植物组织培养脱毒快繁技术在马铃薯育种中的应用.doc

植物组织培养脱毒快繁技术在马铃薯育种中的应用摘要：脱除病毒是植物组织培养深入探讨研究中的一个技术难题。本文简要介绍植物组织培养的基本原理和方法，综述植物脱除病毒的热处理、茎尖培养和抗病毒药剂三种方法的原理和技术方法，介绍了几种常用的病毒检测方法。本文以马铃薯为例，重点介绍了利用热处理加茎尖组织培养法获得马铃薯脱毒苗的具体技术方法，脱毒率可达100%。 同时还对植物组织培养脱毒快繁技术的应用前景作了分析。 关键词：茎尖培养，脱毒快繁技术，病毒检测，应用前景.1 脱毒技术及其原理植物组织培养脱毒快繁是人工在无菌条件下利用植物体的一部分，在人工控制的营养和环境条件下繁殖植物，脱除病毒得到无毒苗株，继而在大田快速繁殖的技术。脱毒及离体快繁，是目前植物组织培养应用最多、最广泛和是有效的一个方面。现在植物的脱毒技术有多种，其中应用最广泛的有三种：热处理法、茎尖培养脱毒法、抗病毒药剂法，将不同的方法相结合起来应用效果更好。 1.1 热处理法 1.1.1 概述 热处理法是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度，得到一小部分不含病毒的植物分生组织，然后进行无毒个体培育。 热处理可通过热水浸泡或湿热空气进行。热水浸泡对休眠芽效果较好，湿热空气对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒又能使寄主植物有较高的存活机会。热空气处理比较容易进行，把旺盛生长的植物移入到1个热疗室中，在3540下处理一段时间即可，处理时间的长短，可由几分钟到数月不等3 。热处理的方法有恒温处理和变温处理，处理的材料可以是植株，也可以是接穗。1.12原理热处理脱毒是根据病毒与寄生细胞对高温的忍耐程度不同，选择适当的温度和处理 时间，植物组织中的很多病毒被部分地或完全地钝化而可控制其的活动，但很少伤害甚至不伤害寄主组织，从而让植物细胞加快生长，使生长点附近不带病毒，从而达到脱毒的目的。1.2 茎尖培养脱毒法 1.2.1 概述 茎尖培养脱毒就是采取茎尖分生组织离体培养的方法获取无病毒试管苗，其方法是在解剖镜下，用解剖刀进行迅速准确地茎尖剥离，因为茎尖分生组织基本不带病毒，利用植物茎尖分生组织进行离体培养，再结合病毒检测，就可以获得无病毒的植株。茎尖培养脱毒法脱毒率高，脱毒速度快，能在较短的时间内得到较多的原种繁殖材料，但这种方法存在的缺点是植物的存活率低。为了克服这一缺点，现在经常是将茎尖培养与热处理相结合来使用。茎尖培养与热处理相结合之所以能够提高脱毒效果，是由于热处理可使植物生长本身所具有的顶端免疫区得以扩大，有利于切取较大的茎尖（1mm左右），从而能够提高培养或嫁接的成活率。 1.2.2 原理 茎尖培养脱毒的原理是植物体内病毒靠维管束系统移动，分生组织中没有维管束存在，病毒只靠胞间连丝移动，速度很慢，难以追上生长活跃的分生组织，所以旺盛生长的根尖、茎尖一般都无病毒或很少有病毒分布。 据研究，植物体内某一部分组织器官不带病毒的原因是：分生组织的细胞生长速度快，病毒在植物体内繁殖的速度相对较慢，而且病毒的传播是靠筛管组织进行转移或通过细胞间连丝传递给其他细胞，因此病毒的传递扩散也受到一定限制，这样便造成植物体的部分组织细胞没有病毒。根据这个原理，可以利用茎尖培养来培育无病毒苗木。 1.3 抗病毒药剂法 1.3.1 概述 抗病毒药剂法，这是一种新的脱毒方法，运用一些抗病药剂的作用影响病毒RNA的复制形成，干扰病毒的正常生长，从而达到除去病毒的目的。常用的抗病毒化学药物有三氮唑核苷（病毒唑）5-二氢尿嘧啶，（DHT）和双乙酰-二氢-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）。这些药物常常通过直接注射到带病毒的植株上，或者加到植株生长的培养基上。这种方法一般要与茎尖培养相结合应用。经过抗病毒药剂处理的嫩茎，切取茎尖，再进行组织培养，就会提高脱毒率和成活率。 1.3.2 原理 抗病毒药剂法的作用原理是抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻止病毒RNA 帽子结构形成而达到除去病毒的效果。 2脱毒效果的检测方法经过脱毒处理的植株是否还存在病毒，必须经过病毒学检测才能确定。传统上一直沿用的检测方法是目测法，但是这种方法无法剔除潜隐性病毒。后来出现的指示植物法，扩大了检测范围。近年来随着生物科学的迅猛发展，免疫学方法，分子生物学方法等许多先进的理化技术的应用，促进了病毒检测技术的改进与发展。下面简要介绍几种检测脱毒苗的方法。2.1 植株直接测定法 直接观察植株茎叶有无某种病毒引起的可见症状，是最简单的测定方法。不过，由于某些寄主植物感染病毒后需要较长的时间才出现症状，有的并不能使寄主植物出现可见的症状，因而无法快速检验。2.2 指示植物法 此法利用病毒在其他植物上出现症状的特征，作为鉴别种类的标准。当原始寄主的症状不明显时，就可用指示植物法，这是因为指示植物比原始寄主更容易表现症状。具体做法是将病叶研磨，把汁液接种到寄主植物上，对于木本植物，是将原始寄主嫁接到指示植物上。指示植物法简便易行，成本低，但它灵敏性差，所需时间长，难以区分病毒种类。 2.3血清学方法 抗血清鉴定法要进行抗原的制备(包括病毒的繁殖，病叶研磨和粗汁液澄清等)，抗血清的采收、分离等。血清可分装到小玻璃瓶中，贮存在 15 25 的冰冻条件下。测定时，把稀释的抗血清与未知的病毒植物在小试管内混合，这一反应导致形成可见的沉淀，后根据沉淀反应来鉴定病毒。 此法灵敏度高，然此获得检测结果迅速，是目前检测病毒的一种最好方法。此外，PCR 微量板杂交法4 、电子显微镜检定法、病毒症状学诊断法等也可用来检测植物病毒。 3马铃薯组织培养脱毒快繁技术 鉴于当前农业经济作物生产上苗木（主要是无性繁殖作物）存在着严重病毒累积、品种退化、产量和品质大幅度的下降等问题，探索一种脱毒效果好、繁殖系数高、简易且经济的繁育良种及健苗技术，是当前农业经济作物种苗木生产中急需研究和探讨的课题。下面以马铃薯为例，进行热处理加茎尖培养结合病毒检测法获得脱毒苗的方法，简述植物组织培养脱毒快繁技术在马铃薯育种中的应用。 3.1 研究简史 马铃薯在种植过程中易感染病毒，当条件适合时，就会在植株体内增殖，转运和积累于所结薯块中，并且世代传递，逐年加重3 。病毒的增殖与植物正常代谢极为密切，目前尚没有发现既能杀死病毒又不损伤植物的药剂，病毒危害一度成为马铃薯的不治之症。1953 年Nirris 将孔雀石绿（Malachite green）加入培养基中抑制病毒繁殖，并通过茎尖组织培养，获得青山（Green mountain）品种无 PVX（马铃薯 X 病毒）的马铃薯植株。此后，通过茎尖组织培养获得无病毒植株的技术迅速发展，为解决马铃薯病毒危害提供了有效途径，为生产提供优良种薯。目前，国际上用茎尖培养产生的马铃薯品种已达150个左右1 。 科学研究结果证明，侵染马铃薯的病毒有20多种。这些病毒一旦侵入马铃薯植株和块茎，就会引起马铃薯退化，出现各种各样的病态，造成不同程度的减产。研究的结果还证明，病毒在植物组织中分布是不均匀的，并且受一定环境条件影响，在靠近马铃薯茎的顶端病毒浓度很低或不含病毒。根据这一特点，通过茎尖培养可以获得马铃薯无病毒苗2 。另外，马铃薯病毒，有的对温度比较敏感，有的不敏感，但对植株或发芽的块茎进行高温处理后再作茎尖培养，一般脱毒率都比较高。因此，在茎尖培养前，对植株和发芽块茎进行3035，28天的高温预处理，能收到良好的效果。 3.2 马铃薯茎尖培养脱毒方法 利用茎尖组织培养结合病毒检测，对马铃薯进行脱毒，进而生产脱毒种薯用于生产，可有效地防止种薯退化，大幅度提高马铃薯产量。3.2.1 取材和消毒将欲脱毒地品种块茎催芽，芽长45cm 时，剪芽并剥去外叶，自来水下冲洗40min，于无菌室内用漂白粉溶液消毒后，无菌水冲洗23次。 3.2.2 剥离茎尖和接种 在无菌室内，于40倍地解剖镜下，剥取带1个叶原基地茎尖，接种于MS茎尖培养基地试管中。试管中的MS茎尖培养基包括大量元素、微量元素、有机成分和生长素、细胞分裂素、蔗糖和琼脂，pH值为5.8，经过高压蒸汽灭菌后使用，每试管接种1个茎尖。3.2.3 培养基和培养条件 茎尖培养的关键是将脱毒后的茎尖透导生成带有完整根、茎、的植株，因此选择适合的培养基十分重要。对于马铃薯的茎尖培养来说，需要较多的NO3和NH4 营养，MS和Miller 基本培养基都是较好的培养基，而且附加少量（01.mol/l0.5mol/l）的生长素或细胞分裂素或二者都加，培养的效果更好。接种的茎尖培养于25、15003000LX 光照条件下培养室内，3个月则长成34 片叶的小植株在无菌条件下，进行切段扩繁2 。 3.2.4 病毒检测 5 。病毒检测是茎尖脱毒不可缺少的步骤。经过脱毒技术得到的脱毒植物必须经过严格的病毒检测，证实确实无毒又具备优良性状后才能作为种苗。常用鉴别寄主即指示植物法或血清学方法进行检测，及时淘汰血清学阳性反应或在指示植物上有症状的茎尖苗，无任何反应的茎尖苗即脱毒苗用作大田快速繁殖。3.2.5 结果通过利用茎尖组织培养结合病毒检测法获得马铃薯脱毒苗，经病毒检测，除去了马铃薯中的病毒病，脱毒率可达100%。 4 植物组织培养脱毒快繁技术应用前景的简述 植物组织培养技术在作物上主要用于育种和良种繁殖，其次用于无性繁殖作物的脱毒和快繁以及种质的保存等，可见植物组织培养脱毒快繁技术对于农作物苗木的生产具有极其重要的地位 1 。一些农作物或是花卉植物等因长期的栽培和种植，植物体内被侵染携带病毒、种性退化现在能利用组织培养及快繁脱毒方法开发出的植物脱毒新品种有马铃薯、甘薯、生姜、大蒜、草莓、罗汉果、棕榈、剑麻、香蕉、甘蔗以及花卉植物等几百种再生植株。目前这种技术已得到了广泛应用，前景及范围非常广阔。 参考文献