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农兽药多残留免疫分析检测方法研究进展作者：谢桂勉 沈玉栋 孙远明摘要:综述了免疫分析法在拟除虫菊酯、氨基甲酸酯、有机磷、氟喹诺酮、磺胺5种农兽药多残留检测上的应用情况,着重讨论了抗原设计、抗体制备和方法建立等核心技术的研究进展,并对检测方法的发展进行了展望。 关键词:农兽药;多残留;免疫分析法 AbstractThe applications of immunoassay methods in the multi-residue determination of pyrethroids,carbamate,organophosphorus,fluoroquinolones and sulfonamides were summarized in this paper. The study advancers on core techniques,such as antigen design,antibody production and method development,were discussed emphatically,and the further trend of immunoassay methods was proposed. Key wordspesticides and veterinary drugs;multi-residue;immunoassay 农兽药残留危害人们的生活健康,是食品安全检测的关注焦点。基于特异性抗体的酶免疫分析方法作为一种简便、快速和灵敏的检测方法,在近年来的食品安全检测中起到越来越重要的作用。采用酶免疫试剂盒、胶体金试纸条高通量、快速筛选阳性样品后,再用仪器确证的方法得到检验监测单位的普遍认可。已成功应用的检测产品有克伦特罗、莱克多巴胺试剂盒和试纸条等。其他如孔雀石绿、苏丹红、呋喃西林、恩诺沙星等快速检测产品也已投放市场,推广使用还需要一定时间的验证。然而一个不争的事实就是,对于检测如磺胺类、氟喹诺酮类、有机磷类、拟除虫菊酯类等有害物质时,使用单残留试剂盒并不比直接使用仪器具有优势。特别是检测农残的快速检测产品目前还不成熟,稳定性和假阳性等问题还未能很好解决。因此,如何同时检测一类药物,真正降低检测成本,并保证检测的准确性是目前农兽药的快速多残留检测的一种新趋势。 实现一类药物的多残留检测的基本思路是针对一类药物的共性结构设计并合成半抗原,由半抗原偶联载体蛋白制备全抗原,通过免疫动物制备抗体,利用抗体对一类药物的识别作用,建立多残留检测酶免疫分析方法1-3。 1农兽药的多残留现状 近年来,食品安全问题一直是困扰民生的焦点问题,而农兽药残留是制约食品安全的首要因素。2000年开始,广东省开展食品本底水平和污染监测项目,截至2005年的监测结果显示:蔬菜甲胺磷、敌百虫和敌敌畏检出率分别为7.95%、3.03%和2.65%,水果有机磷农药水胺硫磷检出率为10%,新鲜食用菌有机磷农药内吸磷检出率为8.33%,茶叶有机磷农药三氯杀螨醇检出率为5%,蔬菜氨基甲酸酯农药和拟除虫菊酯农药残留检出率为1.47%、17.17%,水果拟除虫菊酯农药检出率为20%。尽管国家加强了农药使用的监控力度,但是农药中毒事件和对外贸易摩擦仍时有发生。2008年12月,中日贸易过程中发生的“毒饺子”事件(有机磷农药中毒事件),使中国食品在日本市场遭受重创。而兽药方面主要是一些抗生素和兴奋剂的危害,如磺胺类、氟喹诺酮类、肾上腺素兴奋剂等。直到2009年2月初,广东仍有瘦肉精中毒事件发生,导致610人中毒。2009年6月1日,中华人民共和国食品安全法正式实施,表明了国家维护食品安全的力度。有了法律法规的约束作用,仍然不可缺少检测方法的支持。针对目前农兽药品种繁多,多残留现状严峻,开展多残留检测研究,尤其是能实现快速、高通量、现场筛查的免疫分析法的研究非常重要。 2免疫分析法在各类农兽药多残留检测上的应用 农兽药多残留酶免疫分析法的基本原理是根据待测一类药物的共性结构或共有结构特征,设计并合成突出其结构特征的半抗原,半抗原偶联大分子蛋白质作为全抗原并免疫动物,通过细胞融合获得杂交瘤细胞,收集并纯化杂交瘤细胞分泌的类特异性抗体(或称宽谱特异性抗体、广谱特异性抗体),利用抗体建立酶免疫吸附测定(ELISA)、免疫胶体金(GICA)等免疫分析法。 2.1拟除虫菊酯 拟除虫菊酯(Pyrethroids)农药是20世纪70年代研发的一类仿生杀虫剂,具有化学性质稳定,不易光解,无特殊臭味及安全系数高,使用浓度低,触杀作用强,灭虫速度快等优点。目前其酶免疫分析检测方法的研究已经开展比较多。Pullen等4直接采用氯菊酯的水解产物氯菊酸作半抗原,分别制备了具有不同交叉反应率的单克隆抗体和多克隆抗体,初步探索了2种抗体的类特异性。结果发现单克隆抗体可检测类型(菊酯类)拟除虫菊酯,对类型拟除虫菊酯(氰菊酯)没有交叉反应;而多克隆抗体既可检测类型拟除虫菊酯,又可检测类型拟除虫菊酯。Mak等5利用菊酸和间苯氧基苄醇合成的半抗原与甲状腺球蛋白结合制备型菊酯的免疫原并免疫动物获得多克隆抗体。由该抗体建立的ELISA方法检测氯氰菊酯、百树菊酯、氨氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和氟胺氰菊酯的IC50值为6205 ng/mL,而对型菊酯无交叉反应。国内在这方面的研究包括有李志茹6、骆爱兰等7、杨挺等8、祝金凤9的报道。其中祝金凤设计合成了能模拟型菊酯类农药特征结构的半抗原(RS)-氰基-3-苯氧基苄基(RS)-cis,trans-2,2-二甲基-3-羧基-环丙烷羧酸酯,用活泼酯法制备人工抗原,免疫新西兰大白兔获得抗型菊酯类农药的广谱特异性抗体。该抗体对5种型菊酯有识别作用,对氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯的灵敏度较高,间接竞争ELISA方法的检测限分别为11.7 ng/mL和48.5 ng/mL。 2.2氨基甲酸酯 氨基甲酸酯类农药(Carbamate)具有杀虫谱广、用药量少、药效快等特点,目前对其检测主要采用高效液相色谱法和酶抑制法等,酶免疫多残留检测的研究报道很少。孙覃10合成了半抗原6-(苯氧基羰基)氨基-1-己酸并成功制备了芳基-N-甲基氨基甲酸酯类杀虫剂的通用抗体,抗体检测混灭威、灭除威、灭杀威、甲萘威的IC50值为0.47、0.65、1.08、0.53 g/mL,其中混灭威在自来水、土壤以及青菜中的添加回收率分别为101.6%、87.7%和90.4%。 2.3有机磷 有机磷农药(Organophosphorus)通常是指磷(膦)酸酯、硫逐磷酸酯、磷酰胺酯类有机磷化合物。对于有机磷农药的多残留检测通常采用的是制备类识别特异性的抗体的途径。已有的报道都是针对二甲氧基(硫代)磷酸酯或二乙氧基(硫代)磷酸酯两大类有机磷农药的研究。自从1988年Sudi等11,首先提出建立有机磷农药多残留检测的酶联免疫的方法后,国内外已有不少利用类特异性多克隆抗体建立二甲氧基(硫代)磷酸酯或二乙氧基(硫代)磷酸酯两大类有机磷多残留检测的报道12-17。Jang等18制备了O,O-二乙基-O-(5-羧基-2-氟苯基)硫代磷酰酯作为通用半抗原,偶联蛋白质作为人工抗原免疫小鼠,通过细胞融合体外培养杂交瘤细胞,获得单克隆抗体,并首次利用单克隆抗体建立了间接竞争ELISA的方法用于有机磷多残留检测是一个突破。该方法对4种含有二乙氧基有机磷农药的IC50值在0.10.3 g/mL,克服了利用多克隆抗体建立的方法特异性较差的困难。梁颖等19设计了3个含二甲氧基二硫代磷酸酯共有结构的半抗原,制备出3个单克隆抗体,并建立ELISA方法,检测马拉硫磷、乐果、亚胺硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷可以达到限量标准,印证了Jang 采用单克隆抗体建立多残留检测方法的可行性。同时,还首次作了实际样品的检测,探讨了异源包被原对提高检测灵敏度的作用。 2.4氟喹诺酮 氟喹诺酮(Fluoroquinolones)类药物是一系列新型氟取代的喹诺酮类衍生物,广泛用于畜禽和水产养殖业。由于该类药物本身带有羧基活性基团,方便于酶免疫分析方法的应用。蔡勤仁等20利用碳二亚胺法合成恩诺沙星人工抗原,免疫BALB/c小鼠并采用杂交瘤技术制备了类特异性单克隆抗体,与恩诺沙星、环丙沙星、麻保沙星、沙拉沙星、达氟沙星的交叉反应率为27.4%110.8%,检测限为0.13 ng/mL。魏东21利用活泼酯法制备了沙拉沙星人工抗原,免疫动物得到抗血清,并建立FQNS多残留检测方法。该方法对沙拉沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的检测限为19.126.2 ng/mL。兔肉中4个药物在0.52 000.0 ng/mL范围内的平均添加回收率为85%。李振华22采用达氟沙星偶联牛血清蛋白的人工抗原制备的兔多克隆抗体能识别达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和洛美沙星,交叉反应率为22.7%111.2%。王战辉等23采用环丙沙星直接偶联牛血清蛋白作为免疫原免疫动物并制备得到宽谱特异性抗体单克隆抗体,该抗体建立的方法检测12个氟喹诺酮的交叉反应率在35%100%,最低检测限都可以达到最高限量检测要求。 2.5磺胺 磺胺(Sulfonamides)类药物是一类具有广谱抗菌活性的化学品,广泛应用与人和动物细菌性疾病的治疗和预防。该类药物的酶免疫多残留检测分析研究已经比较多。1991年,Sheth等24用化学方法合成了3种具有磺胺母核结构的半抗原TS、CS、NS,以磺胺噻唑衍生物TS偶联蛋白作为免疫原,制备了广谱特异性抗体。Muldoon等25以对氨基苯磺酸作为半抗原偶联载体蛋白后免疫动物,通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体能很好识别游离药物,检测磺胺硝苯、磺胺吡啶、磺胺噻唑的IC50值分别为1.41、22.80、322.00 ng/mL。ZHANG Hong-yan等26等设计并合成了5个对氨基苯磺酸衍生物作为半抗原,其中用对氨基苯甲酸作为手臂的半抗原偶联KLH后免疫新西兰大白兔得到的抗体最佳。利用其建立的异源直接竞争ELISA方法检测11个磺胺类药物的IC50值均小于100 ng/mL,其中磺胺异唑、磺胺噻唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺吡啶和磺胺甲噻二唑可以满足最高残留限量的要求,牛奶样品中药物的添加回收率为104%131%。吕芳27以含五元杂环的磺胺类药物为研究对象,制备了族特异性单克隆抗体,建立的间接竞争ELISA方法,检测磺胺噻唑、酞磺胺噻唑、琥珀酰磺胺噻唑、磺胺甲噁唑及四者等浓度混合物的检测限分别为14.40、6.30、18.20、33.90、4.63 ng/mL。 3展望 目前,农兽药多残留免疫分析法的应用仍处于不成熟的阶段。限制其使用的因素,一是抗药物抗体的类特异性,二是免疫分析法本身的稳定性和灵敏度。前者是开发农兽药多残留免疫分析法的关键。目前的研究成果往往存在抗体谱宽足够但特异性不强或谱宽较窄但特异性较好的情况,真正能达到谱宽合适且特异性较好、检测一类药物的灵敏度相对一致的成果极少。而后者,检测方法的稳定性和灵敏度,是开发相应检测试剂盒产品的制约因素。目前的研究主要集中在制备类特异性抗体的层面上,涉及检测方法和试剂盒开发的研究较少。试剂盒的开发可见于一些专利,市面上销售的试剂盒极少,更多的是处于实验室研究阶段。 尽管农兽药多残留免疫分析法仍不成熟,但作为低成本、高通量、快速检测的一种检测方法,适应全面保证大众食品安全的时代需要,加上国家在这方面的投入,该方法有良好的发展前景。实际上,对于上述的限制因素已有一些研究报道25-28。对于抗体的类特异性,笔者认为:一是可以结合计算机模拟2930等手段设计突出检测