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第九章质谱分析法 massspectrometry ms 9 1质谱分析的基本原理9 2质谱仪9 3质谱中的离子类型9 4质谱分析法的应用9 5拓展视窗 生物大分子的质谱分析 9 1质谱分析的基本原理 9 1 1质谱分析的基本原理进样系统将样品导入离子源 在离子源内试样分子电离成带正荷的离子 正离子进入加速盘及狭缝区加速 准直后 射入质量分析器的分离管 当快速运动的粒子通过磁场时 不同质荷比 质量电荷比 m z 的离子在磁场中发生偏转 按不同的方向运动而得以分离 由质量分析器分离的离子被离子检测器所检测和记录 由离子源中产生的各种质荷比m z离子 在离子加速区被加速时 离子在电场中的势能被转化为动能 即 v 加速后离子运动速度 u 加速电压 1 8kv z 离子电荷数m 离子质量 质量为m电荷为z的离子以速度v进入质量分析器后 在高真空的分析器中 离子受到磁场力的作用 将在与磁场垂直的平面内 作匀速圆周运动 离子做圆周运动所需的向心力等于其在磁场中所受到的洛伦兹力hzv 即 或式中 h为磁场强度 r离子偏转半径 可以得到下式 或 磁场中离子运动半径r由离子质荷比m z 离子室加速电压u 质量分析器磁场强度h三者决定 当检测器位置固定 偏转半径r为确定值 且加速电压u和磁场强度h为一固定值时 只有质荷比m z满足公式的离子可以通过质量分析器的狭缝到达检测器得以检测 如果改变离子源的加速电压u 电扫描 或质量分析器的磁场强度h 磁扫描 离子的轨道半径就发生变化 不同质荷比的离子就可以在不同的磁场强度下先后通过质量分析器的狭缝 被检测器所检测 得到按质荷比m z从小到大排列的质谱 这就是质谱分析的原理 9 1 2质谱图常用的是棒状图 即质谱图 massspectrum 下图是多巴胺的质谱图 多巴胺的质谱图 质谱图中 横坐标为质荷比m z 纵坐标表示离子丰度 通常用相对强度或相对丰度表示 以最强峰的高度定为100 称为基峰 basepeak 见图中m z 124的峰 其他各峰的高度相对于基峰的高度即为其他离子的相对强度 图中除m z 153的多巴胺分子离子峰m 图中一般用m表示 以外 还有m z为30 36 51 77 123 124等许多丰度不等的离子峰也出现在质谱图中 这些是多巴胺的碎片离子峰 9 2质谱仪 9 2 1质谱仪的构成由进样系统 离子源 质量分析器 收集检测器 真空系统5个部分组成 1 进样系统引入试样的方法可分为直接进样和色谱联用系统进样 直接进样系统将气体 液体 固体试样 通过一定装置直接引入离子源的方法 有间隙式进样和探针杆直接进样方式 间隙式进样 用于气体或挥发性液体和固体试样 通过加热使试样管内的试样挥发至贮样器 真空度10 3pa 用阀切换将贮样器内的气态试样 通过小孔以分子流形式漏入真空度更高 10 5pa 的离子源 探针杆直接进样 用于沸点较高的液体和固体样品 探针杆长约25cm 杆尖带有一试样探针 试样杯 将探针杆的尖端插入质谱仪接近离子源后 加热升温 使样品气化为蒸气后被引入离子源 色谱联用进样系统质谱进样系统发展较快的是多种色谱 质谱联用技术 将气相 液相色谱的柱后流出物导入质谱的离子化器 经离子化后供质谱分析 其特点是可用于分析复杂试样的各种组份 2 离子源离子源是将样品的中性分子电离成离子 对于有机分子来说 在离子化的过程中 多会发生分子的裂解 形成各种质荷比的碎片离子 离子源性能决定了离子化效率 影响质谱仪灵敏度 而且决定分子裂解的方式和程度 也决定化合物质谱图的面貌 常见离子化方式有两种 气相离子源 样品在其中以气体的形式被离子化 气相离子源适合用于沸点低于500 c的热稳定性化合物 分子量小于103 解吸离子源 固态或液态试样不必经挥发过程而直接离子化 适用于分子量较高 非挥发性或热稳定性差的试样 按离子源能量强弱 可分成硬离子源和软离子源 气相离子源的离子化能量高 多产生质荷比小于分子离子的碎片离子 可得到分子官能团的信息 后者能量低 样品分子被电离后主要以分子离子形式存在 其质谱图相对简单 质谱仪常用的几种离子源 电子轰击源 electronimpactionization ei 通过电子束与气态的试样分子直接作用而导致分子电离甚至裂解 其结构示意如下图所示 样品以气态形式进入离子源 在离子化室内 电加热的灯丝产生电子 在灯丝 阴极 和阳极间加数十伏直流电压 电子加速形成高速电子束 能量为10 70ev 进入离子化区 高能电子和气态样品分子在离子源中心碰撞 使分子离解产生正离子 在推斥极和加速极之间的电场 引导正离子穿过狭缝 进入离子加速区 在加速极高电压 数千伏 作用下 正离子获得一定速度 从狭缝射入质量分析器 电子轰击电离源的能量高 化合物分子可以被打掉一个电子形成分子离子 并进一步发生化学键断裂和重排形成多种质荷比的正离子 使分子离子的丰度很低 电子轰击源是典型的硬离子源 其能提供有机化合物最丰富的结构信息 有较好的重现性 化学电离源 chemicalionization ci 化学电离源工作时需要向离子室引入一定压力 约102pa 的反应气 如甲烷 丙烷 异丁烷和氨气等 反应气在电子流的作用下电离 生成的离子通过质子交换使样品分子电离 现以甲烷作为反应气 说明化学电离的离子化过程 反应气受电子轰击 电离成离子 ch4 和ch3 很快与大量存在的ch4分子起反应 即 生成加合离子ch5 和c2h5 加合离子与试样分子 sh 发生下列反应 所生成的sh 和s 可进一步碎裂 形成质谱 化学电离通常得到准分子离子 如果样品分子的质子亲和势大于反应气的质子亲和势 则生成 m h 反之则生成 m h 3 质量分析器 massanalyzer 是质谱仪中分离不同质荷比离子的部件 根据工作原理的不同 主要有磁质谱分析器 飞行时间质谱分析器 四极杆质谱分析器 离子阱质谱分析器和傅里叶转换质谱分析器等 磁偏转式分析器 magnetic sectoranalyzer 利用外加磁场使得不同质荷比的离子在飞行过程中发生不同的角度偏转 使不同的离子得以分离 双聚焦分析器是在离子源和磁场之间增加一个静电分析器 通过串联电场及磁场共同作用 在实现不同质荷比离子的按不同方向聚焦的同时 还能实现质荷比相同但速度不同的离子聚焦 因此双聚焦分析器的分辨可以高达100 000 飞行时间质量分析器 timeofflightmassanalyzer tof 该质量分析器的离子分离是用非磁方式实现的 从离子源飞出的离子的动能基本一致 但因质量不同而有不同的速度v在从离子源射入分析器后 进入一长约1m的无电场与磁场的场漂移管 具有初速度为v的离子经过长度为l的漂移管所需的时间t l v 离子的飞行时间t由离子质荷比的平方根所决定 飞行时间分析器设备简单 不需要磁场和电场 扫描速度快 10 5 10 6s可记录整段质谱 灵敏度高 质量范围宽 可达160000甚至更高 适合与研究快速反应以及与色谱的联用 飞行时间分析器与新型软离子源基质辅助激光解吸离子化源 maldi 结合的质谱分析系统已成为生物大分子分析的强有力工具 四极杆质量分析器 quadrupolemassfilter 其结构为四根截面呈双曲面或圆形的棒状电极组成 四根电极中相对两根为一组 两组电极上加直流电压和射频交流电压 在一定的直流电压 交流电压和交流频率下 只有符合一定质荷比m z的离子能通过四极杆而达到检测器 而其他离子在运动过程中碰撞圆筒形电极而被 过滤 掉 当连续改变直流电压和交流电压大小或保持电压不变连续改变交流电的频率 就可以使不同质荷比m z的依次达到检测器而得到质谱图 质谱常用质量分析器的分析性能比较a a 以电喷雾为离子源 分析性能随仪器而异 b 括号中的数据为对应的分析物浓度 4 离子检测器常用检测器有电子倍增管 法拉第杯 闪烁计数器等 电子倍增管工作原理与光谱仪器中应用的光电倍增管相似 即一定能量的离子轰击阴极导致电子发射 电子在电场的作用下 依次轰击下一级电极而被放大 放大倍数可达105 108 检测器产生的电信号经放大后 由计算机处理 即可得到质谱图 5 真空系统质谱仪系统必须保持良好的真空状态 否则离子在飞行过程中就会与气体分子发生碰撞而产生干扰 导致质谱背景升高 质谱复杂化及分析误差 其中离子源的真空度要求10 5pa甚至更低 质量分析器的真空度要求更高 10 7pa 由于一般的机械真空泵所能达到的真空度有限 0 1pa 所以目前的质谱仪中多使用涡轮分子泵和机械真空泵配合使用 前者直接与离子源或质量分析器相连 抽出的气体再用机械泵排除出系统以外 9 2 2质谱仪的主要性能指标质谱仪性能主要有质量范围 分辨率和灵敏度 分辨率 resolution 分辨率表示质谱仪将两个相邻质量数离子分开的能力 一般以为 对两个相等强度的相邻峰 当两峰间的峰谷不大于其峰高10 时 表示两峰正好能分辨 其分辨率r为其中m1 m2为质量数 且m1 m2 故在两峰质量相差越小时 要求仪器分辨率越大 按分辨率高低 有机质谱仪可以分为低分辨率仪器 r 10 000 中分辨率仪器 r 10 000 50 000 和高分辨率仪器 r 50 000 其中傅立叶变换回旋共振质谱仪分辨率可达r 1000 000 而四极杆质谱仪和飞行时间质谱仪属于低分辨率质谱仪 灵敏度 sensitivity 灵敏度有绝对灵敏度 相对灵敏度和分析灵敏度之分 绝对灵敏度 仪器可以检测的最小试样量 相对灵敏度 质谱仪可以同时检测到的大组份与小组份的含量之比 分析灵敏度 输入仪器的试样量与仪器输出的信号之比 9 3质谱中的离子类型 在离子源尤其是能量较高的电子轰击离子源中 同一种分子可产生多种不同m z的离子 因而在质谱图中显示出不止一种离子峰 以a b c d代表四种元素 化合物abcd在离子源中可能发生以下离子化和裂解过程 1 分子离子 molecularion 分子失去一个电子而得到的离子称为分子离子 表示为m 分子离子峰所对应的m z值即为分子的相对分子量 几乎所有的有机分子都可以产生可辨别的分子离子峰 有机分子中 最容易失去电子的是杂原子上的孤对电子 其次是 电子 再者是 电子 所以 对于含o n s等杂原子的化合物 总是先在杂原子的孤对电子上失去一个电子 形成分子离子 如 式中氧原子上的 表示孤对电子失去一个电子生成的分子离子 当含有双键而无杂原子的化合物 双键裂解而失去一个电子 生成分子离子的电荷在双键碳上 可以表示为 或当难以判断分子离子的电荷位置时 可以表示为 如 2 碎片离子 fragmention 离子源中一些较高能量的分子离子 会通过进一步碎裂或重排释放能量 碎裂后产生的离子称为碎片离子 在各种m z的碎片离子峰中 强度最大的质谱峰称为基峰 它对应于最稳定的碎片离子 在有机化合物中 c h键往往比c c键稳定 所以烷烃的断裂一般发生在c c键之间 且较容易发生在支链上 形成正离子的稳定性顺序是叔碳 仲碳 伯碳 以下碎片是2 2 二甲基丁烷在高能离子源中可能的断裂形式 其可以形成较为稳定的m z 71和m z 57的叔碳碎片离子 3 亚稳离子峰 metastableion 具有一定运动速度的质量为m1的离子在离开离子源 进入质量分析器之前 因为碰撞等原因发生能量交换 有可能进一步分裂失去一中性碎片而形成质量为m2的离子 即由于一部分能量被质量为m的中性碎片带走 m2离子比在离子源中所形成的具有相同质量的离子能量小 它在磁场中产生较大的偏转 记录得到的峰m z较小 这种峰被称为亚稳离子峰 用m 表示 它的表观质量m 与m1 m2符合 4 重排离子峰 rearrangemention 分子离子裂解为碎片离子时 有一些碎片离子并非通过简单的键断裂而形成的 而是通过原子或基团的重排后再开裂而形成的一种特殊碎片离子 这些特殊的离子称为重排离子如芳香族化合物的裂解 可以先失去取代基 再形成稳定的且具有代表性的m z 91的 卓鎓 离子 有机化合物有多种类型的重排裂解 最为常见的是mclafferty重排 故称为麦氏重排 当化合物中含有不饱和中心c x x为o n s c 基团时 且与该基团相连的键上具有 氢原子 该氢原子可以转移到x原子上并发生 键的断裂 脱去一个中性分子 重排的通式可表示为 在酮 醛 链烯 酰胺 腈 酯 芳香族化合物 磷酸脂和亚硫酸酯的质谱上 都可以找到由麦氏重排产生的离子 5 同位素离子峰 isotopicion 有些元素具有天然存在的稳定同位素 化合物中含有这些元素时 这些元素的同位素就会以一定的丰度出现在化合物中 化合物电离由于同位素质量不同 在质谱图会同时出现强度不等的同位素离子峰 如m m 1或m 2的分子离子的同位素峰 而且m与m 1或m 2峰的峰高比例符合同位素的丰度比 由这些同位素形成的离子峰称为同位素离子峰 如溴有两种同位素79br和81br 在自然界的丰度各为50 54 和49 46 约1 1 因此 在含有一个溴原子的有机物质谱图中 常会出现质量数差2但峰高比为1 1的溴同位素峰 含一个氯原子 同位素丰度比35cl 37cl约为3 1 的有机化合物质谱图中 常有质量数差2 峰高近似3 1的氯同位素离子峰m 64 和m 2 66 以及碎片离子m z 49和m z 51 9 4质谱分析法的应用 9 4 1有机物的定性和结构分析纯物质的质谱图能提供有关分子结构的多种信息 因此 通过对所得到质谱图进行解析 可以对待分析物的进行定性分析或分子结构的鉴定 1 相对分子质量的确定确定有机化合物相对分子质量的依据是分子离子峰的m z值 除同位素峰以外 分子离子峰应该出现在质谱图的最高质量处 化合物分子离子峰的识别 一般可遵循以下几个原则 分子离子的质量数服从氮律 不含氮元素的化合物 其分子离子峰的质量数是偶数 含氮化合物 若分子内含奇数个氮原子 则质量是奇数 若含偶数个氮 则质量数为偶数 凡不符氮律的均不是分子离子峰 存在合理的碎片质量损失 有机化合物离子化过程中 离子可因化学键断裂而丢失h ch3 h2o c2h4等中性碎片 相应出现m 1 m 15 m 18 m 28等碎片离子 但不可能出现m 3至m 14 m 21至m 24范围内的碎片峰 可根据分子离子峰的质量数与邻近峰的质量数之差是否符合上述规则来鉴别拟定的分子离子峰是否合理 对于电子轰击源 当降低电子轰击电压时 分子离子峰应该增强 否则就不是分子离子峰 除以上三条原则外 还应注意某些化合物会形成质子化离子峰 m h 醚 酯 胺等 去质子化离子峰 m h 芳醛 醇等 及缔合离子峰 m r 如 m nh3 此时应进行必要校正 对可能出现的多电荷离子也应注意 在确定有机化合物相对分子质量时 要根据化合物的具体情况加以辨别 易从分子中脱去的常见中性碎片的质量数和结构 2 分子式的确定有机化合物的分子式 可通过高分辨质谱仪精确测定分子离子的分子量后来确定 高分辨质谱仪可以将质量测定值的有效数字精确至小数点后4 6位 因而能够区分质量相差千分之几个质量单位的分子 拜诺 beynon 等已经将c h o n原子可能组合的分子式的精确质量数 精确到小数点后三位数字 编排成表 因此 用高分辨质谱仪确定化合物的准确相对分子量后 与beynon的 质量与同位素丰度表 中的质量部分数据对照 就可以将分子式的可能范围大大缩小 再结合其他有关结构的信息 即可从少数几个可能的分子式中最终确定待分析物的分子式 解 设高分辨质谱测定误差是 0 006 所以所测分子离子质量的波动范围是150 0985 150 1105 查阅beynon表 质量数为150 小数部分在0 0985 0 1105范围内的分子式有4个 其中 第1和第3式含奇数n原子 与分子离子的质量数为偶数不相符 第2式的不饱和度u 0 是一饱和化合物 不含有羰基 与红外光谱测定不符 排除1 2 3后 所分析的化合物的分子式只可能是第4式 即为c10h14o 例1 用高分辨质谱测得某纯有机物样品的分子离子质量数为150 1045 该化合物的红外光谱出现强羰基吸收峰 1730cm 1 试利用beynon表 确定该有机物的分子式 解 由 im 2 im 4 44 说明可能有s cl br等元素 又由32 5 im 2 im 4 44 说明化合物含有1个s 而不含cl和br 故扣除s的贡献 剩余质量 104 32 72 im 1 im 6 45 0 85 5 60 im 2 im 4 77 4 44 0 33查阅beynon表 质量数为72的共有15种组合 与上述 im 1 im im 2 im 接近的列于下表中 经分析 只有c5h12的 im 1 im 最为接近 所以该有机物的化学式可能是c5h12s 例2 某有机化合物的分子量为104 im 1 im 6 45 im 2 im 4 77 试推测其化学结构式 3 未知化合物的结构解析对于未知化合物 在确定分子量和分子式后 要根据化合物的质谱裂解规律 推断其分子结构 很多情况下 仅仅依靠质谱还难以断定未知化合物的结构 常常需要配合紫外光谱 红外光谱 核磁共振谱信息对化合物的结构进行解析 质谱解析的一般程序如下 计算化合物的不饱和度 解析某些主要的碎片离子峰以及各碎片离子峰的关系 综合分子式 不饱和度 分子碎片的关系 推断可能的分子结构 结合紫外光谱 红外光谱 核磁共振谱的信息 进一步确认分子结构 查对标准图谱进行验证或参考相关图谱进行综合解析 例 某有机物 其分子质量数为100 经初步鉴定为一种酮 其质谱如下图所示 试推测其结构式 解 因已初步鉴定其为酮 所以为一含羰基c o的化合物 又其分子质量为100 故m z 100的就是其分子离子峰 m z 85的碎片离子可以判断为是断裂 ch3 质量为15 的碎片后所形成 m z 57的碎片离子可以判断为是断裂co 质量为28 的碎片后所形成 其中m z 57的碎片离子峰丰度很高 表示该碎片离子很稳定 也表示该碎片与分子的其他部分是比较容易断裂 这个碎片离子很可能是 该有机物的断裂过程可以进行如下的推断 所以 该有机物的结构式可能是ch3 co c ch3 3 对于m z为29和41的碎片离子峰 可以应用所学的碎片重排知识 进行可能的推测 例3 某化合物的分子式为c4h8o2 试根据其质谱图 推断其结构 解 计算该化合物的不饱和度 从图谱可以知道m z 88为分子离子峰 m z 60的为基峰 是羧酸麦氏重排后的特征峰 故此化合物为一羧酸 因为该化合物只有4各碳原子 所以是正丁酸 4 标准图谱的检索在一定条件下得到的纯未知物质谱图 可以通过与相同条件下的标准图谱对照来对其定性 应用最多的是