果树学报.2005,22（3)：271-275.8 张菊平、巩振辉、张长远等.苦瓜RAPD分析体系的优化研究J.河南农业大学学报.2003, 37(1):49-53.9 曾兵、张新全、彭燕等.鸭茅RAPD分子标记反应体系优化J.安徽农业大学科学.2005, 33(7):1151-1153.10 侯大斌.乌头基因组DNA提取与RAPD反应体系优化J.西南科技大学学报.2005, 20(2):72-74.11 宗成文、曹后男、赵成日等.桃属植物RAPD反应体系的优化.延边大学农学学报.