细菌、酵母菌、霉菌和放线菌接种方法和形态观察.doc

注意： 由于实验内容较多，所以我们只要把蓝色字体部分写在实验报告上即可，黑体字部分自己看一下。由于11-13周为教学质量检查周，督导随时可能来查，所以预习报告还是要写。 细菌、酵母菌、放线菌和真菌接种方法和形态观察一、微生物的接种技术 1 目的 1.1学习掌握微生物的几种接种技术 1.2 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节 2 基本原理将微生物培养物或含有微生物的样品在无菌条件下移植到培养基上的操作技术称为接种。接种的关键是严格进行无菌操作。常用的接种方法有斜面接种、液体接种、穿刺接种、平板接种和固体接种等。3 实验材料3.1 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、玫瑰暗黄链球菌、曲霉、荨麻青霉的斜面培养物3.2 培养基：营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基及高氏1号培养基的斜面和平板3.3 试剂：5ml无菌生理盐水试管3.4 仪器与其他用品酒精灯、记号笔、试管、橡胶塞、试管架、接种环、培养皿、超净台等。 4 操作步骤 4.1 斜面接种法 斜面接种法主要用于传代活化、纯化培养、鉴定或保存菌种。通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，液体培养基中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行。4.1.1准备工作将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在外侧，接种管在内侧，斜面向上管口对齐，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。4.1.2接种环灭菌右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍。4.1.3拔管塞和烧烤试管口用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。4.1.4接种环冷却和取菌将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出。4.1.5接种接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。不同种类微生物的接种方式各异，具体如下：（1）细菌和放线菌 由斜面培养基底部自下而上来回做“Z”形密集划线，勿划破培养基。（2）真菌 菌落为局限性生长的曲霉、青霉等采用上下涂布法接种。菌落为扩散性生长的根霉、毛霉等采用点植法接种。4.1.6塞管塞和接种环灭菌接种完毕，将接种环抽出，灼烧管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管做好标记后放入试管架，即可进行培养。4.2平板接种法平板接种法就是用接种环将菌种或用无菌吸管将定量菌液接种至平板培养基的方法，主要用于观察菌落特征、分离纯化菌种和平板活菌计数。其接种方式有倾注接种、涂布接种、划线接种和点植接种。4.2.1倾注平板法（1）倾注平板 无菌条件下取适量菌液倾注于平皿中。（2）倒平板 将灭菌好的培养基倒入平皿，并迅速轻轻旋动平皿，使培养基与菌液充分混匀。（3）培养 培养基凝固后，将平板倒置于培养箱中培养。4.2.2涂布平板法（1）倒平板 将灭菌好的培养基倒入平皿。（2）涂布平板 无菌条件下吸取菌液滴加于平板培养基表面中心位置，左手持平皿并将皿盖打开一缝，右手持涂布棒将菌悬液自平板中央以同心圆方向轻轻向外涂布扩散，使之分布均匀，静置5-10min，使菌液浸入培养基。（3）培养 培养基凝固后，将平板倒置于培养箱中培养。4.2.3平板划线法（1）倒平板 将灭菌好的培养基倒入平皿。（2）平板划线 通过划线使样品在平板上形成单个菌落。连续划线法 用于稀释液（见下图右）分区划线法 用于较浓的菌样（本实验细菌、酵母菌、放线菌采用此方法，下图左）注意：接种环勿划破培养基，划线不宜重叠，要疏密适中。4.2.4平板点植接种法此法适用于观察霉菌的菌落特征（见下图）。用接种环蘸少许无菌生理盐水，挑取斜面上少量菌丝或孢子，以三个角三点的形式轻轻点种于平板培养基上。接种时最好倒置平皿，以免霉菌孢子飞扬。4.3 液体接种法多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下：由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可。接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。 4.4 穿刺接种法 此法多用于半固体、醋酸铅、三糖铁琼脂与明胶培养基的接种，操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同。但必须使用笔直的接种针，而不能使用接种环。 接种柱状高层或半高层斜面培养管时，应向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接种针。注意勿使接种针在培养基内左右移动，以使穿刺线整齐，便于观察生长结果。4.5 固体接种法 普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为：用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。用固体种子接种固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。二、形态与菌落特征观察1 目的要求（1）观察并描述出细菌、酵母菌、放线菌、真菌的平板菌落特征（群体形态）。（2）了解其菌落在其形态学鉴定上的重要性。（3）了解观察酵母菌、放线菌、常见霉菌形态特征（个体形态）的基本方法。2 基本原理（1）各种细菌在平板上形成的菌落均具有一定特征，其菌落一般较湿润、光滑、透明、易挑起、菌落正反面及边缘、中央部位的颜色一致，且菌落质地较均匀等，菌落往往较小，较薄且有“细腻”感。它对细菌的分类、鉴定有重要的意义。（2）酵母菌菌落一般亦较湿润、光滑、易挑起、菌落正反面及边缘、中央部位的颜色一致，但其菌落一般比细菌大、厚而且透明度较差。酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大，一般成圆形、椭圆形、柱形和藕节形等。本实验用水碘液浸片来观察生活的酵母形态。（3）放线菌菌落局限生长，小而薄，多为圆形，边缘有辐射状，外观呈干燥、不透明的丝状、绒毛状或皮革状等特征。由于营养菌丝伸入培养基中使菌落和培养基连接紧密，故菌丝不易被挑起。一般情况下，菌落中心的颜色常比边缘深，由于气生菌丝、孢子和营养菌丝颜色不同，常使菌落正反面呈不同颜色。放线菌可用水浸片法在显微镜下观察其形态。放线菌是由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细胞菌丝体。菌体分为两部分，即潜入培养基中的营养菌丝 ( 或称基内菌丝 ) 和生长在培养基表面的气生菌丝。有些气生菌丝分化成各种孢子丝，呈螺旋形、波浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆形或杆形。气生菌丝及孢子的形状和颜色常作为分类的重要依据。（4）霉菌的菌落大而疏松，由于孢子不同的形状，构造和颜色，菌落表面往往呈现不同的结构和色泽，菌落在固体培养基上生长呈棉絮状（毛霉）、蜘蛛网状（根霉）、绒毛状（曲霉）和地毯状（青霉）。霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放线菌大得多，分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。霉菌菌丝比较粗大（菌丝和孢子的直径达到3 10m），通常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍。可采用乳酸石碳酸棉蓝浸片法来观察其形态。3 实验材料3.1菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、玫瑰暗黄链球菌、曲霉、荨麻青霉的平板培养物。3.2培养基：营养琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基及高氏1号培养基。3.3试剂与染色剂：0.85%生理盐水、革兰氏染色用碘液、0.1%美蓝染色液、乳酸石碳酸棉蓝染色液、50%乙醇等。3.4仪器或其它用具：接种针、载玻片、盖玻片、镊子、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。4操作步骤4.1菌落特征的观察4.1.1细菌菌落的描述菌落大小：大菌落（5mm以上）、中等菌落（3-5mm）、小菌落（1-2mm）、露滴状菌落（1mm一下）菌落形状：圆形、放射状、假根状、不规则等菌落颜色：乳白色、灰白色、金黄色、粉红色等菌落质地：黏稠、脆硬等菌落表面形态：有光滑、皱褶、放射状、根状等菌落边缘形态：有整齐、波状、丝状、锯齿状、裂叶状等形态菌落隆起形态：有扁平、隆起、草帽状、胶状等透明度：可分为秀明、半透明、不透明等4.1.2酵母菌菌落形态的描述：可参照细菌4.1.3放线菌和霉菌菌落的描述：菌落大小：分局限生长和蔓延生长，用格尺测量菌落的直径和高度菌落表面的形态：粗糙、同心圆、辐射状沟纹、粉状、绒毛状或皮革状、疏松或紧密、有无水滴等。菌落颜色：菌落正面颜色（包括气生菌丝或孢子颜色）；菌落反面颜色（指营养菌丝颜色）；有否水溶性色素？（色素会渗入培养基中，使菌落周围的培养基改变颜色）。菌落的组织形状：棉絮状、蜘蛛网状、绒毛状和地毯状。4.2个体形态特征的观察4.2.1酵母菌的形态观察水-碘液浸片法 在载破片中央加1小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔于水-碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。4.2.2放线菌的形态观察（1）插片：在平板的一半面积划线接种，在接种线上将盖玻片1/2长度以45角插入琼脂，平板另一半先插片，然后将少量放线菌孢子接种于盖玻片与琼脂相接的沿线。平板倒置28培养3-5天。（2）0.1%美蓝染色液染色：取1滴染液置于载玻片中央，将上述平板中的盖玻片取出，将有菌的一面向下以45角浸于载玻片的染色液中（避免气泡）。（3）镜检：用高倍镜观察其单个分生孢子及其基内菌丝。4.2.3霉菌的形态观察（1）制片：在干净的载玻片上加一滴乳酸