茉莉酸甲酯对丹参茎叶丹酚酸和丹酚酸B含量的影响.doc

茉莉酸甲酯对丹参茎叶丹酚酸和丹酚酸B含量的影响【摘要】 目的探讨茉莉酸甲酯(methy jasmonat, MJ )对栽培丹参的药效成分影响，并为丹参地上部分的开发利用提供一定的研究依据。方法采用比色法和HPLC法，以丹酚酸和丹酚酸B为检测指标，对茉莉酸甲酯处理的丹参茎叶样品进行检测。结果丹参种苗经茉莉酸甲酯喷施处理后的48 h内，其茎叶中丹酚酸和丹酚酸B含量均高于对照，在所测试范围510-9510-3的浓度中，随浓度的升高而含量增加。结论外施茉莉酸甲酯能促进丹参茎叶中的丹酚酸和丹酚酸B含量的积累，可以考虑在生产中加以应用，并注意今后在丹参的种植及采收中地上部分的利用。 【关键词】 丹参 茉莉酸甲酯 丹酚酸 丹酚酸BAbstract：ObjectiveTo study the effect of methyl jasmonate（MJ）on medicine composition of cultivar Salvia miltiorrhiza，and provide some reference for the exploitation and utilization of the leaves and stems in Salvia miltiorrhiza.MethodsThe leaves and stems of Salvia miltiorrhiza were treated with MJ, the contents of salvianolic acid and salvianolic acid B were assayed by the methods of colorimetry and HPLC. ResultsWithin the concentration of 510-9510-3g/L, the contents of the salvianolic acid and salvianolic acid B in Salvia miltiorrhiza treated by MJ were higher than those in control, and increased while the concentration of MJ increased.ConclusionThe contents of the salvianolic acid and salvianolic acid B in the leaves and stems of Salvia miltiorrhiza can be promoted by MJ, and utlization in cultivated planting of Salvia miltiorrhiza should be considered.Key words：Salvia miltiorrhiza Bge.； Methyl jasmonate； Salvianolic acid； Salvianolic acid B 丹参Salvia miltiorrhiza Bge.为唇形科植物丹参的干燥根及根茎，其有效成分包括水溶性和脂溶性两大类。脂溶性成分主要是二萜醌类化合物（包括丹参酮、隐丹参酮等），水溶性成分主要为酚酸类化合物包括丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、咖啡酸、丹酚酸(salvianolic acid A、B 等）。丹参的水溶性酚酸类化合物，引起了医药学家的极大重视，也由于丹参的传统应用方式为水煎液，近些年来，对于其水溶性酚酸类化合物的研究较多1，2。丹酚酸B是目前研究较多的丹酚酸之一，在治疗心血管疾病、慢性肝炎，抗肝纤维化、抗动脉粥样硬化和改善记忆功能障碍等方面发挥着重要作用3。最新研究表明，丹参叶中的酚酸类含量与根中相似，有些甚至高于根部4，5。茉莉酸甲酯（MJ）是植物响应病原物、害虫等多种环境胁迫的共同信号分子，广泛存在于高等植物体内，并作为新型的植物激素，在调节植物生长发育、光合作用、抗逆反应等方面起着重要的作用，外施到植物体可以达到一定的逆境胁迫和调节效应6，7。有报道外源性MJ类化合物能有效刺激植物次生代谢物的生物合成，可引起多种植物次生产物的迅速积累8。 目前有利用MJ研究诱导丹参毛状根中的有效成分的积累的报道8，本研究旨在利用MJ作为诱导子,在丹参的生产中进行田间喷施实验，探索MJ对丹酚酸B的调控机制,以及MJ在丹参生产中的应用及丹参地上部分的进一步合理开发提供研究依据。1 材料 供试材料为丹参Salvia miltiorrhiza Bge种苗, 购于山东菏泽丹参种植基地，茉莉酸甲酯（MJ）为美国Sigma公司产品。实验地位于广东药学院大学城校区药用植物实验园。2 方法2.1 实验设计及处理实验设5个处理：（）对照（丹参喷清水）；（）喷施MJ 510-9mol/L；（）喷施MJ 510-7mol/L；（）喷施MJ 510-5mol/L；（）喷施MJ 510-3mol/L。小区面积1 m2，4次重复，随机区组实验设计。MJ和清水均在出齐三片复叶时喷施，将配好的各种浓度的MJ溶液用喷壶均匀地喷到对应各组叶片上，以喷满全部叶片为度，喷后立即套上保鲜袋。喷施后48 h取样，取每株苗的全部小叶片，将叶置60烘干箱烘6 h，取出粉碎，过50目筛后用棕色广口瓶保存。2.2 丹参总酚酸含量测定2.2.1 原儿茶醛标准曲线制定精密称取原儿茶醛8.50 mg，加水溶解并定容至20 ml（425 g/ml)，作为对照品溶液。分别精密吸取原儿茶醛对照品液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 ml加水至2 ml，分别加0.5%NaNO2 5.0 ml放置5 min，加入10%Al(NO3)3 0.5 ml，放置5 min，加入1 mol/L NaOH液5.0ml，放置10 min后，以显色剂为空白，在500 nm处测得吸光值。以浓度X为横坐标，吸光值Y为纵坐标，方程为Y=0.0014X+0.000 4，r=0.999 1，线性范围为26130 g/ml。2.2.2 总酚酸的测定精密称取样品粉末0.2 g，置50 ml容量瓶中，加2%盐酸水溶液约12 ml，浸泡15 h，加酸水补足量，振摇10 min，经干燥滤纸过滤，弃去初滤液，精密量取续滤液5 ml，置分液漏斗中，加NaCl 0.5 g，醋酸乙酯萃取3次，5 ml/次，水浴蒸干，残留物以无水乙醇溶解并定量转移到10 ml容量瓶中，再用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，经干燥滤纸过滤，弃去初滤液，精密量取滤液1 ml按原儿茶醛标准曲线测定的方法测定吸光度，计算生药水溶性总酚酸的含量。2.3 丹参叶片丹酚酸B含量测定2.3.1 色谱条件色谱柱为Dikma ODS C18 （4.6 mm250 mm，5 m）, 流动相为甲醇-乙腈-0.25%磷酸（301060），流速为1 ml/min，检测波长为286 nm；柱温30。2.3.2 对照品溶液的制备取丹酚酸B对照品3 mg，置10 ml容量瓶中，加75%甲醇适量，溶解，再用75%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。2.3.3 供试品溶液的制备取丹参样品粉末约0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇溶液25 ml，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用75%甲醇溶液补充丢失的溶剂量，摇匀，过滤，取滤液，即得。2.3.4 线性关系考察精密称取丹酚酸B对照品溶液，分别精密吸取2，4，8，10，12，14 l分别进样，测定峰面积，以峰面积Y对进样量X进行线性回归，得回归方程Y=23 602X-3 522.4，r=0.999 9；表明丹酚酸B进样量在0.6043.624 g范围内与峰面积成良好的线性关系。2.3.5 精密度实验取样品溶液20 l，重复进样6次。结果丹酚酸B峰面积RSD=1.25%，重复性良好。2.3.6 稳定性实验取样品溶液10 l，分别在制备后0，2，4，8，12，24 h测定，结果丹酚酸B峰面积RSD=1.58%，表明24h内溶液稳定。2.3.7 回收率实验平行在6份样品溶液中加入丹酚酸B标准品溶液1.7 ml，依法操作，测定，结果平均回收率为98.0%，RSD=1.0%。 丹酚酸B的HPLC图见图1。3 结果3.1 不同浓度MJ对丹参地上部分水溶性总酚酸含量的影响实验结果（见表1）显示，在所测试的范围内，丹参地上部分茎、叶的水溶性总酚酸含量随茉莉酸甲酯浓度的升高而增加，叶中的水溶性总酚酸含量增加的程度较茎中增加的大，如茉莉酸甲酯浓度为510-5mol/L时，叶的总酚酸含量较对照增加了62，茎中总酚酸含量较对照增加了36；茉莉酸甲酯浓度在510-3mol/L条件下，叶的总酚酸含量较对照增加了100，茎中总酚酸含量较对照增加了48。表1 不同浓度茉莉酸甲酯对丹参茎叶中总酚酸含量的影响（略）3.2 不同浓度MJ对丹参地上部分丹酚酸B含量的影响实验结果（图26，表2）显示，在测试的范围内，丹参地上部分茎、叶的丹酚酸B含量随MJ浓度的升高而增加，其中叶的丹酚酸B含量增加的程度较茎的大，如茉莉酸甲酯浓度为510-5mol/L时，叶的丹酚酸B含量较对照增加了83，茎中丹酚酸B含量较对照增加了29；MJ浓度在510-3 mol/L条件下，叶的丹酚酸B含量较对照增加了117，茎中丹酚酸B含量较对照增加了57。表2 茉莉酸甲酯对丹参茎叶中丹酚酸B含量影响的测定结果（略）3.3 MJ在不同时间内对丹参地上部分水溶性总酚酸含量的影响以510-5mol/L的MJ喷施丹参叶面，在不同时间检测叶和茎中的总酚酸含量，结果见图7。实验结果表明，随处理时间的延长，丹参叶和茎中的总酚酸含量增加，其中叶中的总酚酸含量增加的幅度较茎的大。在处理72 h和120 h后，丹参叶中总酚酸含量分别较对照增加了92%和108%，茎中总酚酸含量分别较对照增加了30%和44%。3.4 MJ在不同时间内对丹参地上部分丹酚酸B含量的影响以510-5mol/L的MJ喷施丹参叶面，在不同时间分别检测茎叶中的丹酚酸B含量。结果见图8。实验结果显示，随处理时间的延长，丹参叶和茎中的丹酚酸B含量增加，其中叶中的丹酚酸B含量增加的幅度也较茎的大。在处理72 h和120 h后，丹参叶中丹酚酸B含量分别较对照增加了117%和167%，茎中丹酚酸B含量分别较对照增加了57%和86%。4 讨论 MJ对植物次生产物积累的作用与其生理功能有关，外施MJ可以达到逆境的效应，MJ也是植物细胞响应多种环境胁迫的共同信号分子710。本项研究表明，利用MJ喷施丹参植株叶面，对丹参地上部分总酚酸和丹酚酸B的含量积累都有一定的促进作用，促进作用随MJ浓度的增加和时间的延续而增强。 药用植物的药效成分大多是次生代谢产物，植物次生产物的积累是与其生境密切相关的，一些逆境有利于次生产物的积累11，从生态学的角度分析，许多次生产物也是植物防御逆境的植保素类物质。研究表明，不同产地的丹参中的脂溶性和水溶性成分的含量均有显著差异12，表明丹参的次生产物含量受环境的调控性。在一些研究中利用MJ作为诱导子诱导培养的细胞积累目的产物，如：MJ能够诱导培养的肉苁蓉细胞中苯乙醇苷、红豆杉细胞中的紫杉醇等物质含量的增加, 对于培养的丹参毛状根中丹参酮含量的积累也有促进作用 8，13，14。MJ可以从植物的气孔进入植物体, 在细胞质中被酯酶水解为茉莉酸等小分子, 实现防御信号的远距离传导,并能在植物间进行信号交流，在植物组织的液相和气相中自由的快速移动。本研究结果显示，MJ对丹参叶的作用效应较茎的显著，可能由于MJ直接喷施到叶有关，而在茎中存在距离效应和浓度效应，相关机制需进一步研究。 丹参通常以根入药, 本项研究检