包埋法固定化微生物问题初探.doc

包埋法固定化微生物问题初探韩斌 (南开大学环境科学与工程学院 环境科学系)指导老师：李莹 蔡宝立 潘继伦摘 要 本文概括介绍并比较了固定化技术的几种主要的方法，并对目前笔者正在进行的包埋法固定化试验中的两个方法海藻酸钠包埋法和PVAH3BO3包埋法做了一定的介绍和不同方法的比较。最后，简要介绍了固定化细胞的性能的评价以及该种技术的应用和前景。关键字 固定化 包埋法 海藻酸钠 PVAH3BO3 载体1、 引言固定化微生物技术使用化学或物理手段，将游离细胞或者酶定位于限定的区域，使其保持活性并可反复利用的方法。最初主要用于发酵生产，70年代后期，被利用到水处理领域，近年来则成为各国学者研究的热点。固定化微生物技术克服了生物细胞太小，与水溶液分离较难，易造成二次污染的缺点，保持了效率高、稳定性强、能纯化和保持高效菌种的优点，在废水处理领域有广阔的应用前景。在实际应用过程中，如何固定、何种载体，才能使固定化微生物能较长时间的保持一定的强度和活度，才能降低固定化成本，延长固定微生物的使用寿命，是该技术在污水处理中得到广泛应用的关键。2、 常用的固定化方法废水处理中常用微生物固定化方法主要有：包埋法、交联法、载体结合法。 2.1包埋法包埋法的原理是将微生物细胞截流在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中。通过聚合作用或者离子网络形成，或通过沉淀作用，或改变溶剂、温度、pH值使细胞截流。凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄漏，同时能让基质渗入和产物扩散出来。固定化微生物细胞的实用化对包埋载体的要求包括：（1） 固定化过程简单，易于制成各种形状，能在常温常压下固定化；（2） 成本低；（3） 固定化过程中及固定化后对微生物无害；（4） 基质通透性好；（5） 固定化细胞密度大；（6） 载体内细胞漏出少，外面的细胞难以进入；（7） 物理强度和化学稳定性好；（8） 抗微生物分解；（9） 沉降分离性好。 在这些要求中，（1）和（2）涉及固定化细胞制备的成本；（3）（6）针对固定化细胞的催化活性；而（7）（9）则是出于对固定化细胞的操作稳定性的考虑。2.2交联法交联法是使用双功能的试剂与酶分子进行分子间的交联固定化方法。由于酶蛋白的功能团参与此反应，所以酶的活性中心构造可能受到影响，而使酶显著失活。此外，交联剂如戊二醛等价格昂贵，限制了其应用。2.3吸附法又称载体结合法，是通过物理吸附、化学或者离子的结合，将微生物固定于非水溶性载体。这种方法操作简单，对微生物活力影响小，但所结合的微生物数量有限，反应稳定性和反复使用性差。主要分为物理吸附法、共价结合法、离子结合法和生物特异性吸附法四种方法。2.4三种固定化方法的比较尽管固定化方法多种多样，但没有一种理想的、普遍适用的方法。交联法突出优点是可以获得很高的细胞密度，但由于缺乏良好的机械强度而不能得到广泛的应用。吸附法的固定操作简单，条件温和，而且载体可以再生；但是细胞与载体之间的结合力较弱，因此操作的稳定性不好。包埋法有较好的综合性能，催化活性保留和存活力都比较高，且包埋在反应工程（包括反应器的设计、操作稳定性等）中应用灵活，因此，包埋法成为整个固定化生物催化剂技术中应用最广泛的固定化方法；但是包埋法的扩散阻力较大，使细胞的催化活性受到限制，且不适用于涉及大分子物质的反应。三种固定化方法总结于下表：表一 三种固定化方法的比较性 能交联法吸附法包埋法制备的难易结合力活性表面固定化成本存活力适用性稳定性载体的再生空间位阻适中强低适中无小高不能较大易弱高低由适中低能小适中适中适中低有大高不能大3、 包埋法固定化微生物的两种方法举例天然高分子多糖类的海藻酸钠，具有固定化成形方便，对微生物毒性小以及固定化密度高等优点，但是其抗微生物分解性能较差，机械强度较低，同时海藻酸钠凝胶再高浓度的磷酸缓冲液的反复冲击下，经过一段时间，颗粒变软、粘连。合成高分子化合物中常用的载体材料是聚乙烯醇（polyvinyl alcohol 简称PVA），其突出优点是抗微生物分解性能好，机械强度高，化学稳定性能好。但是聚合物网络的形成条件比较剧烈，对微生物细胞的损害较大，而且成形的多样性和可控性不好。下面将对这两种包埋方法作一个简单的介绍：3.1海藻酸钙包埋法3.1.1原理 海藻酸钙包埋法是一种使用最广、研究最多的包埋固定化方法，它具有固化、成形方便，对微生物毒性小，固定化细胞密度高等优点。海藻酸是用于包埋固定化微生物的第一个聚合物，但是当存在高浓度的K+、Mg2+、磷酸盐以及其他单价金属离子时，海藻酸钙凝交的结构会受到破坏。此外，由于海藻酸钙凝胶网络的孔隙尺寸太大，酶可能会从网络中泄露出来，因此不适合大多数酶的固定化。海藻酸盐是棕色藻类的胞内产物，它由两种不同类型的单糖组成，即1，4D甘露糖醛酸（M）和1，4L古洛糖醛酸（G）。海藻酸盐是一种聚合物。海藻酸盐不能形成热可逆性凝胶。通常是在其钠盐溶液中加入二价离子，如Ca2+，通过Ca2+取代Na+来形成凝胶网络。凝胶的性质与引入的二价阳离子及海藻酸钠的类型（主要是两种单糖的组成比例）有关。二价阳离子对凝胶的机械强度有较大的影响，元素周期表的第二主族金属离子于海藻酸钠盐形成的凝胶，其强度顺序如下：Ba2+Sr2+Ca2+Mg2+利用海藻酸钠凝胶固定化微生物法安全、快速、制备简单，反应条件温和，成本低廉且适用于大多数微生物的固定化。3.1.2固定化方法以海藻酸盐为载体，建立包埋固定化微生物的方法如下：方法I将海藻酸钠加热溶于水；将海藻酸钠溶液与微生物细胞混合均匀，使海藻酸钠最终浓度为2%4%；将海藻酸钠与菌体混合液用针形管滴入5%10%的CaCl2溶液中，固定化78h；滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。方法 II将按方法I制得的固定化细胞颗粒置于0.06mol/L的己二胺溶液中搅拌12h；滤出颗粒，水洗后，用0.5%戊二醛交联5min；滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。方法III将按方法I制备的固定化颗粒浸泡于下列溶液中： 壳聚糖 0.5% CaCl2 0.2mol/L pH 6.0滤出颗粒，水洗后，用0.5%戊二醛交联5min；滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。 分别利用以上三种固定化方法，包埋黑曲酶细胞，比较各种固定化细胞的活性，其结果如表二： 表二 海藻酸钙包埋法的比较固定化方法方法I方法II方法III固定化细胞相对活性57.1%52.9%44.8%由表二可以看出，用海藻酸钠系列包埋固定化方法固定化微生物，固定化细胞的活性较高。其中用方法I固定化细胞的活性最高，在方法II、III中，由于在海藻酸钙凝胶表层突上了一层高分子膜，虽然增强了固定化颗粒的机械强度，但是同时加大了底物及氧的扩散阻力，从而降低了细胞活性。此外，在方法II、III中所采用的戊二醛对细胞液具有毒性，在使用前应作毒性试验，确定是否采用改种交联剂。3.1.3海藻酸钠包埋法固定化试剂对细胞活性的影响（1）海藻酸钠对细胞活性的影响 海藻酸钠是一类天然高分子多糖类，对微生物没有毒害作用。但海藻酸钠的浓度会影响固定化细胞的机械强度、质量传递等，进而影响到微生物的活性。海藻酸钠浓度对固定化细胞活性的影响如表三所示。表三 海藻酸钠浓度对细胞活性的影响海藻酸钠浓度/%细胞相对活性/%成球难易海藻酸钠浓度/%细胞相对活性/%成球难易1.056.2易2.552.3易1.557.1易3.045.6较难2.055.4易（2）CaCl2浓度细胞活性的影响在海藻酸钠包埋固定化过程中，凝胶化剂CaCl2中的Ca2+于海藻酸钠根离子螯合形成不溶于水的海藻酸钙凝胶，从而将细胞固定。CaCl2溶液的浓度对固定化细胞颗粒机械强度的影响见表四。表四 CaCl2浓度对固定化细胞凝胶机械强度的影响CaCl2浓度/%234510机械强度较好较好较好好好随着CaCl2浓度的增加，微生物细胞的活性降低。当CaCl2浓度低于5%时，细胞活性可以保持在80%以上；但是当CaCl2浓度达到10%，细胞活性下降到60%左右，主要原因估计有两种（i）由于盐的渗析作用，引起细胞脱水，致使微生物活性部分丧失；（ii）在PCR技术中，CaCl2是使细胞处于感受态的物质，这个时候微生物是最脆弱的，很容易被外界的干扰破坏。从表四可以看出，CaCl2浓度对固定化细胞的机械强度影响较大。当CaCl2浓度为2%3%时，固定化颗粒在使用过程中会出现膨胀，甚至出现裂缝活破碎现象。因此，海藻酸钙包埋法固定化细胞活性较高。3.2 PVAH3BO3包埋法3.2.1原理聚乙烯醇是一种新型的微生物包埋固定化载体，它具有机械强度高，化学稳定性好，康微生物分解性能强，对微生物无毒，价格低廉等一系列优点，是一种具有实用潜力的包埋材料，近年来在国内外获得了较广泛的研究。聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，简称PVA）的结构为： 聚乙烯醇在加热后溶于水，在其水溶液中加入添加剂后发生凝胶化，或者在低温下（-10）冷冻形成凝胶，从而将微生物包埋固定在凝胶网络里。常用添加剂有硼酸和硼砂，在PVA水溶液中加入硼酸活着硼砂，由于化学反应而形成凝胶。PVA于硼酸反应形成的凝胶为单二醇型，与硼砂反应形成的凝胶为双二醇型，其结构式如图1。 图1 PVA与硼酸和硼砂形成的凝胶结构PVA于硼砂反应形成凝胶时，成形困难，凝胶呈海绵状结构，强度较低。但硼砂的用量较硼酸用量低得多，所以值的进一步研究。就目前的研究来看，大多采用H3BO3做交联剂。PVAH3BO3包埋法是一种制备容易且价格低廉的固定化方法，其反应原理如图2。图2 PVAH3BO3包埋法的反应原理利用该方法制得的凝胶颗粒机械强度高，使用寿命长且弹性好。 3.2.2固定化方法 以PVA为固定化载体，建立了利用PVAH3BO3包埋固定化微生物细胞的方法，具体方法如下： 方法I将聚乙烯醇（PVA）加热溶于水；将微生物细胞与PVA溶液混合均匀，使PVA最终浓度为10%；将上述混合液滴入饱和的硼酸溶液中，放置10h，使其充分反应；滤出固定化颗粒，用生理盐水洗净，备用。方法II将聚乙烯醇（PVA）加热溶于水,冷却；将微生物细胞与PVA溶液混合均匀，使PVA最终浓度为10%；将PVA与微生物细胞的混合液到入已灭菌的培养皿中，缓慢加入饱和硼酸溶液，浸泡10h；将凝胶切成3mm3mm3mm的小方块，用生理盐水洗净，备用。方法III将聚乙烯醇（PVA）与海藻酸钠加热溶于水,冷却；将微生物细胞与上述溶液混合均匀，使PVA与海藻酸钠最终浓度分别为7.510%，0.4%1.0%；将上述混合液用针形管滴入下列溶液中： H3BO3（饱和溶液） CaCl2 1.05.0 pH值4.07.0放置10h，使之充分反应；滤出颗粒，用生理盐水洗净，备用。利用上述固定化方法，包埋固定化黑曲酶，比较了固定化细胞的活性，结果如表五所示。表五 PVAH3BO3法固定化的比较固定化方法方法I方法I方法III固定化细胞相对活性/%20.4%23.1%35.2%从表五可以看出，采用方法III，即改进的PVAH3BO3法固定化细胞，其活性明显提高，这是由于在方法III的固定化过程中，引入了少量的海藻酸钠。海藻酸钠作为一种多糖类天然高分子化合物，对微生物细胞器一定的保护作用，减轻了硼酸对微生物的毒性作用，因此提高了固定化细胞的相对活性。3.2.3 PVAH3BO3法中固定化试剂对细胞活性的影响（1） PVA对细胞活性的影响 一般来说，PVA的浓度对微生物细胞活性的影响不大，即使高达10%时，对细胞活性也没有明显的不良影响。但是，PVA浓度增大，溶液的黏度随之增大，使底物和产物的扩散，尤其是氧气的传递受到影响，进而影响细胞活性。（2） H3BO3对细胞活性的影响 硼酸的细胞毒性比较大，因而其对微生物细胞活性的影响是导致PVAH3BO3包埋固定化细胞活性底的主要原因。4、固定化细胞性能的评价4.1固定化颗粒的密度固定化颗粒是指一定体积内固定化颗粒的量， 因此，确定固定化颗粒的密度，也就是测定其体积和重量。但是由于固定化颗粒表面附着着一些水分，它不是固定化颗粒的组分，也无法通过过滤除去，可利用某些特殊溶剂（如葡萄糖）吸收，而这种溶剂不会扩散到固定化颗粒内，该溶剂被稀释的量即为附着的水量。这样，测定固定化颗粒的总量以及附着的水量即可通过计算的出其体积、密度和重量。具体方法此处不再详细叙述。4.2固定化颗粒的通透性和机械强度 固定化颗粒的通透性，也称为传质性能，是用来衡量的固定化细胞与外界交换能力的重要指标。通透性越好，固定化细胞与外界的物质交换越容易，固定化微生物对于外界污染物的降解能力越强。 机械强度，主要衡量固定化颗粒在外界的持续压力冲击下保持形状的能力，一般来说，机械强度越大，颗粒可重复利用率越高，在工程上的应用价值越大。 但是，通透性和机械强度是一对矛盾。在固定化过程中，固定化时间越长，颗粒的机械强度越大，但是通透性却降低；反之，固定化时间越短，通透性提高，机械强度却无法保证。因此，在实验中应该综合考虑两个因素，在两个指标中寻找最优的组合。4.3固定化颗粒的最适温度、最适pH值 固定化后的颗粒，由于在存在状态上与游离的微生物不同，因此在最适温度和最适pH值方面也会有很大的不同。可以通过做对照试验，测出不同组别在不同温度和pH值的条件下降解速率，从而找出最佳的降解的温度和pH值。 同时可以看到，在固定化以后，微生物可以存在的温度和pH值范围比固定化以前有了显著的扩大。4.4微生物的包埋量 由于在制作固定化颗粒的过程中，不可避免的会有一部分微生物没有包埋到颗粒之中，这部分微生物不会参加