大肠杆菌质粒转染实验-QIAGEN大提试剂盒.doc

质粒抽提一、溶液及培养基配制：1、LB液体培养基（1）配方：酵母提取物(Yeast extract) 5g/L 胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于锥形瓶中，搅拌使药品全部溶化。C、定容。D、加塞、包扎。F、高压灭菌121，30min，灭菌后室温保存备用。若要分装需要在超净台内。G、培养基完全溶解，降至室温后，加氨苄霉素（AMP）。先将AMP用三蒸水配制为100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培养基。（可以多配制一些，分装为1ml/管）2、LB固体培养基（1）配方：酵母提取物(Yeast extract) 5g/L氯化钠(NaCl) 5g/L胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L氨苄青霉素溶液 100g/ml（终浓度）（即100mg溶于1ml超纯水或生理盐水或PBS，再加入1000ml培养基）琼脂粉 15g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。C、5mol/L NaOH溶液调pH到7.4。D、定容。E、分装、加塞、包扎。F、高压灭菌121，30min。G、灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55的水浴中（或室温），待培养基温度降到55时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。（3）倒板： 一般20ml倒1块板，培养基倒入培养皿后，打开盖子，水分晾干后盖上盖子并用封口膜封口，4保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇的2ml和大摇的250ml LB培养基。小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取用。转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌 摇菌器申请，张评浒老师，王雪师姐；注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。所有需要提前灭菌的东西有：足量液体LB培养基灭菌后加入AMP；蓝黄白枪头至少个一盒，备用；1.5ml doff管；Beckman离心机专用离心管；锡箔纸；250ml锥形瓶，500或者1000ml锥形瓶；电动移液器所用移液管（可以考虑用5ml移液枪，则先灭菌5ml枪头）；超纯水和TE bufferStep1：转化:事前准备的：提前将固体培养基至于超净台中，使之回复室温；灭过菌的L形玻棒，确认微生物室有灭过菌的；灭过菌烘干的进口1.5ml doff管足量；100L枪及灭菌黄枪头（微生物室或许有），10L枪及灭菌白枪头；Marker笔烧杯，温度计小冰盒以及冰注意感受态融化需要时间，可以先将感受态取出融化的时间内做其他准备工作感受态提前半小时从-80冰箱取出插到冰里融化，半融化即可（冰内30min即可）。将冰箱里的固体培养基，灭过菌烘干的进口1.5ml doff管，灭过菌的L形玻棒，枪及枪头取出备用。感受态融化后将其分装，50l/管（注意在加质粒前在各个管子上标注好要加入的质粒名称以防混淆）。每个管加3l质粒，轻轻吹打均匀，冰上静置30min 。42水浴放置90秒后迅速拿出，插到冰里。铺板，每个质粒铺5l/板。放置过夜。所有操作尽量在超净台内完成，避免杂菌污染。Step2：小摇及大摇事先准备：灭过菌的加过AMP的LB液体培养基，每个质粒至少250ml左右；15ml离心管；灭过菌的250ml及500ml或1000ml锥形瓶灭过菌的白枪头及枪；灭过菌的蓝枪头及枪；marker笔，医用胶带，封口膜，垃圾袋灭过菌的锡箔纸申请Beckman离心机，借Beckman离心机专用离心管，为第二天抽提做准备1、观察菌落生长状况，若无异常，准备小摇。2、准备LB液体培养基（灭菌，AMP），分装至50ml离心管中（注明使用与否、加氨苄量、配制时间等），可在4度冰箱内储备使用；将15ml离心管上按待扩增质粒名称做好标记。3、从分装的50ml离心管中，向15ml离心管中加入2ml液体LB（灭菌，AMP）培养基（注意尽量不要留在瓶壁上）。多余培养基使用后封口，4度保存。4、以孤立的菌落点为目标，用枪头（推荐白枪头）刮取微量菌落，溶于2ml培养基中。将离心管盖子拧松后用胶带固定5、小摇，时间以具体情况定。一般从上午10点左右开始小摇，到当天下午5点可以准备大摇。6、封好固体培养基，放回4度冰箱，收拾好微生物室台面，清理废液缸及垃圾桶（为了以后能顺利申请到）7、小摇成功后，液体LB（灭菌，AMP）培养基，每250ml分装于500ml或1000ml锥形瓶中（瓶越大，培养基震荡越充分），不需严格定量。将小摇完成的培养基加入大锥形瓶中（注意在瓶上做好相关标记），灭菌过的锡箔纸包裹瓶口，大摇，过夜。Step3：质粒抽提（大提，若为中提或小提具体看说明书）（使用进口器材）注意及时申请Beckman离心机，除了20000g转速必需，其余6000g转速可以用张评浒老师德尔Sigema离心机代替；准备好试剂盒，检查试剂盒中各个试剂是否足够，每个质粒Buffer P1（4度预冷）10ml，Buffer P210ml，BufferP3（4度预冷）10ml，Buffer QBT 10ml，BufferQC 60ml，Buffer QF15ml。准备足量50ml离心管，每个质粒至少需要7个离心管；准备足量的灭菌doff管灭过菌的移液管及电动移液器（若无，可用1000微升枪及灭过菌的蓝枪头代替）冰及冰盒1000微升枪及灭过菌的蓝枪头灭过菌的超纯水，无水乙醇，未灭菌的TE buffer以及灭过菌的TE buffer（细胞房冰箱有，若无可用滤器制备一些），异丙醇，3M乙酸钠1、 将大摇完成的瓶子中的培养基分装到5个50ml离心管中，此时培养基浑浊。2、 Beckman离心机，Beckman离心管，6000g、4、15min。（提前一天申请离心机的使用），需分批离心。离心后尽快，小心地弃上清。3、 加入4预冷的Buffer P1 10ml，重悬大肠杆菌。由于菌分装在若干离心管中，先将10ml加入一个离心管中，吹起沉淀的菌，吹匀，加到另一个离心管里，再吹，依次将菌全部收集到Beckman离心管。4、 加入Buffer P2 10ml，翻转混匀4-6次，室温（15-25）孵育5min。5、 加入4预冷的Buffer P3 10ml，翻转混匀4-6次，冰上孵育20min。6、 离心，使裂解的大肠杆菌沉淀，20000g、4、30min。7、 将上清转移到50ml离心管中，二次离心，6000g、4、30min。8、 安装QIAGEN-tip。*9、 向tip中加入10ml Buffer QBT，随重力流下，以平衡tip。10、 小心加入第7步得到的上清，注意不能让沉淀漂起，否则要再离心。随重力流下。质粒将留在树胶滤器中。11、 向tip中加入230ml Buffer QC，随重力流下12、 将15ml 65预热的Buffer QF加入tip，于tip下安置50ml离心管，接滤出的液体，含质粒。13、 向含质粒的滤出液中加入10.5ml，即0.7倍QF体积的异丙醇，以使DNA沉淀。加入后6000g、4、1h。小心地弃去上清（注意离心之后立即倒净异丙醇，否则沉淀将漂起）。14、 向50ml离心管加入400l未灭菌的TE buffer，吹起，溶解，转移至1.5ml 进口灭菌doff管。室温静置30min。15、 向doff管中加60l乙酸钠和650l无水乙醇，出现沉淀。10000rpm，4-8，10min。（离心机预冷）16、 尽可能的吸去上清。加入75%乙醇1ml（已灭菌分装的超纯水250l+无水乙醇750l，混合于灭菌的进口doff管，注意应当先在另一个灭菌doff管中配好，绝不可先向沉淀里加水，否则即便加了酒精，沉淀也很难析出），10000rpm，4-8，5min。尽可能吸去上清乙醇，然后重复以上离心，尽可能吸去上清乙醇。最后放置超净台中风干（最大风量约15-20min）。17、 加150l灭过菌的细胞房存放的TE buffer，溶解后封口膜封口，-4保存1-2天，待其完全溶解后测定吸光度。测定吸光度后-20保存。具体要求何种浓度为提取成功，依据后续细胞转染实验要求而定（参考值为1g/ml）Step4 浓度测定1、 准备比色皿，PCR用2.5l、100l枪及相应灭过菌的进口枪头，面巾纸，新鲜的超纯水。（注意防护，戴口罩，最好用酒精擦拭附近桌面，老师建议可以在超净台内吸取所需质粒提取液，取出来测）2、 打开仪器，选择“DNA”，“Dilution”保持为“100”。若浓度较低，测不出浓度，则换稀释比例“Set up”“enter”，选择“D