【优秀毕业论文】4号染色体上四个snp位点与高度近视的关联性分析.pdf

青岛大学 硕士学位论文 4号染色体上四个snp位点与高度近视的关联性分析 姓名 郝文文 申请学位级别 硕士 专业 眼科学 指导教师 孔庆兰 20110527 4 号染色体上四个8 n p 位点与高度近视的关联性分析 摘要 目的探讨位于人类第4 号染色体上的四个s n p 位点 r s 9 4 1 2 6 5 r s 4 6 9 7 4 8 9 r s l 0 3 5 7 1 2 和r s 7 6 6 8 1 1 8 与中国汉族人群高度近视易感性之间的关系 方法应用全基因组关联分析的方法对位于4 号染色体上的s n p 位点进行筛 选 采用微测序法 也称引物延伸法 s n a p s h o t 法 对中国汉族5 0 6 例高度近视和 9 9 1 例正常人的四个s n p 位点 r s 9 4 1 2 6 5 r s 4 6 9 7 4 8 9 r s l 0 3 5 7 1 2 和r s 7 6 6 8 1 1 8 进行 基因分型验证 结果4 号染色体上的s n p 位点 r s 9 4 1 2 6 5 r s 4 6 9 7 4 8 9 r s l 0 3 5 7 1 2 和r s 7 6 6 8 1 1 8 的基因型均符合h a r d y w e i n b e r g 平衡 p o 0 5 本研究资料具有群体代表性 4 个 s n p 位点中r s l 0 3 5 7 1 2 和r s 7 6 6 8 11 8 基因型及等位基因频率在高度近视组和对照组间 无统计学意义 p o 0 5 r s 9 4 1 2 6 5 r s 4 6 9 7 4 8 9 位点的基因型频率和等位基因频率 在高度近视组和对照组间的差别具有统计学意义 p 0 0 0 0 3 3 p 0 0 0 4 8 r s 9 4 1 2 6 和r s 4 6 9 7 4 8 9 位于c c d c l 4 9 基因区域 单倍体分析显示 卢1 5 6 9 p 0 0 0 0 0 7 5 高度 近视病人中单倍体型 h 1 t c 显著高于正常对照组 结论c c d c l 4 9 基因与中国汉族人群高度近视显著相关连 硕士研究生郝文文 眼科学 指导教师孔庆兰教授 关键词 高度近视 c c d c l 4 9 基因 全基因组关联分析 单核苷酸多态 性 a s t u d y o nt h ea s s o c i a t i o no ff o u r s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s s n p i nc h r o m o s o m e 4w i t hh i g hm y o p i a a b s t r a c t o b j e c t i v e t o i n v e s t i g a t e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h e s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m si nc h o m o s o m e4 r s 9 4 1 2 6 5 r s 4 6 9 7 4 8 9 r s l 0 3 5 7 1 2a n dr s 7 6 6 8 1 1 8 a n d h i g hm y o p i ai l lc h i n e s eh a np o p u l a t i o n m e t h o do e n o m e w i d ea s s o c i a t i o na n a l y s i sm e t h o di su s e dt os e l e c t t h es i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o 删s m si ne h r o m o s o m e4 u s i n gt h em i c r o s e q u e n c i n g p r i m e r e x t e n s i o n s n a p s h o o t o g e n o t y p e f o u r s n p r s 9 4 1 2 6 5 r s 4 6 9 7 4 8 9 r s l 0 3 5 7 1 2 a n d r s 7 6 6 8118 o fc h i n e s eh a r tp o p u l a t i o n5 0 6h i g hm y o p i ac a s e sa n d9 91c o n t r o l s r e s u l t g e n o t y p e so fs n p r s 9 4 1 2 6 5 r s 4 6 9 7 4 8 9 r s l 0 3 5 7 1 2 r s 7 6 6 8 11 8 i n c k o m o s o m e4a c c o r dw i t hh a r d y w e i n b e r gb a l a n c e p 0 0 5 t h i sr e s e a r c hm a t e r i a lh a s t h eg r o u pr e p r e s e n t a t i v e g e n o t y p ef r e q u e n c ya n da l l e l ef r e q u e n c yi 1 1h i g l lm y o p i aa n d c o n t r o lh a v en os t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si nr s l 0 3 5 7 1 2 r s 7 6 6 8 1 1 8 p 0 0 5 b u t h a v es t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s i nr s 9 4 1 2 6 5 r s 4 6 9 7 4 8 9 p 0 0 0 0 3 3 p 0 0 0 4 8 r s 9 4 1 2 6 5a n dr s 4 6 9 7 4 8 9b o t hl o c a t ei nc c d c l 4 9g e n eb l o c k h i g hm y o p i ap m i e n t s h a p l o i dt y p e hi t c w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fc o n t r 0 1 c o n c l u s i o nc c d c l 4 9g e n eh a v es i g n i f i c a n ta s s o c i a t i o nh i 曲m y o p i ai nc h i n e s eh a n e t h n i c i t y p o s t g r a d u a t es t u d e n t h a ow e n w e n o p h t h a l m o l o g y d i r e c t e db yp r o f e s s o r k o n gq i n g l a n k e yw o r d s h i g hm y o p i a c c d c l 4 9g e n e g e n o m e w i d ea s s o c i a t i o ns t u d i e s s i n o e n u c l e o t i d ep o i y m o r p m s m 中英文缩略词表 英文缩写 英文全称中文全称 c c d c l 4 9c o i l e d c o i ld o m a i nc o n t a i n i n g14 9c c d c l 4 9 b p b a s ep a i r s碱基对 d n t p d e o x y f i b o n u c l e o s i d et n p h o s p h a t e 三磷酸脱氧核苷 c h r c h r o m o s o m e染色体 d n a d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 e d t a e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e x ole o n u c i e a s ei 核酸外切酶一1 g g r a m 克 g w a sg e n o m e w i d ea s s o c i a t i o ns t u d y全基因扫描关联分析 h a p m a ph a p l o t y p em a p 人类基因组单体型图 h w e h a r d y w e i n b e r ge q u i l i b r i u mh a r d w ej n b e r g 平衡 l d l i n k a g ed i s e q u i l i b r i u m 连锁不平衡 i u i n t e m a t i o n a iu n i t单位 m gm i l l i g r a m 毫克 m im u l i l i t e r 毫升 m i nm i n u t e 分钟 m am i n o ra l l e l e 次等位基因 n a c is o d i u mc h l o r i d e氯化钠 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链反应 p h p o w e ro fh y d r o g e n 酸碱度 p p r o b a b i l i t y 概率 巾m r o u n dp e rm i n u t e 每分钟转数 ss e c o n d秒 s n p s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m 单核苷酸多态性 s d ss o d i u md o d e c y is u f f a t e 十二烷基硫酸钠 u u n i t单位 v v o l t a g e 伏特 t r i s t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 引言 引言 高度近视 我们又称恶性近视或病理性近视 是指屈光度数大于 6 0d 并且伴 有眼轴的增长和眼基质的如下改变 色素上皮变薄 豹纹状眼底 视网膜脉络膜萎 缩 f u c h 斑 颞侧弧形斑 漆裂纹等 其视力表现为进行性的降低 可能伴随弱视 白内障 青光眼 玻璃体混浊 以及视网膜脱离等众多并发症 是目前人类致盲眼 病的重要原因之一 1 据统计美国人口中有2 7 至1 j3 3 的近视患者 其致盲率已经 达到1 7 到2 o 2 3 1 高度近视在亚洲人中更加普遍 4 5 一 据日本学者报道 病理 性或高度近视在近视的人群中发病率已高达6 1 8 在整个人群中发病率也达到 1 2 4 1 我国学生近视发病率2 0 0 6 年调查显示为5 0 6 0 其仅次于新加坡 居 世界第2 位 其中学生近视人数居世界首位 7 不同国家的不同发病率说明高度近 视有地域性环境差异 但要强调的是在很多国家近视的发病都占有很大比例 因此 研究高度近视的发病机理 从源头上进行防治意义重大 高度近视的发病机制研究涉及种族遗传因素 环境因素 并包括眼球的解剖 生理 血液供应 营养供给以及植物神经系统 内分泌系统 免疫系统等等 但是 仍然以环境与遗传因素为主要机制 8 1 众所周知在决定个体表型方面 基因起决定 性的作用 它通过赋予机体对某些疾病的易感性或者抵抗力 以及通过影响个体与 环境的相互作用 从而对疾病的发生起到直接或者间接的作用 因此 我们希望辨 别疾病相关的基因 以期实现人们对疾病基因的诊断防治 流行病学调查中已体现 遗传因素在近视眼中的作用 与单纯性的低度近视相比 遗传因素对于病理性近视 起到更明显作用 9 近视眼存在明显的家族聚集性 如果父母均为近视眼 那么其 后代极有可能罹患近视 其近视发生率是那些父母均无近视的3 倍之岁1 0 同胞之 间单纯性近视的患病为1 5 而病理性近视眼的患病相对危险度为2 0 2 7 5 l 这说 明病理性近视眼 遗传因素起着极大的作用 然而 部分病理性近视患者不存在家 族性的遗传背景 相关文献报道了有3 6 4 0 的高度近视h i 曼j l 童 并没发现其父母 存在屈光不i t t 1 2 1 4 随着进一步深入对近视遗传学的研究 国内外学者应用候选基因筛查 连锁分 析 全基因组扫描等基因技术对近视进行候选基因的克隆筛查与基因定位 m y p l x q 2 8 1 7 1 m y p 2 1 8 p 1 1 3 1 t 1 6 8 m y p 3 1 2 q 2 1 3 1 1 9 却 m y p 4 7 q 3 6 t 2 1 i m y p 5 1 7 q 2 1 q 2 2 l 1 1 j m y p 6 2 2 q 1 2 m y p 7 1l p l 3 m y p 8 3 q 6 m y p 9 4 q 1 2 m y p l 0 8 p 2 3 m y p 1 1 4 q 2 2 q 2 t 1 7 i m y p l 2 2 q 3 7 1 t 2 1 i m y p l 3 x q 2 3 t 2 2 m y p l 4 1 p 3 6 t 2 3 i m y p l 5 1 0 q 2 1 1 t 2 4 青岛大学硕士学位论文 m y p l 6 5 p 1 5 t 2 5 洳 2 2 q 1 2 3 1 6 是目前已经发现的高度近视位点 很多位于x 染色体的基因点以及位于常染色体的基因位点例如 4 q 2 2 q 2 8 8 q 2 2 2 1 0 q 2 2 1 1 q 2 3 1 3 q 2 2 1 4 q 3 2 1 7 q 末端 均影响高度近视的发生发展 1 1 6 此外 很多位于x 染色体的基因突变都与视觉的疾病有关 如伴随高度近视的 色觉干扰 2 1 1 目前发现与高度近视相关的遗传综合症有1 5 0 多州2 2 1 全基因组关联分析 g w a s 是寻找某种基因变异和个体表型之间关系的一种 方法 人类的第4 号染色体携带了不少与高度近视相关的基因 如m y p 9 4 q 1 2 m y p l l 4 q 2 2 一q 2 1 7 1 4 q 2 2 q 2 8 1 6 1 4 q 2 2 q 2 7 2 7 1 另外 高度近视涉及眼底病理性改 变视网膜色素变性 与视网膜色素变性致病基因有资料表明位于4 号染色体 并且 约有5 0 的视网膜色素变性病例伴发高度或变性近视 2 8 1 有文献报道患视网膜营养 不良的病人更加容易罹患近视疾病 2 9 1 有资料显示锥体杆体营养不1 曼 c o n e r o d d y s t r o p h y c o r d 基因p r o m l 位于4 p 1 5 3 2 可能与c o r d 和高度近视的发生密 切相关 3 0 1 基因c c d c l 4 9 位于人类第4 号染色体 它是否与近视眼底病变发病有 关 c c d c l 4 9 基因是否是高度近视的易感基因 本研究应用全基因组关联分析的方 法 对c c d c l 4 9 基因多态位点筛选 采用微测序法 也称引物延伸法 s n a p s h o t 法 对5 0 6 例高度近视进行s n p 位点的基因分型 认为基因c c d c l 4 9 与高度近视易感 性之间有关联 2 第一章简介 1 1 单核苷酸多态性简介 第一章 世界各国的人有9 9 的d n a 序列是相同的 只有那才是最重点的 正是这些 1 的差异决定了某个人的个性 其是否易患上某种疾病 同时决定这个人的其它性 状 单核苷酸多态性s n p s i n g l en u c l c o t i d ep o l y m o r p h i s m s n p 发音为 s n i p s 是指基因组水平上 因单个核苷酸的变异造成的d n a 序列的多态性 其占所有己知 多态性的9 0 以上 位于外显子区的s n p 可能使蛋白质的表达受影响 位于内 含子区的s n p 可能使剪接结果受影响 位于启动子区的s n p 就有可能直接使核 基因的表达水平受影响 第三代多态性标记是s n p 其具有数量最多并且容易批量 检测的自身特点 这些特性都决定了对s n p 的研究将有助于解释个体表型的差异 不同群体与个体对环境因子的反应差异 以及某种疾病对不同种类药物的耐受性差 异 尤其是某些复杂的疾病 比如病理性近视等 的易感性差异 国际人类基因组单体型图计 i n t e r n a t i o n a lh a p m a pp r o j e c t 是第一个国际上试 图发现这些个体差异的大规模科研项目 目前该项目共发现3 5 0 多万个s n p 突变位 点 2 0 0 8 年 伴随d n a 测序技术的迅猛发展 位于美国马里兰州贝塞斯塔 b e t h e s d a m a r y l a n d 的美国国立人类基因组研究院 n a t i o n a lh u m a ng e n o m e r e s e a r c hi n s t i t u t e 以及位于英国h i n x t o n 的维亚康姆基金桑格研究所 w e l l c o m et r u s ts a n g e ri n s t i t u t e 同位于中国深圳的华大基因研究所 b g ii ns h e n z h e n c h i n a 共同参与了命名为千 人基因组的项目t 3 1 该项目致力于发现位于人类基因组中的频率超过1 的所有s n p 突变信息以及其他的突变情况 千人基因组研究项目共计发现了2 万个其它类型的 结构突变 1 0 0 万个小插入或缺失突变 以及1 5 0 0 万个s n p 位点 其中包括8 5 0 万个新发现的s n p 位点 充分利用这些s n p 信息 遗传学家们展开了全基因组关 联研究 g e n o m e w i d e a s s o c i a t i o ns t u d i e s g w a s 3 青岛大学硕士学位论文 图1 公共s n p 数据库中历年来的数据增长情况一览图 公共s n p 数据库自干人基因组计划开展以来 其收录的s n p 位点数目急剧增加 图1 本实验研究对5 0 6 例高度近视患者进行s n p 位点的基因分型采用引物延伸法即 微测序法 简称s n a p s h o t 法 s n a p s h o t 法的基因原理如下 第一步p c r 扩增一段 含有s n p 位点的d n a 片段 第二步将一种进行微测序的引物加入到扩增产物中 上机行单碱基延伸反应 简称s b e 图2 s n a p s h o t 反应引物3 末端的碱基是紧 挨着多态性碱基的 同时加入d n a 聚合酶 d d n t p 模板d n a 上的被检测位点处 的核苷三磷酸与d d n t p 存在互补的情况发生延伸反应 进行一个多态性碱基的延伸 反应体系中的d d n t p 是含有荧光标记的 不同的荧光颜色代表不同的碱基 绿色 黑色 蓝色 红色分别表示碱基a c g t 毛细管跑凝胶电泳能够检测到不同 的荧光颜色信号 程序通过不同荧光颜色显示检测结果 最终得到被检测的s n p 位 点处碱基的类型 该方法具有一次性高通量快速的特点 可以对多个s n p 位点进行 高效率的基因分型 4 第一章简介 n p l w os n p s n p 酝qs n p 4 眩 i 图2 s n a p s h o t 试剂盒s b e 反应 单碱基延伸法 s b e 法已应用于芯片技术中 3 3 s b e 具有如下特点 高度的自动 化 易建立标准化的操作 极大的通量 快速 高灵敏度和强敏感性 作为一种s n p 分型的方法 与其它方法相比 s b e 的上述特点决定了其适用于进行大规模s n p 的 研究和分子水平的诊断 本实验试图运用s b e 对汉族人类第4 号染色体上四个位点 r s 9 4 1 2 6 5 r s 4 6 9 7 4 8 9 r s l 0 3 5 7 1 2 和r s 7 6 6 8 1 1 8 单核苷酸多态性进行研究 以探 讨这些多态性与高度近视易感性之间的关联 1 2 全基因组关联分析 g w a s 方法简介 全基因组关联分析 g w a s 是一种用来寻找某种基因的变异 从而探讨其与表 型之间关系的方法 人们研究表型 特别是研究种群中的个体是否易患某种疾病 再从不计其数的s n p 中寻找同其表型相关的基因型 假如能确认这些s n p 与其表 型之间具有统计学意义上的关系 就能够初步断定这些s n p 是与该表型相关的基因 型 之后需要再证实上述发现是否正确 这就要求进行另一个种群的验证试验 3 2 1 以上是g w a s 的两阶段分析法 1 3c c d c l4 9 基因简介 人类的第4 号染色体是医学界长期关注的重要染色体 它携带了不少与高度近 视相关的基因 如m y p 9 4 q 1 2 m y p l l 4 q 2 2 q 2 1 7 1 4 q 2 2 q 2 8 1 1 6 4 q 2 2 q 2 7 t 2 7 1 5 青岛大学硕士学位论文 另外 高度近视涉及眼底的病理性改变 如视网膜色素变性 与视网膜色素变性致 病基因有资料表明位于4 号染色体 并且约有5 0 的视网膜色素变性病例伴发高度 或变性近视 2 8 1 病理性近视眼的标准f e r g 的特征说明视网膜光感受器层和视网膜 内层有不同程度的损掣3 4 1 有文献报道视网膜营养不良的病人更易罹患近视 2 9 1 锥 体杆体营养不良 c o n e r o dd y s t r o p h y c o r d 基因p r o m l 位于4 p 1 5 3 2 可能与 c o r d 和高度近视的发生有关 3 0 基因c c d c l 4 9 c o i l e d c o i ld o m a i nc o n t a i n i n g1 4 9 别名f l l l 3 4 1 0 d k f z l d l 7 6 1 8 1 0 7 位于4 p 1 5 2 也位于人类第4 号染色体 图3 它 是否与近视眼底病变发病有关 c c d c l 4 9 基因是否是病理性近视的易感基因 这些 都是值得研究的问题 i d e o g r a n 4 q 2 8 鞫鬻 4 q 3 s 图3c c d c l 4 9 基因位置 6 6 32l 3 l l 1 li 2 p 5暑p q ll p p p 牛 一 第二章实验研究 2 1 研究对象 第二章实验研究 本研究经医院伦理委员会批准 全部调查和取样均严格遵守 赫尔辛基宣言 并且均征得受试者同意 签署知情同意书 病例组与对照组按照年龄和地域分布进 行配比 均来自无亲缘关系的汉族人群 眼部检查 所有受试者均接受一整套完整的眼部检查 1 以国际标准e 视力表测量未矫正视力以及最佳矫正视力 2 裂隙灯检查眼前节 3 以g o l d m a n 压平眼压计测量眼压 4 散瞳检查眼底 5 验光 对于者年龄 1 3 岁 采用复方托品酰胺眼液 6 a 超声测量眼轴 高度近视组 收集医院眼科2 0 0 6 年3 月至2 0 0 9 年5 月期间门诊及住院患者高 度近视患者5 0 6 例 高度近视的诊断标准 1 近视屈光度 成人 6 0 d 儿童 5 0 d 2 近视进展 近视度数呈现进行性增长 进展速度快 成年以后变化慢或者 呈相对静止状态 3 除外非轴性的高度近视 进行裂隙灯和角膜屈率及晶体厚度检查 7 青岛大学硕士学位论文 4 病理性的眼底改变 近视弧形斑 豹纹状眼底 后巩膜葡萄肿 黄斑部病 变等 本实验病例组以近视屈光度为界定高度近视的入选标准 故某些患者也可以没 有特征性的眼底改变 5 有一眼确诊为高度近视即诊断为高度近视患者入选 6 不伴有全身综合征 排除多种全身疾病和眼科疾病并发的病理性近视 排 除有幼年时长时间高热患病史或者存在显著眼外伤的患者 7 眼轴 2 6 m m 正常对照组 9 9 1 例 排除近视病史本地区城市社区健康体检者 其中男4 4 5 名 女5 4 6 名 平均年龄为4 7 6 1 1 2 3 4 岁 统计学显示两组性别 年龄差异无显著 性 入选病例及对照基本信息 表1 塞 厶选痘趔丞盟题薹奎篮皇蠢 瘟倒堡 墅题缉 例数 5 0 69 9 1 性别比 女2 7 1 5 3 6 5 4 6 5 5 1 男2 3 5 4 6 4 4 4 5 4 4 9 9 6 平均年龄3 6 3 5 士1 4 5 74 7 6 1 士1 2 3 4 屈光度 d 右眼1 0 2 6 4 2 7 左眼1 0 8 6 4 1 l 眼轴 n u n 右眼2 7 1 3 1 5 8 左眼2 7 3 4 1 8 7 2 1 1 血样和资料的采集 实验对象均早上抽血1 0 m l 5 m l 用于d n a 提取基因分析 5 m l 用于指标检测 完善的临床信息 涉及如下信息 入院时间 住院号 姓名 性别 年龄 民族 诊断 家族史等 数据整理后输入计算机存档 8 第二章实验研究 2 2 材料 2 2 1 主要的仪器与设备 b i o r a ds m a r t s p e c 饿p l u ss p e c t r o p h o t o m e t e r 美国b i o r a d 公司 b e c k m a nc o m l t e r 聊m i e r o f u g er18e e n t r i g u e美国贝克曼公司 稳压稳流电泳仪美国b i o r a d 公司 a l l e g r a r m 5 r 普通平板离心机美国b e c k m a n 公司 离心机美国b e c k m a n 公司 p c r 扩增仪美国b i o r a d 公司 制冰机 恒温水浴箱 微型漩涡振荡器 电子石英钟 微波炉 电子分析天平 电热恒温鼓风干燥箱 高压灭菌仪 紫外分光光度仪 l o l l8 道排枪 1 0 2 0 1 0 0 2 0 0 1 0 0 0 1 t l 移液枪 4 c 2 0 4 0 c 冰箱 b i o r a d 凝胶成像仪 9 日本s a n y o 公司 中国新康医疗器械有限公司 上海沪西分析仪器厂有限公司 中国康健公司 l g 公司 美国制造 中国制造 日本y a m a t o 制造 美国b i o r a d 公司 美国g e n e m a t e 公司 德国吉尔森公司 澳柯玛公司 美国b i o r a d 公司 青岛大学硕士学位论文 b d 采血空针 b d 真空采血管 e d t a 抗凝 普通水平式电泳槽 w h 3 微型漩涡混合仪 313 0 x l a v a n tg e n e t i ca n a l y z e r 2 3 主要的试剂和耗材 2 3 1 主要试剂的配置 江苏医疗器械有限公司 江苏医疗器械有限公司 美国制造 上海泸西分析仪器厂 美国a b i 公司 1 r b c 裂解液 分别用电子称准确称取1 0 9 碳酸氢钾 k h c 0 3 8 3 9 氯化铵 n h 4 c i 0 0 3 7 9 乙二胺四乙酸二钠 e d t a n a 2 将上述物质小心的放于容量为1l 烧杯中 之后添 加灭菌水进行定容至1l 直到它们充分的溶解 放入4 c 冰箱进行保存待用 2 w b c 裂解液 电子秤准确称取1 2 1 1 9 的三羟甲基氨基甲烷 t n s 1 1 6 9 9 的氯化钠 n a c i 0 5 8 9 的乙二胺四乙酸 e d t a 用量筒量取4 2 m l 的浓盐酸 浓h c i 上述物质 小心放于容量为1l 的烧杯中 再加入3 0 0 m l 的灭菌水 最后电子秤称取2 0 9 的十二 烷基硫酸钠 s d s 将上述物质统统放入容量为1 l 的烧瓶中 添加灭菌水定容到 1l 放入6 5 的水浴箱进行孵育 使其充分溶解 最后分装入5 0 0 m l 灭菌瓶 做 好标记后放入4 4 c 冰箱保存待用 3 蛋白酶k p k 酶 将1 9 的p k 酶加入1 0 0 m l 的无菌去离子水的烧杯中进行充分的溶解以后 放 入 2 0 冰箱保存待用 4 蛋白溶解液 饱和n a c i 电子秤准确称取3 6 9 的氯化钠 n a c i 溶解于1 0 0 m l 灭菌水中 进行充分的 溶解以后 直到n a c i 饱和析出结晶 放入4 0 c 冰箱保存待用 5 7 0 的乙醇 量筒准确量取无水乙醇3 5 0 m l 放入容量为5 0 0 m l 的量杯内 添加灭菌水进行定 容到总容量为5 0 0 m l 进行充分的溶解以后 放入4 c 冰箱保存待用 l o 第二章实验研究 6 5 0 x t a e 的缓冲液 电子秤准确称取t n s 2 4 2 9 和n a 2 e d t a 2 h 2 0 3 7 2 9 将上述物质小心的放入容 量为1 l 烧杯内 添加约为8 0 0 m l 的去离子水到烧杯内 搅拌和溶解充分以后 再 添加入醋酸5 7 1m l 搅拌和溶解充分之后 最后添加入去离子水使得溶液定容到总 容量为1 l 在常温下保存待用 7 1 x t a e 的电泳缓冲液 量筒准确量取2 0 m l 的5 0 x t a e 缓冲液后倒入容量为1l 的烧瓶内 再添加入去 离子水 最后使溶液定容到总容量为1l 搅拌和溶解充分之后 在常温下保存待用 8 1 的琼脂糖凝胶 电子秤准确的称量粉末状琼脂糖l g 小心的添加到烧杯内 添入上述配好待用 的1x t a e 的电泳缓冲液1 0 0 m l 进行搅拌混匀之后 放入微波炉内高火加温5 m i n 使 得溶解混合充分 自来水降温到5 0o c 6 0 0 c 小心添加2 p l 的 浓度为1 0 m g m 1 e b 缓冲液 使之混匀充分后 倒入事先准备好的胶槽内 常温放大约4 0 分钟后 上述 溶液凝固 待用 g l0 的e x o l 酶 试剂e x o l 酶 f a s t a p1 0 x b u f f e r d dh 2 0 体积比为1 1 8 的混合与消毒后 的e p 管中 注意 要求在冰上进行上述混合液的配置避免酶的失活 2 3 2 主要的试剂和耗材 碳酸氢钾 氯化铵 浓盐酸 十二烷基硫酸钠 氯化钠 三羟甲基氨基甲烷 t d s 碱 乙二胺四乙酸 e d t a 乙二胺四乙酸二钠 蛋白酶k 无菌蒸馏水 异丙醇 无水乙醇 t i p 吸头 i e x o n u c l e a s e1 e p p e n d o d 管 2 x t a qm a s t e rm i x 含染料 10 x b u f f e r 缓冲液 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 成都市科龙化工试剂厂 日本t a k a r a 大连宝生物公司 科利药业有限公司 成都市科龙化工试剂厂 西陇华工有限公司 中国江苏海门市三和玻璃仪器厂e x o n e we n g l a n db i o l a b s b e i j i n g l t d 中国江苏苏州市三和玻璃仪器厂 北京康为世纪科技公司 日本t a k a r a 大连宝生物公司 青岛大学硕士学位论文 d d n t p t a qd n a 聚合酶 9 6 孔普通上机板 9 6 孔普通p c r 板 琼脂糖 e b f a s ta p t m b u f f e rf a s ta p 6 x l o a d i n gb u f f e r g e n e s c a n t m l i z t ms i z es t a n d a r d h i d i t m f o r m a m i d e 毛细管液体胶 3 13 0 x l 遗传分析缓冲液 b i gd y e 测序试剂盒 2 5 m m m 9 2 g e l e x t r a c t i o nk i t d m 2 0 0 0d n am a r k e r s n a ps h o tm u l t i p l e x 反应液 r n a s e f r e ew a t e r 2 4 全血d n a 的提取 2 4 1 全血d n a 提取 日本t a k a r a 大连宝生物公司 日本t a k a r a 大连宝生物公司 中国制造 中国江苏海门市三和雪平玻璃仪器厂 中国上海h i g h t e c hp a r k 公司 中国上海h i g h t e c hp a r k 公司 m b if e m l e n t a s m 引f e r m e n t a s 中国上海h i g h t e c hp a r k 公司 美国a b i 公司 美国a b i 公司 美国a b i 公司 美国a b i 公司 美国a b i 公司 日本t a k a r a 大连宝生物公司 美国b i o t e k 公司 北京康为世纪科技有限公司 w a r d n g t o n u k 北京康为世纪科技有限公司 具体步骤 1 微波炉消毒1 5 m l 和4 m l 的带盖e p 管以及2 m l 的巴氏吸管 2 将全血约5 m l 加入15 m i e p 管中 加红细胞裂解液至15 m l 盖盖子 轻轻 倒转1 m i n 约6 7 次 放入4 冰箱倒置3 0 m i n 3 4 c 3 5 0 0 巾m g 离心 1 5 m n 弃上清 4 再加入红细胞裂解液至7 m l 盖盖子 用微型漩涡振荡器将团块振荡分散 至e p 管底无附着物为止 4 3 5 0 0 币m g 离心 15 m i n 弃上清 盖盖子 5 用微型漩涡振荡器将白细胞团块振荡分散 至e p 管底无附着物 于每个e p 1 2 第二章实验研究 管内加入4 m l 混合液 即白细胞裂解液与蛋白酶k 的混合液 配制比例为白细胞裂 解液 1 0 m g m l 蛋白酶k 1 0 0 1 微型漩涡振荡器振荡5 s 放入6 5 恒温水浴箱 孵育6 0 m i n 孵育期间 每间隔2 0 m i n 振荡器振荡5 s 6 于恒温水浴箱中取出e p 管 冷却到常温后 加入2 m l 蛋白溶解液 盖盖子 振荡混匀至牛奶状 4 0 3 5 0 0 r p m g 离心 2 0 2 5 m i r a 7 用2 m l 的巴氏吸管吸取上清 至新的1 5 m l 的e p 管中 并加入4 m l 异丙醇 盖盖子 上下摇晃5 6 次 至有絮状沉淀出现 3 5 0 0 r p m g 离心 1 5 m i n 可见白 色沉淀贴附于e p 管底 弃上清 8 加入7 5 乙醇2 m l 盖盖子 微型漩涡振荡器振荡e p 管 将e p 管底部白 色沉淀振荡分散 充分溶于7 5 乙醇中 3 5 0 0 r p m g 离心 15 m i n 弃上清 g 将尖底e p 管倒扣于吸水纸上 室温晾干约2 3 h 注意不能过度干燥 不然 d n a 难以溶解 待e p 管内乙醇挥发干 1 0 加d dh 2 0 3 0 0 p l 溶解 4 保存 3 6 h 1 1 将1 5 m i e p 管内d n a 分装于4 m i e p 管内 8 0 保存 2 4 2 检测d n a 浓度 每一份样本d n a 取l p l 加入9 9 p l 的d d h 2 0 稀释 全血d n a 浓度以及 o d 2 8 0 o d 2 6 0 应用紫外分光光度仪来测定 以o d 2 8 0 o d 2 6 0 在1 8 2 0 表明d n a 浓度纯 蛋白质污染低 2 4 3 制做模板d n ap a n ei 1 定量上述实验提取的d n a 样本之后 加入灭菌水稀释到浓度为5 8 n g ul 平均分配到p c r 板 9 6 孔 2 用胶带和灭菌的铝箔对p c r 板进行封存 同时备注样本相关信息 3 将上述封存好的样本放入冷冻离心机进行离心处理3 5 0 0 转速1 0r a i n 2 5 统计学分析 所有的数据资料均录入计算机 整理为一个专门数据库 筛查并排除不明诊断 的病人 s p s s1 7 0 软件分析病例组与对照组数据 t 检验计算年龄 z 2 检验计算 等位基因型频率与基因型 p 0 0 5 研究资料具有群体代表性 4 个s n p 位点中r s l 0 3 5 7 1 2 和 r s 7 6 6 8 1 1 8 基因型及等位基因频率在高度近视组和对照组间差别无统计学意义p 0 0 5 r s 9 4 1 2 6 5 r s 4 6 9 7 4 8 9 位点的基因型频率 和等位基因频率在高度近视组和对照组问的差别具有统计学意义 p 0 0 0 0 3 3 产o 0 0 4 8 见表4 1 9 青岛大学硕士学位论文 3 2r s 9 4 12 6 和r s 4 6 9 7 4 8 9h a pio t y p e 分析 r s 9 4 1 2 6 和r s 4 6 9 7 4 8 9 位于c c d c l 4 9 基因区域 属于同一个l db l o c k h a p l o t y p e f r 淅r s 9 4 1 2 6 5 和r s 4 6 9 7 4 8 9 存在与高度近视相关的连锁不平衡 如图6 图6r s 9 4 1 2 6 和r s 4 6 9 7 4 8 9h a p l o t y p e 分析图 3 3 单体型频率分析 表5 r s 9 4 1 2 6 5 r s 4 6 9 7 4 8 9 在高度近视组和健康对照组中的单倍型频率表 h a p v i e w 4 0 软件分析 表5 显示单倍体型 h 1 t c 在高度近视组中频率为 5 4 3 而在对照组中频率为5 8 9 差别具有统计学意义 x 2 15 6 9 p 0 0 0 0 0 7 5 2 0 鼍 l 一 l 蚺婚ni 甘 第四章讨论 4 1 高度近视的发病机制 第四章讨论 高度近视 我们又称恶性近视或病理性近视 是指屈光度数大于 6 0d 并 且伴有眼轴的增长和眼基质的如下改变 色素上皮变薄 豹纹状眼底 视网膜脉 络膜萎缩 f u c h 斑 颞侧弧形斑 漆裂纹等 其视力表现为进行性的降低 可 能伴随弱视 白内障 青光眼 玻璃体混浊 以及视网膜脱离等众多并发症 是 目前人类致盲眼病的重要原因之一 1 高度近视的发病机制研究涉及种族遗传因素 环境因素 并包括眼球的解剖 生理 血液供应 营养供给以及植物神经系统 内分泌系统 免疫系统等等 但 是仍然以环境与遗传因素为主要机制 8 遗传因素在近视眼中的作用已在流行病学调查中得以体现 相对单纯性低度 近视而言 遗传因素对病理性近视眼有着更为明显的影响c 9 随着进一步深入对近视遗传学的研究 国内外研究者应用候选基因筛查 连 锁分析 全基因组扫描等基因技术对近视进行候选基因的克隆筛查与基因定位 m y p l x q 2 8 t 1 1 7 1 m y p 2 1 8 p 1 1 3 1c 1 6 i m y p 3 1 2 q 2 1 3 1 1 9 加 m y p 4 7 q 3 6 c 2 1 m y p 5 1 7 q 2 1 q 2 2 1 5 1 7 m y p 6 2 2 q 1 2 m y p 7 1 l p l 3 m y p 8 3 q 6 m y p 9 4 q 1 2 m y p l 0 8 p 2 3 m y p l l 4 q 2 2 q 2 t 1 7 m y p l 2 2 q 3 7 1 t 2 1 m y p l 3 x q 2 3 2 2 m y p l 4 1 p 3 6 1 2 3 j m y p l 5 1 0 q 2 1 1 2 4 m y p l 6 5 p 1 5 t 2 5 郐 2 2 q 1 2 3 1 6 是目前已经发现的高度近视位点 很多位于x 染色体的基因点以及位于常染色体的基因位点例如 4 q 2 2 q 2 8 8 q 2 2 2 1 0 q 2 2 1 1 q 2 3 1 3 q 2 2 1 4 q 3 2 1 7 q 末端 均影响高度近视的发生发展 1 6 此外 很多位于x 染色体的基因突变都与视觉的疾病有关 如伴随高度近 视的色觉干扰 2 l 目前发现与高度近视相关的遗传综合症有1 5 0 多个 2 2 1 4 2 全基因组扫描技术的基本策略 位于外显子区的s n p 可能使蛋白质的表达受影响 位于内含子区的s n p 可能使剪接结果受影响 位于启动子区的s n p 就有可能直接使核基因的表达水 平受影响 第三代多态性标记是s n p 其具备数量最多并且容易批量检测的自身 2 1 青岛大学硕士学位论文 优点 这些特性都决定了对s n p 的研究将有助于解释个体表型的差异 不同群 体与个体对环境因子的反应差异 以及某种疾病对不同种类药物的耐受性差异 尤其是某些复杂的疾病 比如病理性近视等 的易感性差异 全基因组扫描技术 的基本策略是连锁分析与关联分析两种方法 连锁分析是应用基因连锁的原理同 时利用某些典型大家系中疾病的表型来寻找两个或两个以上遗传标记之间的关 系 以达到确定致病基因的位置的目的 假设该家系中大多数的患某病病人在某 一位点上拥有相同的多态性标记 而未患某病病人都不拥有该标记 我们可以断 定该致病基因与该位点存在一定的连锁关系 可以说该致病基因位于离这个位点 十分近的位置 探讨某个遗传标记与某个特定表型之间的关系的方法是关联分 析 之前 研究高度近视的方法应用连锁分析较多 后来有研究发现 其对于定 位罕见 高危的等位基因效果比较好 此外其效果还依赖如下因素 1 完全或接 近完全由遗传因素决定疾病的发生 2 拥有高外显率的致病基因等等 综合考虑 关联分析具备 l 易收集样本2 非参数分析3 定位和鉴定复杂性状多基因病易感 基因 到目前为止 对高度近视的研究趋势是关联研究取代连锁研究 是近年来 比较受推崇的一种分析方法 4 3 关联分析 关联分析按照研究对象不同又分群体 家系关联研究 前者的研究对象相对 较易获得 是目前应用最广泛的多基因疾病研究的方法 人们一般是对在染色体 定位区域内的候选基因的多态性进行疾病关联分析 也常称作病例 对照法 详 细解释病例组与对照组如下 随机选取无亲缘关系的群体中特定个数的高度近视 患者为病例组 另选一致个数的正常健康人为对照组 分别比较在某个遗传标记 位点上 某等