肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时PCR法 编制说明.doc

肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时pcr法 编制说明一、任务来源本标准由中华人民共和国商务部提出并归口，由商务部流通产业促进中心实验室生物检测室研究小组完成方法的建立优化、标准的起草制定工作。二、编制依据本标准遵循gb/t1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写、gb/t20001.4-2001标准编写规则第4部分：化学分析方法的编写规则、gb/t6379测量方法与结果的准确度（正确度与精密度第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的方法。三、目的和意义随着市场经济的不断深入发展，部分不法商贩为了谋求不正当利益，在肉（制）品中掺杂其他价格便宜的肉种，在肉（制）品市场出现了一种“以次充好、以假乱真”的现象。通过实验室前期大量的调查研究分析，我们发现肉（制）品中掺杂、掺假的现象已经十分普遍，大部分肉（制）品中掺有标称以外的其他价格便宜的动物源性成分，有的甚至全部为标称以外的其他价格便宜的动物源性成分。这极大地损害了消费者的利益，扰乱了流通市场秩序和健康发展，同时也对民族宗教信仰造成一定的潜在冲突。但目前，相应的检测鉴定方法标准的缺失，使得检测监测机构对此无标可依，无法可循，难于判断和裁决。为了规范国内市场流通秩序，保证市场的正当竞争，保护消费者的经济利益和对所购买商品的选择权、知情权及宗教信仰归属，制定本检测标准。四、编制过程肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时pcr法该方法标准由商务部流通产业促进中心起草编写。经过中国科学院微生物研究所、中国农业科学院饲料研究所、中国农业大学食品科学与营养工程学院三家单位进行了方法的复核验证实验，并提交了具体的复核验证报告。根据国家有关标准制定和修订工作的要求，商务部流通产业促进中心在肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时pcr法的起草编制过程中，主要工作包括以下几个方面：1、详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，如食品、化妆品和饲料中牛、羊、猪源性成分检测方法及动物源性饲料中哺乳动物源性成分定性检测方法等国内已申请的相关检验报告，并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。2、及时购置相关的实验试剂、标准品和其他材料；设计了实时荧光pcr方法检测动物源性成分的特异性引物和探针，并对其特异性进行了实验验证；摸索不同条件对引物对、探针及模板的浓度进行优化；对检测灵敏度和检测底限进行了确证；对混合肉样进行了鉴别试验。最终确定了最佳的检测方法，并确保本方法可以特异、灵敏、准确地对肉及肉制品中的动物源性成分进行快速、实时地鉴别。3、在技术指标完成试验工作之后，严格按照标准编写要求的体例格式，起草编写标准文本和编制说明。4、向相关行业的30多位专家、学者、教授、技术人员、从业人员、管理人员等进行了意见征求。收到意见后尽快参考反馈意见，根据实际情况，吸收正确、可行的建议或意见，并在标准征求意见稿中进行进一步修改和完善。5、向中国科学院微生物研究所、中国农业科学院饲料研究所、中国农业大学食品科学与营养工程学院三家单位提供标准方法的文稿和编制说明，提出了验证复合的要求，进行了方法的验证。三家单位都具有相应的检测设备，具备专业的生物学检测技术与丰富的检测经验。经过复核单位的独立、科学和严格的复核验证后，提供了三份复核验证报告。五、标准验证工作总结根据国标委主管部门的要求，起草小组按照标准所涉及的实验内容，制备了相应的实验材料，并编写了肉及肉制品中猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔源性成分的快速鉴定 实时pcr法（验证说明），邀请了中国科学院微生物研究所、中国农业科学院饲料研究所、中国农业大学食品科学与营养工程学院等三家科研单位，对该标准的技术原理、方法路线、方法特异性及方法灵敏度等方面进行了客观地验证试验和评价。验证工作结束，起草小组将回收的大量验证数据和实验图片整理归纳，形成了参加验证单位对标准方法的建议评价汇总表和验证试验结果汇总，并本着科学认真的态度对相应的建议和意见进行处理，在标准中作相应修改。通过严谨认真的实验验证及对标准文字材料进行的审核，3家单位一致认为该标准技术路线科学合理、方法灵敏度高、特异性强，标准科学、简单、实用，易于推广，建议尽早申报发布实施。六、标准技术方面说明（一）方法概述及原理在新的形势下，对肉（制）品中肉种的鉴别，传统感官方法对肉（制）品色泽、气味、组织性状等进行判断，显得可靠性、科学性不足。尤其对一些添加了色素、芳香剂的肉（制）品，及加工处理过的肉制品，感官判断更显得难度高和风险性大。本标准方法以分子生物学中荧光定量pcr-taqman探针法为基础，从基因水平对肉种dna进行鉴别鉴定。荧光定量pcr技术是生命科学领域新出现的一种检测定量技术，这项新技术利用发光技术对pcr扩增过程进行实时检测，能达到准确对样品中dna的初始量进行定量，整个过程闭管操作。扩增反应结束，可以直接获得检测结果，不需要传统pcr方法后继的电泳染色等繁琐步骤，减少了检测判定时间，更为重要的是在很大程度上减小了后继电泳加样带来污染假判和eb等核酸染料对操作人员造成的“三致”危害。线粒体存在于动物体绝大多数类型细胞中，是动物细胞中含量很高的一个细胞器。线粒体细胞色素氧化酶b（cytb），是线粒体基因组中一个功能性生物酶，目前在genbank上已有大量编码该酶的dna序列注册。以提取的肉（制）品中动物组织dna为pcr扩增模板，以分别针对猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔的特异性扩增探针引物进行实时荧光定量pcr扩增反应，最终对样品中目标dna进行判定，达到对样品中所含成分进行鉴别判断。通过对方法的条件优化、特异性、检测限等参数进行优化确定后，建立适用于实验室的检测方法，使检测工作更加规范、可靠、可信，解决实际的工作问题。（二）主要实验技术论证1实验技术路线实验中所用到的技术方法及主要实验技术路线如下图示：从genbank获取猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅及兔cytb基因序列，运用生物软件进行分析，设计合成特异性pcr扩增引物及探针对所设计合成的引物对进行特异性验证，选择检测鉴定最佳引物对对最佳引物对及探针的最佳工作浓度进行试验优化以最佳工作浓度引物对及探针，对检测模板dna的量进行试验优化试验确定检测方法的检测极限、灵敏度制备不同形式的添加样本，进行方法验证试验确定pcr扩增反应的最佳工作参数，初步建立检测鉴定方法建立对猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅及兔源性检测的快速鉴别 实时pcr检测方法2实验内容一 猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅及兔cytb基因序列获取及分析比较以genbank上已经登录公布的所有猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅及兔cytb基因序列为基础，运用生物软件dnaman进行序列比对分析，找出来自不同国家、地区、品种猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅及兔cytb基因种内保守序列区域，用于设计上下游扩增引物及探针。将所设计出的各物种pcr扩增引物及探针进行再次比对，排除种间交叉性，保证扩增的特异性。最后，将获得的各物种上下游扩增引物及探针序列提交genbank，进行blast确认，以确保所设计的引物及探针序列对目前已经公布的dna序列没有非特异性检测扩增。最终确定的引物及探针序列如表1所示，将其送至生物服务公司进行合成。表1 引物序列、扩增位点及长度和扩增条件畜禽种类引物、探针序列tm值 扩增位置、预期大小猪porcinefp: cgacaaagcaaccctcacac59509-579 bp71 bprp: tgcgagggcggtaatgat58probe: fam-cttcgccttccactttatcctgccattc-tamra68牛bovinefp: ctcctcggagacccagataac59744-822 bp79 bprp: agaagtatcactcgggtttg59probe: fam-ccagccaatccactcaacacaccc -tamra70羊sheepfp: cagccctcgccatagttcac59569-666 bp98 bprp: agggtggaagggaattttatctg58probe: tcttcctccacgaaacaggatccaaca68马horsefp: ccaatgcgtattctgactcttagtg59962-105 bp81 bprp: cgataattacgtatgggtgttcc58probe:fam-ctgacactaacatgaatcggcggacagc-tamra68驴donkeyfp: cctcagcactccccctcat60782-869 bp77 bprp: aaggataagggctaatacacca59probe:fam-ccagaatggtatttcctatttgcttacgcc-tamra69鸡chickenfp: cgacaacccaacccttacc59512-601 bp89 bprp: aggaaggtgaggtggatgata59probe: fam- acacttcctcctcccctttgcaatcgc-tamra69鸭duckfp: ggccacacaaatcctcacag59125-209 bp85 bprp: tgtgttggctactgaggagaaa59probe:fam-cctactggctatgcactacaccgcagac-tamra69鹅goosefp: agacaatccaaccttaacccga59512-588 bp77 bprp: ggactagggtgattcctgca58probe: fam-ccatccacttcctactgcccttccta-tamra68兔rabbitfp: gttctcgtcgcagatcttctca58978-1058 bp73 bprp: tacttgtccaatggtgatgaac58probe:fam-cactcacatgaatcggaggccaaccagta-tamra683动物基因组dna提取3.1动物肌肉组织dna小量提取（以商业试剂盒进行提取）a. 将称取的肉糜，放入研钵中，加入液氮，待样品冷冻完全后快速、用力研磨至粉末状。研磨时应间断加入液氮以防止材料融化；b. 将研钵移入65水浴，当样品粉末刚开始融化时，向研钵中加入 700 l的solution a和 1.2 l的rnase a，研磨 30 s；c. 收集 650 l研磨好的组织匀浆至collection tube中。如匀浆体积不足 650 l，请补充solution a至650 l。65 保温10 min；d. 加入400 l的solution b，振荡混匀；e. 加入1 ml的4 预冷的solution c，充分混匀后，12000 rpm离心 2分钟；f. 弃去上层有机相，再加入1 ml的 4 预冷的solution c，充分混匀后，12000 rpm离心 2 min；g. 弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于collection tube上的filter cup中，12000 rpm离心 1 min；h. 弃filter cup，在滤液中加入 400 l的db buffer，混合均匀；i. 将试剂盒中的spin column安置于collection tube上。将上述操作的混合溶液转移至spin column中，12000 rpm离心 1 min，弃滤液；j. 将 500 l的rinse a加入至spin column中，12000 rpm离心 30 s，弃滤液；k. 将 700 l的rinse b加入至spin column中，12000 rpm离心 30 s，弃滤液；l. 重复上步操作；m. 将spin column安置于新的 1.5 ml的离心管上，在spin column膜的中央处加入50200 l的灭菌蒸馏水或elution buffer，室温静置 1 min；n. 12000 rpm离心 1 min洗脱收集dna。3.2动物肌肉组织dna大量提取ctab-nacl法（参照文献进行）a. 取2 g硏碎的样本肌肉组织，至50 ml离心管中，加10 ml ctab-nacl裂解液，65 振荡水浴 1 h；b. 加入10 l proteinase k(20mg/ml)，65 振荡水浴，过夜；c. 取1 ml过夜处理液至eppendorf离心管中，12000 rpm离心10 min；d. 取800 l离心上清至新离心管中，加入600 l氯仿，充分混匀，12000 rpm离心10 min；e. 取600 l上层水相至新的离心管中，加入500 l预冷异丙醇，上下颠倒离心管，室温沉淀dna 30 min；f. 12000 rpm离心10 min，弃异丙醇，加入1 ml 75冰乙醇进行洗涤dna，12000 rpm离心2 min，弃尽乙醇，室温下风干，加入适量dd h2o溶解dna，并测定od260值。提取dna的a260在1.0-500 ng/l，a260/ a280在1.8-2.0之间为佳。4实验内容二 检测方法的建立提取各物种基因组dna作为模板，以合成好的引物对进行检测方法的建立，分别对最佳引物、探针工作浓度及dna模板量等参数进行优化。在实验中荧光定量pcr的反应体系及参数参考了酶试剂公司推荐的最佳体系及参数，具体如下：反应体系：master mix(2) 10.0 l上游引物fp 2.0 l下游引物rp 2.0 l探针probe（250 nm） 2.0 l模板dna template（50 ng） 1.2 l dd h2o 2.8 l 20l反应体系反应参数：50 2 min95 10 min40（95 15 s60 1 min）收集荧光4.1 引物浓度优化 为了使特定浓度扩增引物能产生最强的荧光信号、最佳的扩增曲线，对引物浓度进行优化，按如下体系进行摸索：引物浓度梯度：50 nm-300 nm-500 nm-900 nm表2 上下游引物浓度优化梯度ct值rp浓度fp浓度50 nm300 nm500 nm900 nm50 nm300 nm500 nm900 nm扩增结束后选取具有最小ct值、最强荧光信号及最佳扩增曲线的引物浓度对进行下步试验。4.2探针浓度优化为了使特定浓度探针，在浓度优化的引物对下，能产生最强的荧光信号、最佳的扩增曲线，对探针浓度进行优化，按如下体系进行摸索：探针浓度梯度：50 nm-125 nm-200 nm-250 nm扩增结束后选取具有最小ct值、最强荧光信号及最佳扩增曲线的引物浓度对进行下步试验。4.3 dna模板量与ct值线性关系试验以以上确定的最佳浓度引物、探针，按如下浓度梯度对模板dna进行倍比稀释，作为反应模板进行扩增反应，确定各检测体系最适量的模板dna，并以确定模板dna浓度范围与ct值线性关系。模板dna梯度浓度：10-3 ng/l、10-2 ng/l、10-1 ng/l、100 ng/l、101 ng/l、102 ng/l5确证实验对以上建立起的方法进行特异性与灵敏度试验。5.1 特异性验证对以上建立的检测体系，分别以猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔的基因组dna为模板，进行扩增检测，以评价各检测体系的特异性。验证试验除模板dna按照下表进行外，其他参数按照已经优化的条件进行：表3 特异性验证试验模板dna设置检测体系模板dna猪源性成分检测体系 猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔牛源性成分检测体系 猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔羊源性成分检测体系 猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔马源性成分检测体系 猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔驴源性成分检测体系 猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔鸡源性成分检测体系 猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔鸭源性成分检测体系 猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔鹅源性成分检测体系 猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔兔源性成分检测体系 猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔real-time pcr扩增结束，通过观察各体系对不同模板dna的扩增曲线及ct值来判定其特异性。若无典型扩增曲线且ct值大于30，判定检测体系无非特异性扩增。反之则认为检测体系与其他物种具有交叉反应。5.2混样检测灵敏度验证为了确定建立方法的混样检测下限，分别从dna核酸水平、肉样水平以及高压处理肉样水平进行试验确认。5.2.1 核酸水平以以上试验确定的各检测体系中的模板dna最佳使用量，分别按如下模式比例混合两种dna核酸，作为检测模板，以确定本方法对不同物种混合dna的检测下限和核酸水平的检测下限。表4 dna水平混合肉样混合体系及比例检测体系检测对象dna混合dna样单独dna样 ct值检测对象混合比例及检测ct值1%结果0.5%结果0.1%结果猪猪牛羊驴鸭鸭牛羊驴5.2.2 肉样水平为了确定本检测方法在样品水平，对混合量的检测极限值，同时考虑到经济因素，按如下模式比例混合两种肉样（每种混样制备100 g），以3.1介绍的方法提取混合肉样dna作为模板，以以上建立的方法进行试验：表5 混合肉样混合体系及比例检测体系检测对象混合肉样单独dna样 ct值检测对象混合比例及检测ct值检测对象混合比例及检测ct值（高压处理）1%0.5%0.1%1%0.5%0.1%猪猪牛羊驴鸭鸭牛羊驴5.2.3对高压处理肉样的检测为了同时验证本方法对一些加工处理的肉样或肉制品的检测能力，在制备以上混样的同时制备一份混样，121高压处理20分钟，以3.1介绍的方法提取混合肉样dna作为模板，以以上建立的方法进行试验。6结果与分析6.1 引物、探针序列线粒体细胞色素氧化酶b（cytb），是线粒体基因组中一个功能性生物酶，目前在genbank上已有大量编码该酶的dna序列注册。将genbank上已登录的所有猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔cytb基因序列运用生物软件dnaman进行比对分析，找出来自不同国家、地区及品种所有猪（牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔）cytb基因序列中保守部分最多的序列，最终确定以猪（x56295）、牛（gu249568.1）、羊（af010406）、马（jf511458.1）、驴（jf718884.1）、鸡（x52392）、鸭（eu755252）、鹅（ay552163.1）、兔（aj001588）的序列进行引物和探针的设计。运用生物软件primer express3.0对检测各物种的荧光定量pcr引物和taqman探针进行设计，同时对primer express 3.0给出的9套引物及探针序列，进行分析比较，并进行适量的调整，以确保其高度的特异性，结果如下： 图1 猪上、下游引物及探针序列比对分析结果图2 牛上、下游引物及探针序列比对分析结果图3 羊上、下游引物及探针序列比对分析结果图4 马上、下游引物及探针序列比对分析结果 图5 驴上、下游引物及探针序列比对分析结果 图6 鸡上、下游引物及探针序列比对分析结果 图7 鸭上、下游引物及探针序列比对分析结果 图8 鹅上、下游引物及探针序列比对分析结果图9 兔上、下游引物及探针序列比对分析结果6.2 pcr扩增参数优化6.2.1 引物对最佳工作浓度为了在特定浓度的上、下游引物获得最强荧光信号和最佳扩增曲线，分别对9对引物的最佳工作浓度进行优化，结果如下示：porcineporcine图10 猪不同浓度引物对扩增曲线 表6 猪不同浓度引物对获得的ct值ct值rp浓度fp浓度50 nm300 nm500 nm900 nm50 nm33.8531.2128.0525.21300 nm27.9918.9317.2716.75500 nm24.9118.8617.2016.79900 nm22.7121.8716.9416.66综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出猪上、下游引物最佳浓度均为900 nm。以下试验以该浓度进行。bovine 图11 牛不同浓度引物对扩增曲线表7 不同浓度引物对获得的ct值ct值rp浓度fp浓度50 nm300 nm500 nm900 nm50 nm31.2330.2230.15300 nm33.8917.2716.9015.15500 nm27.8417.1815.8314.40900 nm26.4516.7513.8913.70虽然上、下游引物900 nm -900 nm浓度引物组合，产生的ct值最小，但扩增后期其曲线有向下趋势，曲线特征不明显。综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出牛上、下游引物最佳浓度均500 nm。以下试验以该浓度进行。sheep图12 羊不同浓度引物对扩增曲线表8 羊不同浓度引物对获得的ct值ct值rp浓度fp浓度50 nm300 nm500 nm900 nm50 nm34.8629.6527.7826.52300 nm29.4218.3218.8918.25500 nm27.1418.5317.5917.48900 nm26.5716.7616.6416.26 综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出羊上、下游引物最佳浓度均为900 nm。以下试验以该浓度进行。horse图13 马不同浓度引物对扩增曲线表9 马不同浓度引物对获得的ct值ct值rp浓度fp浓度50nm300nm500nm900nm50nm34.6929.18300nm25.7423.7623.43500nm23.5119.36porcine18.86900nm22.1317.6917.65综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出马上、下游引物最佳浓度均为900 nm。以下试验以该浓度进行。donkey图14 驴不同浓度引物对扩增曲线表10 驴不同浓度引物对获得的ct值ct值rp浓度fp浓度50 nm300 nm500 nm900 nm50 nm300 nm27.4923.7120.45500 nm21.7120.6819.40900 nm19.6617.8217.29综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出驴上、下游引物最佳浓度均为900 nm。以下试验以该浓度进行。chicken图15 鸡不同浓度引物对扩增曲线表11 鸡不同浓度引物对获得的ct值ct值rp浓度fp浓度50 nm300 nm500 nm900 nm50 nm34.16300 nm21.3820.9018.73500 nm19.6318.2617.84900 nm17.6216.5316.20综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出鸡上、下游引物最佳浓度均为900nm。以下试验以该浓度进行。duck图16 鸭不同浓度引物对扩增曲线表12 鸭不同浓度引物对获得的ct值ct值rp浓度fp浓度50 nm300 nm500 nm900 nm50 nm300 nm27.3019.2818.8121.64500 nm24.7619.4518.5118.44900 nm23.6318.9417.7617.12综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出鸭上、下游引物最佳浓度均为900 nm。以下试验以该浓度进行。goose图17 鹅不同浓度引物对扩增曲线表13 鹅不同浓度引物对获得的ct值ct值rp浓度fp浓度50 nm300 nm500 nm900 nm50 nm30.8430.26300 nm31.4420.0618.5617.11500 nm28.4117.5616.2816.25900 nm26.6516.4415.9815.34综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出鹅上、下游引物最佳浓度均为900nm。以下试验以该浓度进行。rabbit图18 兔不同浓度引物对扩增曲线表14 兔不同浓度引物对获得的ct值ct值rp浓度fp浓度50 nm300 nm500 nm900 nm50 nm-32.1430.26300 nm34.9822.4421.0821.45500 nm31.3819.3618.2017.75900 nm30.8318.8116.6216.24综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出兔上、下游引物最佳浓度均为900nm。以下试验以该浓度进行。6.2.2 探针最佳工作浓度为了使检测体系在已经优化好的引物浓度条件下，在特定浓度探针下，获得最强荧光信号和最佳扩增曲线，分别对9条探针最佳工作浓度进行优化试验，结果如下示：porcine图19 优化引物浓度下猪不同浓度探针扩增曲线表15 优化引物浓度下猪不同浓度探针获得的ct值探针浓度50 nm125 nm200 nm250 nmct值28.8919.7518.7216.66通过扩增曲线和检测结果，可以看出：探针浓度在250 nm时，能产生最好的检测结果。故以下试验以该浓度进行。bovine图20 优化引物浓度下牛不同浓度探针扩增曲线表16 优化引物浓度下牛不同浓度探针获得的ct值探针浓度50 nm125 nm200 nm250 nmct值21.4815.9615.6314.28综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出牛最佳探针浓度为200 nm。以下试验以该浓度进行。sheep图21 优化引物浓度下羊不同浓度探针扩增曲线表17 优化引物浓度下羊不同浓度探针获得的ct值探针浓度50 nm125 nm200 nm250 nmct值27.3520.8418.1416.26综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出羊最佳探针浓度为250 nm。以下试验以该浓度进行。horse图22 优化引物浓度下马不同浓度探针扩增曲线表18 优化引物浓度下马不同浓度探针获得的ct值探针浓度50 nm125 nm200 nm250 nmct值29.6519.5918.7716.64综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出马最佳探针浓度为250 nm。以下试验以该浓度进行。donkey图23 优化引物浓度下驴不同浓度探针扩增曲线表19 优化引物浓度下驴不同浓度探针获得的ct值探针浓度50 nm125 nm200 nm250 nmct值29.8225.6317.3417.26综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出驴最佳探针浓度为250 nm。以下试验以该浓度进行。chicken图24 优化引物浓度下鸡不同浓度探针扩增曲线表20 优化引物浓度下鸡不同浓度探针获得的ct值探针浓度50 nm125 nm200 nm250 nmct值-16.8814.2014.17综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出鸡最佳探针浓度为200 nm。以下试验以该浓度进行。duck图25 优化引物浓度下鸭不同浓度探针扩增曲线表21 优化引物浓度下鸭不同浓度探针获得的ct值探针浓度50 nm125 nm200 nm250 nmct值22.6019.5916.6015.12综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出鸭最佳探针浓度为200 nm。以下试验以该浓度进行。goose图26 优化引物浓度下鹅不同浓度探针扩增曲线表22 优化引物浓度下鹅不同浓度探针获得的ct值探针浓度50 nm125 nm200 nm250 nmct值18.8614.5513.0212.81综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出鹅最佳探针浓度为200 nm。以下试验以该浓度进行。rabbit图27 优化引物浓度下兔不同浓度探针扩增曲线表23 优化引物浓度下兔不同浓度探针获得的ct值探针浓度50 nm125 nm200 nm250 nmct值20.9715.8214.7614.24综合ct值和扩增曲线的完整性，可以得出兔最佳探针浓度为200 nm。以下试验以该浓度进行。6.2.3模板量与ct值线性关系试验以以上确定的最佳浓度引物、探针，按如下浓度梯度对模板dna进行倍比稀释，作为反应模板进行扩增反应，确定各检测体系最适量的模板dna，并确定模板dna浓度范围与ct值线性关系。模板dna梯度浓度：10-3 ng/l、10-2 ng/l、10-1 ng/l、100 ng/l、101 ng/l、102 ng/l。porcine图28 优化引物探针浓度下猪不同浓度模板dna扩增曲线表24 猪lg模板dnact值线性关系 表25 不同浓度猪模板dna ct值模板浓度ct值10-3 ng/l34.1210-2 ng/l31.1210-1 ng/l27.38100 ng/l23.14101 ng/l19.67102 ng/l15.87从扩增曲线和获得的ct值，可以看出当模板dna浓度在102 ng/l至10-3 ng/l间时，模板dna浓度和获得的ct值之间线性关系好（相关系数99.8%），取ct值在15.87和19. 67之间约17时，模板dna浓度约为50 ng/l。bovine图29 优化引物探针浓度下牛不同浓度模板dna扩增曲线表26 牛lg模板dnact值线性关系 表27不同浓度牛模板dna ct值模板浓度ct值10-3 ng/l32.7210-2 ng/l29.6810-1 ng/l26.35100 ng/l23.56101 ng/l19.72102 ng/l16.12从扩增曲线和获得的ct值，可以看出当模板dna浓度在102 ng/l至10-3 ng/l间时，模板dna浓度和获得的ct值之间线性关系好（相关系数99.7%），当ct值在17左右时，模板dna浓度为30 ng/l。sheep图30 优化引物探针浓度下羊不同浓度模板dna扩增曲线表28 羊lg模板dnact值线性关系 表29不同浓度羊模板dna ct值模板浓度ct值10-3 ng/l33.2110-2 ng/l30.2110-1 ng/l26.31100 ng/l21.52101 ng/l17.68102 ng/l15.16从扩增曲线和获得的ct值，可以看出当模板dna浓度在102 ng/l至10-3 ng/l间时，模板dna浓度和获得的ct值之间线性关系好（相关系数99.3%），取ct值约17时，模板dna浓度约为20 ng/l。horse 图31 优化引物探针浓度下马不同浓度模板dna扩增曲线 表30 马lg模板dnact值线性关系 表31不同浓度马模板dna ct值模板浓度ct值10-3 ng/l34.0210-2 ng/l30.0210-1 ng/l26.85100 ng/l23.13101 ng/l18.72102 ng/l14.73从扩增曲线和获得的ct值，可以看出当模板dna浓度在102 ng/l至10-3 ng/l间时，模板dna浓度和获得的ct值之间线性关系好（相关系数99.7%），ct值约17时，模板dna浓度约为50 ng/l。donkey 图32 优化引物探针浓度下驴不同浓度模板dna扩增曲线表32 驴lg模板dnact值线性关系 表33不同浓度驴模板dna ct模板浓度ct值10-3 ng/l32.1310-2 ng/l28.4610-1 ng/l24.57100 ng/l19.48101 ng/l16.18102 ng/l12.29从扩增曲线和获得的ct值，可以看出当模板dna浓度在102 ng/l至10-3 ng/l间时，模板dna浓度与ct值之间线性关系良好（相关系数99.7%），ct值约17时，模板dna浓度约为10 ng/l。chicken图33 优化引物探针浓度下鸡不同浓度模板dna扩增曲线表34 鸡lg模板dnact值线性关系 表35不同浓度鸡模板dna ct值模板浓度ct值10-3 ng/l31.4210-2 ng/l29.2110-1 ng/l24.53100 ng/l21.29101 ng/l17.32102 ng/l14.57从扩增曲线和获得的ct值，可以看出当模板dna浓度在102 ng/l至10-3 ng/l间时，模板dna浓度与ct值之间线性关系良好（相关系数99.3%），ct值在17左右时，模板dna浓度为10 ng/l。duck图34 优化引物探针浓度下鸭不同浓度模板dna扩增曲线表36 鸭lg模板dnact值线性关系 表37不同浓度鸭模板dna ct值模板浓度ct值10-3 ng/l31.5710-2 ng/l28.3710-1 ng/l25.18100 ng/l20.75101 ng/l17.52102 ng/l14.48从扩增曲线和获得的ct值，可以看出当模板dna浓度在102 ng/l至10-3 ng/l间时，模板dna浓度和获得的ct值之间线性关系良好（相关系数99.7%），当ct值在17左右时，模板dna浓度为10 ng/l。goose图34 优化引物探针浓度下鹅不同浓度模板dna扩增曲线表38 鹅lg模板dnact值线性关系 表39不同浓度鹅模板dna ct值模板浓度ct值10-3 ng/l32.7810-2 ng/l29.4110-1 ng/l25.35100 ng/l20.75101 ng/l17.54102 ng/l14.27从扩增曲线和获得的ct值，可以看出当模板dna浓度在102 ng/l至10-3 ng/l间时，模板dna浓度和获得的ct值之间线性关系良好（相关系数99.6%），当ct值在17左右时，模板dna浓度为20 ng/l。rabbit图34 优化引物探针浓度下兔不同浓度模板dna扩增曲线表40 兔lg模板dnact值线性关系 表41不同浓度兔模板dna ct值模板浓度ct值10-3 ng/l33.9810-2 ng/l31.2810-1 ng/l28.69100 ng/l25.03101 ng/l21.24102 ng/l17.12 从扩增曲线和获得的ct值，可以看出当模板dna浓度在102 ng/l至10-3 ng/l间时，模板dna浓度和获得的ct值之间线性关系良好（相关系数99.1%），当ct值在17左右时，模板dna浓度为100 ng/l。6.3特异性与灵敏度试验分别以建立起的猪、牛、羊、马、驴、鸡、鸭、鹅、兔检测体系，以9种动物基因组dna为检测模板，确认各检测体系的特异性和灵敏度等方法参数。按照6.2.3确定的模板dna量进行本部分试验，扩增曲线如下示，相关检测值总结于表42：porcine图35 猪源性检测体系特异性试验扩增曲线bovine图36 牛源性检测体系特异性试验扩增曲线sheep图37 羊源性检测体系特异性试验扩增曲线horse图38 马源性检测体系特异性试验扩增曲线donkey图39 驴源性检测体系特异性试验扩增曲线chicken图40 鸡源性检测体系特异性试验扩增曲线duck图41 鸭源性检测体系特异性试验扩增曲线goose图42 鹅源性检测体系特异性试验扩增曲线rabbit图43 兔源性检测体系特异性试验扩增曲线表42 检测反应特异性和灵敏性检测体系模板对象ct值附加循环数交叉反应性理论混样检测限理论核酸水平检测下限猪(50 ng/l)猪17.45-100.0判定阈值：35灵敏度：0.00050.0003 ng/l牛-羊-马-驴-鸡-鸭-鹅-兔-牛(30 ng/l)猪-判定阈值：35灵敏度：0.00030.00008ng/l牛16.48-100.0羊-马-驴-鸡-鸭-鹅-兔-羊(20 ng/l)猪-判定阈值：