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DNA测序原理和方法 DNA序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA序列分析的主流。美国PE ABI公司已生产出373型、377型、310型、3700和3100型等DNA测序仪，其中310型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310型DNA测序仪的测序原理和操作规程。【原理】 ABI PRISM 310型基因分析仪(即DNA测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则是相差1个碱基的3末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA序列，从而达到DNA测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段的碱基顺序或大小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4)。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为1040min。由于该仪器具有DNA测序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。【试剂与器材】1BigDye测序反应试剂盒 主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反应缓冲液等。2pGEM-3Zf (+) 双链DNA对照模板 0.2g/L，试剂盒配套试剂。3M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2mol/L，即3.2pmol/l，试剂盒配套试剂。4DNA测序模板 可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1l为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L，即200ng/l。5引物 需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2mol/L，即3.2pmol/l。如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。6灭菌去离子水或三蒸水。70.2ml或和0.5ml的PCR管 盖体分离，PE公司产品。83mol/L 醋酸钠(pH5.2) 称取40.8g NaAc3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。970%乙醇和无水乙醇。10NaAc/乙醇混合液 取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。11POP 6测序胶 ABI产品。12模板抑制试剂(TSR) ABI产品。1310电泳缓冲液 ABI产品。14ABI PRISM 310型全自动DNA测序仪。152400型或9600型PCR仪。16台式冷冻高速离心机。17台式高速离心机或袖珍离心机。【操作步骤】1PCR测序反应 (1) 取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：所加试剂 测定模板管 标准对照管 BigDye Mix 1l 1l待测的质粒DNA 1l pGEM-3Zf (+) 双链DNA 1l待测DNA的正向引物 1l M13(-21)引物 1l灭菌去离子水 2l 2l总反应体积5l，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。(2) 将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96 10s，50 5s，604min，25个循环，扩增结束后设置4保温。2醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP管中。(2) 加入25l醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4离心30 min，小心弃上清。(3) 加70%(V/V)的乙醇50l洗涤沉淀2次。12 000r/min于4离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀1015min。3电泳前测序PCR产物的处理。(1) 加入12l的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR管中，稍离心。(3) 在PCR仪上进行热变性(95 2min)，冰中骤冷，待上机。4上机操作 按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。仪器将自动灌胶至毛细管，1.2kV预电泳5min，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。5仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。6测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。【计算】测序反应精确度计算公式：100%差异碱基数(不包括N数)/650100%差异碱基即测定的DNA序列与已知标准DNA序列比较不同的碱基，N为仪器不能辨读的碱基。【注意事项与评价】1ABI PRISM 310基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。2本实验测序PCR反应的总体积是5l，而且未加矿物油覆盖，所以PCR管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧PCR管盖外，最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于44.5l，则此PCR反应可能失败，不必进行纯化和上样。3作为测序用户来说，只需提供纯化好的DNA样品和引物，一个测序PCR反应使用的模板不同，需要的DNA量也就不同，PCR测序所需模板的量较少，一般PCR产物需3090ng，单链DNA需50100ng，双链DNA需200500ng，DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为1.62.0，最好用去离子水或三蒸水溶解DNA，不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成3.2pmol/l较好。4本实验使用的测序试剂盒是BigDye荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测DNA长度为650bp左右。