代谢工程.doc

代谢工程：（部分）把量化代谢流及其控制的工程分析方法和用以精确制订遗传修饰方案并付之实施的分子生物学综合技术结合起来，以上述“分析综合”反复交替操作、螺旋式逼近目标的方式，在较广范围内改善细胞性能，以满足人类对生物的特定需求的生物工程。代谢工程与随机诱变育种的优势：在代谢工程中工作计划的定向性更加集中,更加有针对性。这定向性在酶的目标的选择，实验的设计，数据的分析上起着支配的作用。 代谢工程可在细胞与分子水平上认识和改造细胞过程，其不仅在解释细胞生理特性上具有重要的科学意义，而且其潜在的应用跨越了生物技术的全部领域，主要包括：(1)异源蛋白的生产；(2)扩大底物利用范围；(3)生产原来不存在的新物质；(4)对环境有害物质的降解；(5)提高菌体对环境的适应能力；(6)阻断或降低副产物的生成；(7)代谢产品生产速率和生产能力的提高；(8)植物代谢工程；(9)动物代谢工程；(10)人体和组织代谢工程一人类疾病诊断和基因治疗。代谢途径是将一组特定的流入和流出代谢物质联系在一起的一个生化反应序列。代谢流(物流/通量)(flux)：流入代谢物经该途径转变为流出物的速率。代谢网络可视为由若干个串联或并联的简单子途径组成，它们通过节点相连。节点分为柔性、强刚性及弱刚性节点三类。 柔性节点：是指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。 强刚性节点:是指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。 弱刚性节点:介于前两者之间，由该节点流向各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶活较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物的产率。 代谢物流分析：一种计算流经各种途径的通量的技术，用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。代谢控制分析:物流控制被分布在途径的所有步骤中，只是若干步骤的物流比其他的更大些，可用数学方程来描述反应网络内的控制机制，即用一途径的物流和以物流控制系数来定量表示酶活之间的关系。物流控制系数: 物流的百分比变化除以酶活(该酶能引起物流的改变)的百分比变化表示。物流求和理论:如果将一代谢系统中的某一物流的所有酶的物流控制系数加在一起，其和为1。 物流分担比:途径A与途径B之比，如葡萄糖-6-磷酸节上的物流分担比便是EMP途径物流/(pp途径物流)。 弹性系数:表示酶催化反应速率对代谢物浓度的敏感性。弹性系数是个别酶的特性。 代谢工程涉及的主要内容：生物合成相关代谢调控和代谢网络理论; 代谢流的定量分析;代谢网络的重新设计;中心代谢作用机理及相关代谢分析；基因操作.广义的代谢网络包括物质代谢网络，能量代谢网络。 代谢网络的组成取决于微生物的遗传性能和微生物细胞存在的环境。 代谢网络主要由核心部分和两个在运行时间上有交叉的部分组成，分别是中心代谢途径； 收敛途径:指向中心代谢途径，并以中心代谢途径中间化合物为接口的途径;发散途径:以中心代谢途径的中间化合物为起点，从中心代谢途径向周围分散的途径。根据细胞代谢流的形成机制和流动属性，可将构成代谢网络的所有途径分为载流途径和代谢主流两大类。载流途径:代谢网络中的一部分途径首尾衔接形成的一条从原料化合物到目的产物的途径。 载流途径一般包括:原料化合物胞外降解和进入细胞， 碳架物质经细胞内进一步降解或转换存在方式进入中心代谢途径， 目的产物合成途径， 以及目的产物排出等阶段。进，通，节，堵，出 的策略。进：促进细胞对碳源等营养物质的吸收 通： 使来自上游和各个注入分支的碳架物质能畅通地流向目的产物 节：阻塞与目的产物的形成无关或关系不大的代谢支流。使碳架物质相对集中地流向目的产物 堵： 消除或削弱目的产物进一步代谢的途径 出：就是促进目的产物向胞外空间分泌。代谢物质的流动过程是一种类似“流体流动” 的过程，它具备流动的一切属性，诸如 方向性、连续性、有序性、可调性等等， 并且可以接受疏导、阻塞、分流、汇流等 “ 治理 ”， 也可能发生“ 干枯 ”和“溢出 ( 泛滥 ) ”等现象。此外，还有流速和流量等问题。以代谢流动的观点加深对代谢网络的认识： 代谢组学:效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000 D以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。主要技术手段是核磁共振（NMR），质谱（MS），色谱（HPLC，GC）及色谱质谱联用技术。通过检测一系列样品的NMR 谱图，再结合模式识别方法，可以判断出生物体的病理生理状态，并有可能找出与之相关的生物标志物（biomarker）。为相关预警信号提供一个预知平台。自20世纪末出现基因组学概念以后,各种”组学(-omics)”呈井喷式暴发.有人统计共有数百种组学问世。常见的如基因组学,蛋白质组学,转录组学,代谢组学。代谢组指一个细胞、组织或器官中,所有代谢产物的集合,一般指分子量小于1000D的物质。基因组学主要研究内容:生物系统的基因结构组成,即DNA 的序列及表达。 蛋白组学研究内容:由生物系统表达的蛋白及由外部刺激引起的差异。代谢组学研究内容:生物体系(细胞,组织或生物体)受外部刺激所产生的所有代谢产物的变化。 途径的组合，其原则是选取参与途径反应最简单的代谢物以简化途径。例如，L参与的反应最少，是最优先考虑对象，但L为目的产物，仅由反应m产生，对其他代谢物无任何影响，事实上已经是最简单的反应序列。其次是考虑选取A或B，两者参与的反应一样多。假定现在随机选取B，为了将其从整个代谢途径中消除，构建新的反应过程 a，b，它来自反应a和反应b的组合，即a+b=a，b。代谢通量分析:是用计量矩阵模型表示拟稳态假设下胞内反应的一种定量分析方法。假定一定时间内，胞内中间代谢产物的浓度不变，根据代谢途径中各反应的计量关系以及实验中测得的底物消耗速率或者产物生成速率，基于质量平衡以及可能的能量平衡来确定未知的反应速率，进而确定代谢网络的通量分配图。 若系统中速率的总个数为n（包括交换速率），计量矩阵的秩为r，则待解问题的自由度为F = n r 若实验测得速率个数与自由度相等，则代谢系统为确定系统若实验测得速率个数大于自由度，代谢系统为超定系统若实验测得速率个数小于自由度，代谢系统为未定系统对于确定系统和超定系统的应用，主要是由实验测得的胞外速率计算出胞内代谢通量分布，从而从更深的层次了解细胞所处的生理状态，常称为代谢通量分析。代谢控制分析（MCA）在生化反应系统敏感性分析的基础上发展起来的，是研究分析代谢途径中代谢控制在各个反应步骤之间如何分配的理论。这一理论可以用数学形式表达，也可以同实验方法结合对 细胞代谢的调控问题 提出定量的解释 。MCA 的基本研究对象:是由代谢反应步骤以及代谢反应途径组成的代谢系统，单个反应步骤是组成系统的基本单元。 MCA 认为代谢系统中所有反应步骤都对代谢通量和代谢物浓度进行控制，因此对其中一个反应步骤施加微扰而产生的代谢通量（或代谢物浓度）变化的大小，可以作为代谢系统分析理论的基本概念。代谢控制分析定义了一些重要的表征参数，如通量控制系数、浓度控制系数、弹性系数等，它们分别表示某一酶水平变化对速率分布或浓度分布 影响及底物浓度变化对速率分布的影响。控制系数:是指在生理条件(即某一恒态)下，对代谢系统中某一步反应施加一个微小扰动，所引起指定的代谢通量或代谢物浓度的相对变化与该反应的反应速度Vi 对变化之比.弹性系数:是指在一个与代谢系统中某一步反应具有相同参数的酶促反应中，对该反应某一参数 p (如底物、产物、酶浓度、温度、效应物等) 进行微扰，所引起的反应速度 Vi 的相对变化与该参数的相对变化之比. 代谢通量分析（MFA）是代谢途径通量确定的一个强有力的方法，因此，通过利用主要胞内反应的化学计量模型及应用围绕代谢物的质量平衡关系，就可计算出胞内通量。代谢通量分析: 根据代谢路径中各反应的计量关系以及实验的某些底物、产物的通量和细胞组成等来确定整个代谢网络的通量分布。该方法的基础是准稳态假设。假设细胞内的中间代谢物均处于准稳态，即其浓度变化速率为 0，这样由 n 个中间代谢