马铃薯品种的抗旱性评价优秀毕业论文 参考文献 可复制黏贴.pdf

分类号 密 级 u d c 编 号 2012090901023 2009 级攻读硕士学位研究生毕业论文 马铃薯品种的抗旱性评价 evaluation of drought resistance of potato varieties 论文起止时间 2011 01 2012 05 指 导 教 师 王舰 研究员 学 生 姓 名 连延浩 论 文 类 型 应用研究 学科专业名称 作物遗传育种 研 究 方 向 马铃薯抗逆育种 学院 系 部 农牧学院 qinghai university master dissertation evaluation of drought resistance of potato varieties supervisor wang jian candidate lian yanhao academic major applided for crop genetic and breeding specific major potato drought resistance breeding college department qinghai university april 5 2012 独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除文中已经标明引用的内容外 本论文不包含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的研究成果 对本文的研究做出贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式标 明 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 学位论文作者签名 日期 年 月 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版 允许论文被查阅和借阅 本人授权青 海大学大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文 本论文属于 保密 不保密 请在相应 方框内打 在 年解密后适用本授权书 学位论文作者签名 指导教师签名 日期 年 月 日 日期 年 月 日 青海大学硕士学位论文 摘要 i 摘 要 本研究通过大田旱棚试验探究马铃薯品种的抗旱性评价方法 运用室内盆 栽控水试验和定量 pcr 技术研究马铃薯具体的抗旱生理机制和相关抗旱基因的 调控情况 综合分析认知马铃薯抗旱机理 具体研究成果如下 1 通过大田旱棚胁迫试验产量数据所计算出来的抗旱系数 得出了 18 个马 铃薯品种的抗旱性强弱排名 其中西北品种乐薯 1 号 陇薯系列 青薯 9 号分 别排在了前几名 为抗旱品种 公认的弱抗品种夏波蒂 大西洋排到了后面 为不抗旱品种 该结果与品种实践生产所反映的抗旱性一致 2 室内盆栽控水试验研究了 5 个马铃薯品种对干旱胁迫的生理响应 得出 结论如下 1 在本试验干旱胁迫程度条件下 5 个马铃薯品种的离体叶片失水 速率均下降 脯氨酸含量和 sod 酶活性升高 且变化量均达到显著水平 叶片 含水量和丙二醛含量在夏波蒂品种中的变化达到显著 在其他品种中变化不显 著 但总体趋势均为胁迫下叶片含水量降低 丙二醛含量升高 2 根据干旱 胁迫下夏波蒂品种的叶片含水量下降了 24 和丙二醛含量升高了 1 9 倍 而其他 品种的变化未达显著水平 认为夏波蒂品种对于水分亏缺的敏感度要高于其他 几个品种 3 采用隶属函数法 对除夏波蒂外的 4 个品种的抗旱生理进行综 合评价 其抗旱生理强弱顺序为 青薯 9 号 脱毒 175 克新 19 青薯 168 3 sod 基因表达量的测定结果表明 sod 基因中 cu zn sod 类型在细胞内 的表达远高于 fe sod 基因 证实了在干旱胁迫下两者的表达量比重发生变化 分析认为 fe sod 表达量相对于 cu zn sod 基因表达上调是马铃薯植株对胁迫 的基因调控反应 表明在马铃薯植株中干旱胁迫下 fe sod 基因的表达起到了较 为重要的作用 关键词 马铃薯 抗旱指标 超氧化物歧化酶 superoxide dismutase 荧光定量 pcr abstract ii abstract drought resistance evaluation method was researched in the field drought stress test by covering block canopy then the physiological biochemical changes in different potato varieties were studied by pot experiment and how the genes relelated to drought resistance regulate by quantitative pcr technique though the comprehensive analysis the drought resistance mechanism in potato were indentified it will accelerate the development of drought resistance breeding in china the followings are the results of experiment 1 though the drought resistance index calculated by tuber yield we indentified the drought rank of 18 potato varieties the lesu no 1 longshu series and qingshu no 9 were on the top which are northwest varieties while shepody and atlcntic rank behind which are acknowledged weak drought resistance varieties and in according with practice of production so we considered that this method could be used to evaluating the drought resistance of potato varieties 2 the plot test indoor was employed to study the physiological responses of five potato cultivars under water stress and the results of study revealed that 1 under the water stress of the experiment the water loss of leaves in vitro of all potato cultivars showed downtrend and prolin content and sod activity showed uptrend and they all reached significant difference while leaf water content and mda conent only reached significant levels in shepody the leaf water content showed downtrend and mda showed uptrend in all potato cultivars 2 compare to other four potato cultivars the leaf water content of shepody declined 24 and mda content increased 1 9 times under water stress so we indentify that the shepody was the most sensitive potato under water stress 3 the drought resistances of all potato cultivars except shepody were comprehensively evaluated by membership function method their drought resistances were shown to decrease in the order of qingshu no 9 tuodu 175 kexin 19 qingshu 168 abstract iii 3 the expression of sod gene indicated that the expression of cu zn sod in the cell were much higher than fe sod the expression proportion of them changed under water stress according to analysis we considered that the up regulation of fe sod gene expression relative to cu zn sod was expression in response to water stress it showed that fe sod gene expression played an important role under the water stress key words potato drought resistance index sod realtime pcr 青海大学硕士学位论文 目录 iv 目 录 第 1 章 文献综述 1 1 1 研究背景 1 1 2 干旱胁迫对马铃薯的危害 2 1 2 1 干旱对马铃薯产量的影响 2 1 2 2 干旱胁迫下马铃薯植株的生理生化反应 3 1 3 马铃薯抗旱性评价相关研究进展 5 1 3 1 抗旱鉴定的方法 5 1 3 2 抗旱鉴定的有关指标 5 1 3 3 国外抗旱评价研究进展 6 1 3 4 国内抗旱评价研究进展 7 1 4 sod 基因及其研究现状 7 1 5 基因表达分析方法的研究现状 8 1 6 本文研究的主要内容及主要贡献 9 1 6 1 主要研究内容 9 1 6 2 各章节介绍 10 1 6 3 本文主要贡献 10 第 2 章 大田旱棚胁迫品种抗旱性鉴定试验 11 2 1 试验内容 11 2 1 1 试验材料 11 2 1 2 试验方法 12 2 2 结果与分析 13 2 2 1 土壤水势变化 13 2 2 2 供试马铃薯品种的推广种植区域与品种抗旱性 14 2 2 3 各马铃薯品种的产量及抗旱系数 16 2 3 结论 16 2 4 讨论 16 第 3 章 5 个马铃薯品种的室内抗旱生理评价 18 3 1 试验材料和方法 18 青海大学硕士学位论文 目录 v 3 1 1 试验材料 18 3 1 2 试验设计 18 3 1 3 指标测定方法 19 3 1 4 统计分析 20 3 2 结果与分析 21 3 2 1 土壤含水量变化 21 3 2 2 叶片含水量变化 22 3 2 3 离体叶片失水速率的变化 23 3 2 4 丙二醛含量变化 25 3 2 5 脯氨酸含量变化 26 3 2 6 sod 酶活变化 27 3 2 7 5 个马铃薯品种的抗旱生理综合评价 28 3 3 结论 28 3 4 讨论 29 第 4 章 干旱胁迫下马铃薯 fe sod 和 cu zn sod 基因表达及分析 31 4 1 试验材料 31 4 2 试验方法 31 4 2 1 采样 31 4 2 2 rna 的提取 纯化和反转录 32 4 2 3 引物设计 33 4 2 4 荧光定量 pcr 步骤 双标准曲线法 34 4 3 试验结果及结论 35 4 3 1 rna 提取及电泳结果 35 4 3 2 2 对引物的 rt pcr 特异性验证 36 4 3 3 荧光定量 pcr 结果分析 36 4 3 4 表达量统计结果及分析 37 4 4 讨论 38 第 5 章 全文讨论 40 参考文献 41 致 谢 48 作者简介 49 青海大学硕士学位论文 第 1 章 文献综述 1 第 1 章 文献综述 1 1 研究背景 干旱是制约世界农业增产的主要因素之一 旱情严重时可使农业生产造成 极大损失 据统计 1 世界干早 半干旱地区占陆地面积的 33 我国的干旱 半干旱地区占国土面积的 45 这些地区由于气候干燥 年降水量少 蒸发剧 烈等原因 严重制约着植物的生长发育 造成树木和作物减产 全球荒漠化土 地面积 3600 万平方公里 占全球陆地面积的 1 4 并以每年 5 万至 7 万平方公 里的速度扩大 干旱作为一种自然危害 其对农作物的影响相当于其他自然灾 害的总和 马铃薯栽培范围遍布全世界 从北纬 71 至南纬 40 之间的绝大多数国家都 有马铃薯栽培 近几年 随着栽培技术的改进和脱毒种薯的应用 全球马铃薯 的产量呈明显递增趋势 目前马铃薯年产量约 3 亿吨 其中一半以上供人类食 用 马铃薯块茎中含有 8 29 的淀粉及蛋白质 矿物质和维生素等多种营养成 分 丰产性好 适应性广 已逐步成为人类重要的粮食 蔬菜 饲料和工业原 料 可以说马铃薯将会是 21 世纪最有发展前景的主要农作物之一 我国水资源的总量不算少 但按 2001 年人口统计 我国人均水资源量 2171m3 相当于世界人均水资源占有量的 1 4 居世界 109 位 属 13 个贫水国 之一 2 亩均水资源量为 1442m3 相当于世界平均亩均 2353m3的 61 中国干旱半干旱地区约占国土总面积的 1 2 干旱严重制约着我国的农业生 产 我国马铃薯栽培区划中除中原春秋两季作区和南方冬作区有水浇条件外 其他如北方一作区等很少有灌溉设施 多为旱作地区 其中山西省 河北坝上 地区的马铃薯主要分布在丘陵地区 十年九春旱是这些地区马铃薯生产的主要 问题 西北地区气候干燥 局部地区马铃薯生育期间降雨量偏少 时呈旱象 马铃薯产量很不稳定 马铃薯作为一种粮菜兼用作物 有很高的营养价值和经济价值 却对水分 亏缺和高温非常敏感 3 缺乏有效的耐旱机理 经常因干旱造成严重的减产 干 旱严重影响着马铃薯的产量 严重时可造成减产 50 以上 此外还可引起一系 列的不良反应 造成马铃薯薯块品质的下降 如马铃薯在结薯阶段的水分亏缺 青海大学硕士学位论文 第 1 章 文献综述 2 能不同程度地影响到块茎的形状 干物质和还原糖含量等 在块茎膨大期的短 期干旱 常使块茎产生二次生长 如块茎顶端伸出匍匐茎 其顶端又膨大形成 子薯 或形成链状结薯 或芽眼出凸出形成节瘤状块茎 或块茎周皮龟裂 或 块茎形成尖端畸形等 4 面对影响马铃薯产业发展的最大的自然制约因素 干旱问题 进行马铃薯抗 旱性研究显得尤为重要 开展马铃薯品种的抗旱性鉴定 及相关抗旱基因的研 究工作对于选育优异的抗旱品种有很大的指导意义 而抗旱品种的选育对马铃 薯产量的提高和品质改善均有重要意义 本研究对马铃薯品种或资源的抗旱性 进行鉴定 为育种工作筛选出优良的抗旱亲本 并建立一套快速准确的抗旱评 价体系 为育种后代的早期鉴定提供技术方法支持 同时从分子机理方面揭示 并分析马铃薯各品种抗旱性差异 探究抗旱机理 1 2 干旱胁迫对马铃薯的危害 干旱胁迫对马铃薯的生长和生理代谢均能够产生影响 影响程度与干旱胁 迫的程度有关 干旱胁迫导致马铃薯生长受到抑制 光合作用降低 膜系统损 伤 物质能量代谢失调 营养失调 严重影响着马铃薯的产量和薯块品质 1 2 1 干旱对马铃薯产量的影响 自然界中 作物在生长期间可能同时或者不同时间受到多种不同的非生物 胁迫 导致了约有 2 3 的产量损失 5 6 不同的环境类型决定着植物种类的分布 7 10 一般来说 作物的生长发育在很大程度上依赖于水的供应 11 12 干旱是一 种常见的不利的环境条件 13 17 会抑制甚至完全停止植物的部分生理过程 13 严重影响着植物的生存和生长发育 18 相比于其他作物 马铃薯属于对水分亏 缺敏感型的植物 干旱是限制马铃薯产量的主要因素 19 有研究表明马铃薯植 株在土壤水势降到 25 kpa 20 或者土壤相对田间持水量低于 50 时 21 就会遭 受干旱胁迫 并且马铃薯从出苗到成熟各个阶段对干旱胁迫敏感 22 在幼苗期到成熟期之间 土壤水分含量高低对马铃薯薯块生长发育十分重 要 23 干旱可以通过减少薯块数 薯块大小或者同时减少薯数甚至大小而降低 产量 24 25 干旱导致马铃薯薯块数减少 但是不同生育时期干旱胁迫对结薯数具 青海大学硕士学位论文 第 1 章 文献综述 3 有不相同的影响 如果干旱发生在出苗期至块茎形成前 结薯数明显减少 12 20 23 26 从而降低单株产量 27 如果发生在开花期 28 或块茎形成后 则对结薯 数没有显著的影响 mackerron 等 20 发现干旱发生在块茎形成期不会减少单株结 薯数 haverkort 等 26 研究发现匍匐茎的发生和生长与薯块形成和生长是由不同 的机制控制的 早期干旱导致匍匐茎数量的减少 从而降低单株产量 在块茎 生长后期遭受干旱 会导致植株从块茎中抽取水分 导致块茎干物质含量增加 而产量降低 107 1 2 2 干旱胁迫下马铃薯植株的生理生化反应 1 2 2 1 气孔调节和渗透作用 气孔是 co2进入植物体和水蒸气逸出植物体的通道 干旱条件下由于叶片 水势降低 脱落酸 aba 积累以及大气湿度低等原因导致气孔关闭 气孔阻 力增大 以减少或切断外界的水分散失 路丙社 29 研究表明光合速率的下降是 受气孔因素和非气孔因素的双重限制 轻度干旱胁迫下气孔限制是光合速率下 降的主要原因 而严重干旱胁迫下非气孔限制是光合速率下降的主要原因 所 以气孔作为叶片与外界环境水分和气体交换的门户 它不仅影响植物的光合作 用和蒸腾作用 而且与抗旱性相关 气孔调节是水分胁迫下植物适应环境 抵 抗干旱的机制之一 30 干旱胁迫条件下 增强细胞渗透调节能力的关键是细胞内渗透物质的主动 积累 在逆境下 植物积累的可溶性物质主要有两大类 一类是细胞中合成的 小分子有机物质 如游离脯氨酸 甜菜碱 可溶性糖 甘露醇 31 等 另一类是 从外界环境吸收进入细胞的无机盐 如 k na mg2 ca2 cl 等 其中有 关脯氨酸 可溶性糖 甜菜碱等研究报道较多 脯氨酸是水溶性最大的种氨基 酸 易溶于水且有较强的水合能力 脯氨酸的积累有助于植物细胞或组织持水 增强其抗旱性 32 甜菜碱是一种生理抗旱剂 也是一种重要的有机渗透调节物 质 通过生理调节作用减缓由于干旱胁迫对植物造成的伤害 植物中甜菜碱主 要有 12 种 33 近年有研究结果指出 甜菜碱可能是某些植物的主要渗透调节物 质之一 30 其依据是渗透胁迫条件下 植物体内的甜菜碱醛脱氢酶活性升高 并在细胞质中积累甜菜碱 33 37 从而提高植物在干旱胁迫下的适应能力 可溶 青海大学硕士学位论文 第 1 章 文献综述 4 性糖也是一种有效的渗透调节保护剂 可溶性糖主要有蔗糖 葡萄糖 果糖和 半乳糖等 38 可溶性糖含量的增加被普遍看作是植物对干旱胁迫的一种适应机 制 它的积累一方面是由于干旱胁迫造成的伤害 使光合产物不能被植物正常 利用 是细胞受到严重伤害的一种表现 另一方面也可能是植物主动积累调节 其渗透势以保持体内水分 在干旱胁迫条件下生存的一种生理适应方式 37 无 机的渗透调节物质对植物抵御逆境所起的作用也是很强的 研究较多的是钾离 子 干旱条件下 k 能调节气孔运动 实现渗透调节 维持细胞内膨压与电荷 平衡 同时能够维持和调节干旱条件下许多生理生化过程与代谢平衡之间的关 系 从而增强作物的抗旱性 渗透调节是作物在面对干旱胁迫的一种自适应调 节方式 具有十分重要的意义 1 2 2 2 光合作用 干旱胁迫影响作物的光合生理过程 38 干旱胁迫使作物净光合速率和蒸腾 速率下降 叶绿素含量减少 胞间 co2浓度上升 作物叶片的这些生理生化方 面的变化与干旱胁迫程度和作物的抗旱性有关 也因作物类型 品种 生育期 不同而有变化 39 李文卿 40 对甘薯 葛晋纲 41 对草种的研究表明 干旱胁迫引 起了叶片水势和蒸腾速率下降 叶绿素总量下降 气孔导度和光合速率下降 前者的胞间 co2浓度表现出先下降后上升的趋势 而后者的细胞间隙 co2浓度 显著下降 郭程瑾等 42 对小麦的干旱胁迫则引起细胞间隙 co2浓度升高 郭晓 维 39 的研究结果表明干旱胁迫导致小麦叶片叶绿素含量降低 抗旱性较强的品 种叶绿素含量变化较小 许世昌 43 的研究表明 干旱胁迫下玉米叶片光合速率 下降 玉米叶片气孔导度因干旱胁迫而下降 干旱胁迫下气孔导度的下降通过 影响 co2的吸收而影响光合作用 最后影响到植物体的干物质积累量 1 2 2 3 膜系统损伤及活性氧代谢 膜系统是细胞结构的组织形式 也是细胞生命活动的结构基础 在干旱条 件下 植物细胞遭受多方面的伤害 44 自由基伤害学说 45 认为 在正常条件下 自由基活性氧的产生与消除处于平衡状态 46 47 植物不受其害 但受到干旱胁迫 后 植物叶片出现萎蔫 48 随着干旱胁迫时间延长或者程度加重 干旱就会通 过多种途径 大量产生积累活性氧和自由基 46 侵袭膜系统 导致膜过氧化 45 47 青海大学硕士学位论文 第 1 章 文献综述 5 产生和积累膜脂过氧化产物丙二醛 mda 并且增加质膜透性 44 45 49 53 破坏 叶绿体膜系统 叶绿体的基质片层和间质片层结构解体 54 进而使膜系统遭到 损伤 甚至不可修复 55 最后细胞基质中的溶质 总电解质 钾 磷 糖 氨基 酸 蛋白 发生渗漏 56 57 严重时导致植物死亡 47 58 植物体内活性氧的清除是 由两大类物质控制的 一类是保护酶类 包括超氧化物歧化酶 super oxidase dimutase sod 过氧化物酶 peroxidase pod 过氧化氢酶 catalase cat 等 另一类是抗氧化物质 包括抗坏血酸 类胡萝卜素 谷胱甘肽和黄酮等 酶保护系统和非酶保护系统协同作用完成活性氧的清除 1 3 马铃薯抗旱性评价相关研究进展 1 3 1 抗旱鉴定的方法 目前常用于抗旱性鉴定对植株进行处理的方法主要有以下几种 田间水分控 制 温室盆栽法 人工气候箱法 peg 胁迫 其中 田间水分控制采用遮雨棚 59 等设施控制水分 试验环境接近大田 该法比较适宜 温室法虽已得到广泛应 用 但温室与大田的环境差异会造成较大误差 人工气候室法 试验结果可靠 重复性好 可操作性强 但难以大批量进行测定 peg 胁迫则主要用于实验室 室内的苗期胁迫 60 测定一些生化指标 与大田环境差异同样很大 另外 根 据对植物进行干旱处理的方法不同 抗旱性鉴定方法又可分为土壤干旱 大气 干旱和高渗溶液 3 种鉴定方法 1 3 2 抗旱鉴定的有关指标 抗旱性鉴定的目的之一是培养干旱条件下能够高产稳产的品种 因此 干 旱条件下作物的产量和减产百分率常被用作抗旱性鉴定的一项重要指标 抗旱 系数是目前公认的抗旱性鉴定综合指标 它是干旱胁迫下产量与正常供水条件 下产量的比值 它作为一种产量指标 常与多种形态指标和生理生化指标相结 合用于马铃薯抗旱性鉴定 形态指标包括 发芽能力 幼苗存活与生长状况 根长或扎根深度和数量多少 根冠比大小 根系拉力 叶片大小 角质层厚度 气孔多少 气孔下陷维管束紧密度 导管直径大小 芽鞘长度等 生理生化指 青海大学硕士学位论文 第 1 章 文献综述 6 标包括 叶片临界饱和亏 根冠淀粉水解状况 花粉败育率 叶绿素稳定性 气孔开度 aba 叶水势 耐高温承受力和冠层温度气孔调节 膜透性 叶片 导性 sod 酶活性 渗透调节能力 其包括 k ca 无机盐 脯氨酸 甘露 醇 甜菜碱 糖等物质含量的调节 1 3 3 国外抗旱评价研究进展 deblonde 等 61 在块茎形成前测定了 6 个品种在干旱条件下茎高 叶片数 叶长 发现这些指标对水分较敏感 在干旱条件下产量和块茎数都明显减少 认为它们可作为抗旱性鉴定的指标 ouiam 等 62 通过研究发现干旱条件下匍匐 茎上不定根数量减少并与根干重成负相关 在田间条件下块茎产量明显与根重 相关 认为匍匐茎上不定根数量可作为抗旱性鉴定的指标 lahlou 等 63 调查了 4 个不同成熟期的马铃薯栽培种对干旱的抵抗能力 干旱可减少产量 11 53 干旱减少了叶片的干重 早熟品种在干旱时减少块茎数 而晚熟品种则减少叶 面积和叶面积指数 那些在干旱条件下最初 3 周块茎保持较好生长的品种可获 得较好产量 认为早熟和晚熟品种对干旱的反应机制不同 但其机理还不清楚 richards 64 研究了在干旱条件下提高产量的方法 认为干旱时的开花数 蒸腾效 率 早期发育叶面积可作为抗旱育种的选择指标 jefferies 67 采用生理指标为主 的参数评价马铃薯的抗旱性 通过试验发现在一般情况下 正常浇水和轻微干旱 条件下 增加根长和增加水分利用效率并不能增加产量 只有在严重缺水条件下 增加根长和增加水分利用效率才增加产量 认为在严重缺水条件下根系长度和 水分利用效率可作为抗旱性评价的指标 ekanayake 等 68 以 250 个不同马铃薯品 种为试验材料 测定了定植 45 d 后各参试品种的产量 试验结果表明在干旱条 件下马铃薯产量与根系拉力呈正相关 认为根系拉力可作为抗旱性评价的指标 mescht 等 65 通过测定干旱条件下 12 个马铃薯品种叶绿素荧光值和叶绿素 a 叶 绿素 b 含量发现 叶绿素荧光值仅能作为早熟品种抗旱性的指标 叶绿素 a 叶 绿素 b 的比值可作为早熟 中熟 晚熟马铃薯品种干旱 4 周内的抗旱性的指标 ranalli 等 66 测定了种植在田间的包括 desiree 和 5 个无性系在内的 6 个基因型马 铃薯正常浇水和干旱条件下叶片叶绿素荧光和天棚温度 认为叶绿素荧光和天 棚温度可作为筛选马铃薯种质资源的工具 青海大学硕士学位论文 第 1 章 文献综述 7 1 3 4 国内抗旱评价研究进展 杨明君和樊民夫 69 1992 年研究结果为 旱作马铃薯根系拉力与冠层覆盖度 及块茎产量均呈极显著正相关 即根系拉力越大 冠层越旺盛 块茎产量越高 认为根系拉力和冠层覆盖度可作为干旱条件下选择块茎高产的有效指标 刘玲 玲等 70 对水分胁迫下马铃薯叶片部分物质和能量代谢指标的研究结果表明 在 干旱胁迫下叶片中可溶性蛋白含量明显增加 叶绿素 a 叶绿素 b 总叶绿素含 量及叶绿素 a b 比值与对照相比均有所下降 atp 含量有增有减 但品种抗旱性 愈强 atp 含量愈高 叶片中可溶性蛋白含量 叶绿素 a b 比值 atp 含量与品 种抗旱性之间的相关性较高 骆敬等 71 依据水分胁迫对不同品种可溶性糖 游 离脯氨酸 丙二醛含量的影响 通过盆栽控水测定了贵州地区的几个品种在干 旱胁迫下这几种物质含量的变化 分析了各品种的抗旱性强弱 宋志荣 72 对马 铃薯在干旱胁迫下叶片内脂质过氧化作用产物 mda 的积累与 asa 含量 sod 和 pod 活性的关系做了研究 发现抗旱性强的品种质膜透性 mda 含量增加 幅度较小 pro 含量增加幅度大 asa 含量降低幅度较小 sod 和 pod 活性较 高 抗旱性弱的品种反之 认为这些指标及变化可以作为评价马铃薯抗旱能力 的依据 1 4 sod 基因及其研究现状 sod 是广泛存在于生物体中的一类金属酶 73 按金属辅基的不同主要可分 为 cu zn sod fe sod 和 mn sod sod 酶属于植物体内抗氧化酶系统中的一 种酶类 它通过催化反应将生物体内多余的并对细胞破坏力极强的超氧阴离子 自由基岐化产生过氧化氢和氧气 过氧化氢随后被体内的过氧化氢酶 cat 或过 氧化物酶 pod 分解掉 从而解除 o2 所造成的氧化胁迫 因此在维持生物体内 超氧阴离子自由基的产生与消除的动态平衡起着重要作用 74 目前人们已经对 它进行了广泛的研究 它是目前 2000 多种酶中研究报道最多的一种 也是当今 生物学前沿研究的主要课题之一 超氧化物歧化酶属于功能基因中的毒性降解酶类 是植物体内清除活性氧 使细胞免受毒害的较为重要的抗氧化酶 近年来 有关植物体 sod 基因表达差 异的研究日益增多 几种 sod 基因的 cdna 已从不同植物中得到克隆 并用来 青海大学硕士学位论文 第 1 章 文献综述 8 转化 成功获得 sod 活性增强的转基因植株 而且已经有研究者证实了 sod 在转基因烟草 苜蓿 马铃薯和棉花叶绿体中的过量表达 提高了它们对氧化 胁迫的耐受性 在苜蓿线粒体和马铃薯细胞质中 sod 的过量表达也具有同样的 效果 75 1996 年 mckersie 等人 77 将烟草 nicotiana rustica 的 mn sod cdna 导入苜蓿 medicago truncatula 转基因苜蓿中 mn sod 的表达通过调控叶绿 素荧光 电解质渗漏 茎尖再生来减弱水分亏缺的伤害 增强了苜蓿的抗旱能 力 samis k 也将 mn sod 基因转移入紫花苜蓿中 78 研究结果表明转基因植 株在逆境的抗性和生物产量上均有所提高 此外 研究者们把拟南芥的 fe sod 基因 番茄的 cu zn sod 基因分别转入烟草 76 结果表明这些基因的过量表达 均使得植株抵抗干旱引起的氧化胁迫能力增强 众多试验研究表明 sod 基因 与植物的抗旱性强弱有着密切的关系 研究马铃薯该基因在水分胁迫下的表达 情况 在农作物的抗旱乃至抗逆育种中均具有重要意义 1 5 基因表达分析方法的研究现状 高等真核生物的基因组一般具有 80 000 100 000 个基因 而每一个细胞大 约只表达其中的 15 79 生命活动的多样性是由基因在不同细胞间 不同生长 阶段的选择性表达实现的 如发育与分化 衰老与死亡等 生物的遗传信息主 要贮存于 dna 碱基序列中 但 dna 并不直接决定蛋白质的合成 而是通过 mrna 把 dna 上的遗传信息精确无误地转录下来 再由 mrna 的碱基顺序决 定蛋白质的氨基酸顺序 最终完成基因遗传信息的传递 mrna 是生命活动的 直接记录者 因此 转录水平上研究基因差异表达更有效 一般运用以下分析 方法 cdna 微阵列 cdna microarrays 代表性差异分析 representational difference analysis rda est 抑制消减杂交 suppression subtractive hybridization ssh 等 可以在 2 个或多个样品之间对几乎所有基因进行高通量 的差异表达分析 在分析少数几个基因的表达情况或者差异表达基因的验证时 一些常规的基因表达分析方法会被用到 如实时荧光定量 pcr 技术 实时荧光定量 pcr 技术即 real time pcr 技术是美国 applied biosystems 公 司在 1996 年推出 使得原来基于凝胶的低通量 pcr 分析技术发展为一种高通量 的荧光分析技术 实现了 pcr 从定性到定量的飞跃 与常规 pcr 相比 它具有 特异性强 高准确性 有效解决 pcr 污染问题等特点 real time pcr 常用的两 青海大学硕士学位论文 第 1 章 文献综述 9 种方法为 taqman probe 探针法 和 sybr green 荧光染料掺入法 taqman 探针法是在 pcr 扩增时加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针 每扩 增一条 dna 链 就有一个荧光分子形成 实现了荧光信号的累积与 pcr 产物 形成完全同步 通常采用荧光染料掺入法 此法由于它与所有的双链 dna 相结 合 不必因为模板不同而特别定制 因此设计的程序通用性好 且价格相对较 低 sybr green 是一种结合于小沟中的双链 dna 结合染料 与双链 dna 结 合后 其荧光信号大大增强 在 pcr 反应体系中 加入过量 sybr 荧光染料 sybr 荧光染料特异性地掺入 dna 双链后 发射荧光信号 而不掺入链中的 sybr 染料分子不会发射任何荧光信号 从而保证荧光信号的增加与 pcr 产物 的增加完全同步 同时 可以指示双链 dna 熔点的性质 通过熔点曲线分析扩 增产物和引物二聚体 区分特异与非特异扩增 有助于分析定量结果的可靠性 因此 运用 real time pcr 技术 可以对 dna rna 样品进行定性和定量分析 定量分析包括绝对定量和相对定量 绝对定量分析可以知道某个样本中特异基 因的拷贝数和浓度 而相对定量则是对不同方式处理或者不同组织样本中目的 基因表达水平进行比较 由于实时荧光定量 pcr 技术具有快速 可重复性好和高灵敏度等优点 因 此其在基因表达的定量研究中获得广泛应用 80 81 1 6 本文研究的主要内容及主要贡献 1 6 1 主要研究内容 1 研究产量指标在大田干旱胁迫试验中用于马铃薯品种抗旱性鉴定的评价方 法 及部分品种抗旱性的评价 为评价抗旱性提供可靠的技术方法及流程 2 研究了叶片含水量 离体叶片失水速率 脯氨酸 丙二醛 sod 酶活性在 一定的室内干旱胁迫程度下的变化情况 根据各指标在胁迫下的反映情况 探 究马铃薯植株对水分胁迫的生理生化反应 3 通过对青薯 9 号和夏波蒂品种的 fe sod 和 cu zn sod 基因在胁迫下的表 达量变化检测 建立该基因荧光定量 pcr 检测体系 并对比分析了这两个抗旱 性有差异的品种在干旱胁迫下 sod 基因的表达情况 青海大学硕士学位论文 第 1 章 文献综述 10 1 6 2 各章节介绍 第 1 章为文献综述 简述了抗旱性育种工作的研究背景及意义 综述了干 旱胁迫对马铃薯的产量及品质的影响 干旱胁迫影响马铃薯植株的生理原因 抗旱评价相关指标的概括 国内外抗旱评价相关研究进展 sod 基因的研究概 况和荧光定量 pcr 技术概况 最后是本文的主要内容概况 第 2 章是大田旱棚胁迫试验 首先列举了供试的 18 个品种名称 之后介绍 了大田试验的方法及工作流程 最后得出对 18 个马铃薯品种的抗旱性评价 结 果是西北地区的主栽品种具有较强的抗旱性 而在生产实践中表现不抗旱的品 种排名靠后 所得结果与生产实际较为符合 第 3 章是室内盆栽人工控水试验 本实验供试品种为 5 个 为青薯 9 号 克新 19 青薯 168 夏波蒂 脱毒 175 介绍了盆栽控水方法 土壤含水量和各 生理生化指标的测定方法 测定了在本实验控水条件下各品种的叶片含水量 丙二醛 脯氨酸 sod 酶活 离体叶片失水速率的变化情况 并运用隶属函数 法对 5 个马铃薯品种的抗旱生理强弱进行排名 第 4 章是分子实验部分 运用荧光定量 pcr 技术对室内盆栽干旱胁迫试验 中的抗旱性较强的青薯 9 号和较弱夏波蒂品种的叶片 sod 基因表达量进行检 测 研究了 cu zn sod 和 fe sod 基因表达调控间的关系 第 5 章对本文研究工作进行讨论 1 6 3 本文主要贡献 本研究通过大田旱棚胁迫试验得出了田间品种抗旱性评价的一套方法 为 田间育种工作提供技术支持 并得出 18 个马铃薯品种的抗旱性评价结果 室内 盆栽控水试验研究了 5 个品种对干旱胁迫的生理生化反应 明了了马铃薯植株 对干旱胁迫的反应机制 为抗旱生理评价提供依据 最后对两种 sod 基因的表 达量检测 为该基因表达量测定体系奠定基础 提出了 fe sod 基因表达和 cu zn sod 在马铃薯植株体内表达调控量之间的关系 提出 fe sod 基因表达对 逆境胁迫具有更重要的作用 为更深一步研究 sod 基因表达调控提供技术和理 论支持 青海大学硕士学位论文 第 2 章 大田旱棚胁迫品种抗旱性鉴定试验 11 第 2 章 大田旱棚胁迫品种抗旱性鉴定试验 马铃薯是重要的粮食 蔬菜及经济作物 栽培范围遍布全球 由于它自身 的优势 使其播种面积不断扩大 近年来我国马铃薯的种植面积得到迅速发展 2004 年我国马铃薯种植面积占全球种植面积的 20 以上 然而干旱严重影响着 马铃薯生产 提高马铃薯品种的抗旱性 已成为马铃薯育种工作的重大课题 为科学评价马铃薯品种及种质资源的抗旱性 有效提高抗旱品种及种质资源的 利用效率 促进我国马铃薯生产的发展 亟需建立马铃薯抗旱性鉴定技术方法 与指标 植物体的生长发育在很大程度上依赖于水分的供应 干旱是一种常见的非生 物胁迫 会抑制甚至完全停止植物的生理过程 严重影响着植物的生存和生长 发育 马铃薯作为一种粮菜兼用作物 有很高的营养价值和经济价值 却对水 分亏缺和高温非常敏感 2 前人指出马铃薯植株在土壤水势降到 25kpa 或者土 壤相对田间持水量低于 50 时 19 20 就会遭受干旱胁迫 并且马铃薯从出苗到 成熟各个阶段对干旱胁迫敏感 21 抗旱性鉴定的目的之一是培养干旱条件下能 够高产 稳产的品种 因此 干旱条件下作物的产量和减产百分率常被用作抗 旱性鉴定的一项重要指标 抗旱系数是目前公认的抗旱性鉴定综合指标 2 1 试验内容 2 1 1 试验材料 试验材料为 18 个马铃薯品种 见表 2 1 其中 6 个为青海地区主栽品种 3 个为黑龙江品种 2 个河北品种 2 个甘肃品种 1 个宁夏品种 1 个西藏品种 3 个国外品种 青海大学硕士学位论文 第 2 章 大田旱棚胁迫品种抗旱性鉴定试验 12 表 2 1 供试 18 个马铃薯品种及其来源 品种名称 品种来源 品种名称 品种来源 品种名称 品种来源 克新 1 号 黑龙江 民薯 2 号 青海 大西洋 国外 克新 19 号 黑龙江 乐薯 1 号 青海 夏波蒂 国外 克新 18 号 黑龙江 青薯 9 号 青海 宁薯 12 号 宁夏 下寨 65 青海 冀张薯 10 号 河北 昌果红 西藏 脱毒 175 青海 中薯 3 号 河北 陇薯 3 号 甘肃 费乌瑞它 国外 青薯 2 号 青海 陇薯 6 号 甘肃 2 1 2 试验方法 2 1 2 1 试验地种植安排 5 月 17 18 日在湟源县马铃薯高山试验站网棚中种植 共定植 18 个品种 种植区分为两个大区 一个为旱区 一个为自然降雨灌溉区 对照 每个大区 中按照随机区组设计来安排这 18 个品种 设置 3 个重复 每个品种种植一行 即为一个小区 小区面积为 4 m 0 7 m 每个小区定植 18 株马铃薯 马铃薯的 种植行距为 70 cm 在地头和每个重复之间种植青薯 9 号一行作为保护行 其中 在旱区隔开种植边缘半米处挖开 1 5 米的深沟 放入油毛毡以隔离周围水分 防 止周边水分渗入 湟源县马铃薯高山试验站海拔 2 800 m 年降雨量 408 mm 左右 年平均气 温 3 4 种植前茬作物为油菜 定植前对所有田地进行深翻和施肥 2 1 2 2 加盖遮雨棚 待出苗一周后 7 月 2 日干旱池加盖遮雨棚 遮雨棚采用透光性好的塑料膜 在旱池长边将塑料薄膜从顶棚拉下 埋入土中 两端的棚顶延伸出种植区 1 m 长 防止周围雨水的洒入 加盖遮雨棚直至马铃薯收获 青海大学硕士学位论文 第 2 章 大田旱棚胁迫品种抗旱性鉴定试验 13 2 1 2 3 测定土壤水势 采用国产 trs 土壤水势测定仪测定土壤水势 将水势测定仪的陶瓷探头 埋入 35cm 深的土壤中 干旱区和自然降雨对照区中每个重复选一个点 加盖遮 雨棚后 16 天开始进行测定 之后每隔 5 天测定一次 2 1 2 4 马铃薯收获及产量校正 9 月 29 日 10 月 1 日收获马铃薯 用铁锹挖出马铃薯 全部收获 测定实产 记录所挖各小区马铃薯株数 每个小区装一袋 各小区的产量采用 15 公斤的杆 秤在马铃薯入袋后立即进行测定 记录产量 收获完毕后 从干旱组和灌溉组中各选出 3 袋马铃薯 去除袋中和薯块上 的土 再次称重 求平均值 去土后的重量与原重的比值即为校正系数 k 干旱 组的校正系数为 0 99 对照组的校正系数为 0 88 2 1 2 5 抗旱系数 dti 的计算 按如下公式计算 dti y1 y2 y1 2 此公式引自国际马铃薯中心 式 2 1 其中 y1为某品种的旱池产量 y2为某品种对照区产量 y1 为对照区所有品种 总的平均产量 2 2 结果与分析 2 2 1 土壤水势变化 青海大学硕士学位论文 第 2 章 大田旱棚胁迫品种抗旱性鉴定试验 14 7 月 2 日加盖遮雨棚后第 16 天开始测定土壤水势 之后每隔 5 天测定土壤 水势 随着天数的增加土壤水势的变化如图 2 1 图 2 1 田间 35cm 土层土壤水势值 fig 2 1 35cm soil water potential in the field 旱区和自然降雨灌溉区的土壤水势变化线图可以明显的看到干旱组的土壤 水势在不断上升 水势负值绝对值越大说明土壤水分含量越少 植株生长的土 壤环境越旱 前人研究认为土壤水势达到 25kpa 马铃薯植株将受到干旱胁迫 从土壤水势的变化我们可以确定旱区相对于灌溉区的马铃薯生长环境上存在一 个较明显的水分供给差异 且已经受到干旱胁迫 2 2 2 供试马铃薯品种的推广种植区域与品种抗旱性 试验的 18 个马铃薯品种一部分为青海主栽品种 一部分为甘肃 宁夏 黑 龙江 西藏等地的主栽品种 还有一些为加工食用型品种 它们的种植需要较 好的肥水条件 如夏波蒂 大西洋 费乌瑞它 其中乐薯 1 号是青海省乐都县 引自甘肃的品种 适宜青海省乐都县浅脑山旱地种植 并在生产实践中表现出 良好的产量 陇薯 6 号和陇薯 3 号不仅适宜甘肃省高寒阴湿 二阴地区及半干 旱地区推广种植 还适宜宁夏固原地区 青海海南州 河北张家口地区及承德 地区 内蒙古乌盟 武川地区等北方一季作地区推广种植 青薯 9 号是青海省 35cm 深 土 壤 水 势 kpa 青海大学硕士学位论文 第 2 章 大田旱棚胁迫品种抗旱性鉴定试验 15 农科院根据青海浅山地区的气候特点 培育出的抗旱 高产 优质 高效 全 营养 菜用型 加工型兼备的杂交马铃薯新品种 并通过了青海省农作物品种 审定委员会审定 在青海东南部 宁夏南部 甘肃中部一季作区推广种植 下 寨 65 脱毒 175 青薯 2 号 民薯 2 号为青海省选育的并在青海地区推广种植 表 2 1 18 个马铃薯品种的产量及抗旱系数 tabel 2 1 yield and drought resistance coefficient of 18 potato cultivar 品种 variety 单株块茎重 g plant 抗旱系数 dti 对照组 ck 干旱组 drought 乐薯 1 号 714 143 332 33 1 134 陇薯 6