三聚氰胺测定不确定度评估报告

HPLC法测定奶粉中三聚氰胺含量的不确定度评估1. 目标为了三聚氰胺测量方法的优化和更准确地评价三聚氰胺的结果，采用B类评定方式确定该方法的相对不确定度。2. 测定程序2.1. 方法依据：GB/T 2388-2008原料乳与乳制品中三聚氰安检测方法2.2. 样品提取称取3g（精确至0.01g）试样于50mL具塞塑料离心管，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10min，再振荡提取10min后，以不低于4000r/min离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL滤液，加入5mL水混匀后做待测净化液。2.3. 净化将待净化液转移至固相萃取柱（BESEP HR-XC）中。依次用3mL水和3mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1mL/min。洗脱液于50下用氮气吹干，残留物用1mL流动相定容，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。2.4. 液相色谱条件a) C18柱，250mm4.6mm5umb) 离子对试剂缓冲溶液-乙腈（88+12，体积比）。c) 流速：1.0mL/mind) 柱温：40e) 波长：240nmf) 进样量：20uL2.5. 标准曲线的绘制2.5.1. 标准储备液的配制准确称取0.2330g三聚氰胺标准品于50mL容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为464ug/mL的三聚氰胺标准储备液。2.5.2. 标准工作液用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到浓度分别为0.8、2、20、40、80ug/mL的标准工作曲线，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度做标准曲线，得到标准曲线回归方程。具体配制过程见下表：表1 标准工作液配制过程标准工作液浓度（ug/mL）稀释过程吸取液浓度（ug/mL）吸取量（mL）定容体积（mL）804641.72510408051020802.5102800.25100.8800.1103. 建立数学模型试样中三聚氰胺结果计算公式如下：式中：X试样中三聚氰胺的含量，单位是毫克每千克（mg/kg）；C样液在标准曲线所读的浓度值；V样液最终定容体积，单位为mL；m试样的质量，单位为克（g）；f 稀释倍数。4. 分析确定不确定度的来源从测量过程和数学模型分析，影响三聚氰胺含量的测量不确定度主要来源于：体积的相对不确定度、质量的相对不确定度、标准溶液校准的相对不确定度和前处理影响因子的相对不确定度。体积的相对不确定度是由人员、温度和量具本身影响的；质量的相对不确定度是由称量过程中人员和天平本身影响而导致的；标准溶液校准的相对不确定度是由工作曲线的非线性、标准溶液的不确定度影响；前处理影响因子的相对不确定度是由仪器不稳定性、前处理和其他因素影响。详细如图一鱼骨图所示。图一 鱼骨图（曲线校准） （前处理影响因子）工作曲线拟合 定容过程配制容器校准 标准物质称量 稀释过程标准溶液的不确定度 仪器测试的影响 样品中三聚氰胺含量测量重复性 测量重复性 实验室温度波动 可读性（电子天平的量化误差）器具校准的不确定度 天平校准产生的不确定度 (体积) （样品质量）5. 计算不确定度分量5.1. 由标准曲线求得样液中三聚氰胺的浓度引入的标准不确定度u（Cx）5.1.1. 配制标准工作溶液引入的不确定度5.1.1.1. 标准物质引入的标准不确定度u（p）根据标准物质证书给出的信息，三聚氰胺标准物质的相对不确定度为0.5%，参考文献3中由于标准证书给出无法定量的限值，因此按矩形分布处理：=0.002895.1.1.2. 标准物质称量引起的标准不确定度准确称取0.2330g标准品，根据电子天平检定证书，0m5g，天平最大允差为：0.0005g，按均匀分布考虑，=2.89g，天平重复性误差：0.0001g，称量引入的标准不确定度=0.0003，相对不确定度=0.00129。5.1.1.3. 配制工作液配制过程中量器校准引入的不确定度标准溶液配制过程中使用了一系列量器，容量瓶按均匀分布计算，移液器不确定度按照正态分布计算。如表2所示：表2 玻璃量器校准引入的标准不确定度玻璃量器最大允差标准不确定度相对标准不确定度50mL容量瓶0.05mL0.02890.00057710mL容量瓶B级（使用5次）0.04mL0.0230.00235mL移液器（使用2次）0.0050.002890.0005771mL移液器（使用2次）0.0020.001160.00116=0.00555.1.1.4. 标准工作液配制过程中人员读数引起的不确定度参考文献3中有关数据，人员读数允许有1%的不确定度即0.01V，按三角分布考虑，则人员每次读数引起的相对不确定度为。配制标准工作液使用玻璃量器6次，因此人员读数引入的相对标准不确定度为：、相互独立不相关，故配制标准工作溶液引入的相对不确定度为： = 0.01185.1.2. 标准曲线拟合引入的不确定度u（curve）对标准工作液进行测量，测得其峰面积，以峰面积A-浓度C（ug/mL）作标准曲线，标准曲线为：A=69.037C+23.297，r2=0.9998，斜率b=69.037，截距a=23.297。对样品进行两次测量，由标准曲线测得三聚氰胺的含量Cx为8.38ug/mL。序号12345平均值浓度 (ug/L)0.8220408028.56-27.7626.56-8.5611.4451.44峰面积(A)57.8141.81453.82789.95532.0a+bCi78.52724161.37261404.0532784.8095546.321429.618383.0872435.12625.918205.091其中，残差标准偏差=34.053离均差平方和=4326.27其中：b-斜率；a-截距；P样品测试次数；N测试工作曲线的次数；Cx样品溶液中三聚氰胺的含量（ug/mL）；Cs不同浓度标准工作溶液的平均值（ug/mL）；Ci标准工作液的浓度（ug/mL）；Ai与标液Ci对应的峰面积；i获得标准曲线的测量次数。=0.440 ug/mL=0.05255.1.3. 样液和标准工作液的峰面积引入的标准不确定度u（A）根据高效液相色谱仪的检定证书的定量重复性为0.1%，按矩形分布，则相对不确定度=0.00041、互相独立不相关，因此标准曲线求得样液中三聚氰胺的浓度引入的相对标准不确定度则为：0.05385.2. 样品称量m引入的标准不确定度u（m）称取样品3.0g，根据电子天平检定证书，0m5g，天平最大允差为0.0005g，按均匀分布考虑，=2.89g,天平重复性误差：0.0001g，称量引入的标准不确定度=0.0003，相对不确定度=0.0001由于样品称样采用的是万分之一的分析天平，故称样不确定度可忽略。5.3. 样品稀释移取过程f中引入的标准不确定度u（f）5.3.1. 量器校准引入的标准不确定度样品用25mL容量瓶B级进行定容，取10mLA级单标线移液管移取10mL，待净化液。25mL容量瓶B级最大允差：0.06mL；10mLA级单标线移液管最大允差：0.02mL；所以量器校准引入的相对标准不确定度为：=0.00185.3.2. 样品稀释移取过程人员读数引入的标准不确定度 按照5.1.1.4同法分析，样品稀释移取过程中使用玻璃量器2次，人员读数2次，由人员读数引入的相对标准不确定度，故样品稀释移取过程引入的相对标准不确定度5.4. 定容体积V引入的标准不确定度u（V）样品经提取净化后用1mL单标线移液管取1mL流动相定容。5.4.1. 定容量器校准引入的标准不确定度1mLA级单标线移液管最大允差：0.007mL；按均匀分布考虑，由此引入的相对标准不确定度为：mL5.4.2. 定容量器人员读数引入的标准不确定度 按照5.1.1.4同法分析，样品稀释移取过程中使用玻璃量器1次，人员读数1次，由人员读数引入的相对标准不确定度，故定容体积（V）引入的相对标准不确定度为： =0.00574mL,则相对不确定度6. 评定测量量之间的相互关系 各测量量之间完全相互独立，没有相关性。7. 计算合成不确定度 表3 标准相对不确定度一览表标准不确定度分量u不确定度来源标准相对不确定度标准曲线引入的不确定度0.0538样品称量m引入的标准不确定度00001样品稀释过程产生的不确定度0.0064定容体积V引入的标准不确定度000574将表3中各相对不确定度合成：=0.05458. 计算扩展不确定度由实验数据计算得样品中三聚氰胺含量为6.98mg/kg，则测量结果的合成标准不确定度为u（X）=6.980.0545=0.381 mg/kg；取包含因子k=