基因工程.doc

1、 基因工程：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。2、1973年斯坦福大学的S. Cohen小组把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。这是第一次成功的基因克隆实验。3、 基因工程的安全措施：（1）实验室的物理安全：P1-P4级实验室 （2）实验室的生物安全： EK1级的大肠杆菌、 EK2-EK3级大肠杆菌、（3） 载体的安全：应该是失去了自我迁移的能力。4、第一个基因重组做出的药物-胰岛素5、限制性核酸内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。6、修饰限制系统的两种酶：甲基化酶和限制性内切酶。(Dam甲基化酶在A碱基上引入,Dcm在C碱基上引入）7、 同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。分为完全同裂酶（识别位点和切点完全 相同）与不完全同裂酶（识别位点相同，但切点不同）Xma I 5-CCCGGG -3 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGGCCC-5 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。8、 限制性内切酶的命名：1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。9、 影响限制性内切酶活性的因素：DNA的纯度、DNA的甲基化程度、温度、缓冲液10、 如何实现局部消化：通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。11、 常用限制酶识别位点Pst I：CTGCAG GACGTC12、 两种DNA连接酶：（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。（2） T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。连接条件：（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA 3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量 实用温度:416 C。13、 DNA聚合酶的共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3OH端。14、 大肠杆菌DNA聚合酶 I的3个活性：53外切酶活性、聚合酶活性，35外切酶活性15、 DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件： 底物； Mg2+； 带有3OH游离端的引物； DNA模板 功能：标记探针（切口平移法）切口平移法步骤：纯化的DNA片断DNase I 制造单链切口一种a-32P-dNTP和dNTPs DNA Pol I 进行切口转移 （用到两种酶：DNase I 酶和DNA聚合酶I）16、 Klenow片段的来源：枯草杆菌蛋白酶 主要性质：具有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性。（失去了5-3外切酶活性）主要用途： 3端补平； DNA 3末端标记； cDNA第二链的合成（mRNA逆转录成cDNA的第一链，在有引物的条件下，利用Klenow合成cDNA的第二条链）17、 T4 DNA聚合酶的特点：当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。18、 放射性标记的优缺点 ( 非放射性标记的优点同下，缺点是对人无害，灵敏度低 ) 优点：制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。缺点：半衰期短、不易保存、对人体有害、要求在专门实验室操作。19、用非放射性标记的探针检测原理探针 DNA用生物素或地高辛标记；亲和素或地高辛抗体与酶偶联； 酶催化一个发光或显色反应；亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。20、 T7 DNA聚合酶的特点：持续合成能力强 用途：以大分子量DNA为模板的合成21、 逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。来源;RNA肿瘤病毒（普遍来自：鸟类骨髓母细胞瘤病毒） 活性：和多肽链 用途： 合成cDNA ，引物为oligo dT22、 末端脱氧核苷酸转移酶的特点：（1） 53DNA聚合酶活性；（2）需要3OH、二甲胂酸缓冲液；（3）不需要模板；（4)底物可以是单链DNA,是3OH突出的双链DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以;(5)随机添加的dNTPs。 如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。末端转移酶的用途：同聚物加尾 （ 外源DNA片断和载体分子上）23、 T4多核苷酸激酶的用途：DNA或RNA的 5端加-P。24、 碱性磷酸酶的功能：去掉一个-P基团，防止线性化的载体份子自我连接。26、 S1核酸酶属于单链DNA内切酶 特点：高度单链特异性 功能：（1）催化单链RNA或DNA降解。 （2）切掉双链核酸中的单链区。27载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。 基因工程对载体的要求：（1）在宿主细胞内能独立复制；（2）有选择性标记；（3）有一段多克隆位点，外源DNA插入其中不影响载体的复制；（4）分子量小，拷贝数多；（5）容易从宿主细胞中分离纯化。28、 质粒：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。 质粒的空间构型： 共价闭合环状DNA（cccDNA)（呈超螺旋SC）； 开环DNA（ open circular， ocDNA）； 线形DNA （ linear ，lDNA）电泳速率：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢25、核酸外切酶DNA外切酶切割方式识别位点单链大肠杆菌核酸外切酶I（exoI）535-OH大肠杆菌核酸外切酶（exo）53355-P3-OH双链核酸外切酶（exo）353-OHl核酸外切酶（lexo）535-PT7基因6核酸外切酶535-P5-OH29、 氨苄青霉素是青霉素的衍生物。 抗性原理：Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的-内酰胺环。 30、 表达载体的结构 （1）普通载体元件：复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS （2）大肠杆菌操纵子元件：阻遏基因 I、操纵基因O 、启动基因P 、核糖体结合位点序列（SD） 、转录终止信号区。31、 pBR322有两个抗性基因筛选标记：氨苄青霉素和四环素。32、 PUC系列含有一个氨苄青霉素和一个lac Z基因。（蓝白菌落筛选）33、 噬菌体的结构：噬菌体是线性双链DNA病毒，末端具有互补的12nt，称cos位点。感染细菌后粘端互补成双链环状。cos位点：线性DNA分子的两端各有12个碱基的单链互补粘性末端，这个长粘性末端称为cos位点。34、 构建噬菌体包装的限制：不超过原噬菌体的75%-105%，克隆能力23kb35、 2种包装的形式与原理：第一种方法：利用cos位点发生突变的噬菌体进行体外包装第二种方法：为了制备体外包装重组 DNA分子需要的各种蛋白质，筛选到了D基因缺失的噬菌体突变株(D-)和E基因缺失的噬菌体突变株(E-)。当这两种突变株分别感染受体菌时，虽然两者均能复制 D NA分子，但是D-突变株感染的受体菌合成的系列蛋白质中缺了D蛋白，E-突变株感染的受体菌合成的系列蛋白质中缺了E蛋白两者均不能把复制的 D NA分子包装成噬菌体颗粒，导致两种受体菌细胞内分别积累了除D蛋白或E蛋白以外的一系列与包装相关的蛋白质。当这两种受体菌细胞合成的蛋白质混合后，则达到D蛋白和E蛋白的互补，就能有效地包装 DNA分子。36、柯斯质粒载体的结构特征：（1）.是环型双链DNA分子,能容纳大片段（45kb）的小分子（4kb-6kb）载体.用于构建基因组文库.（2）.具有质粒载体的复制原点，抗药基因，多克隆位点.（3）.具有cos位点,可被A蛋白酶切开,提供体外包装的cos末端.37、人工染色体的英文缩写：酵母人工染色体克隆载体（YAC）、细菌人工染色体克隆载体（BAC）、人类人工染色体克隆载体（HAC）和哺乳动物人工染色体克隆载体（MAC）。38、目的基因获得方法：化学合成、构建文库、PCR扩增39、 磷酸二酯法中保护dNTP的5端P 或3端-OH是为了保证合成反应的定向进行。40、互补连接法步骤 （1）互补配对：预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5端磷酸化：用T4多核苷酸激酶使各个片段的5端带上磷酸。（3）连接酶连成完整双链。41、基因文库：重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。基因组文库的大小及公式：一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=In（1-p）/（1-f）=4.61*G/f G : 基因组大小 f：插入DNA片断的平均长度基因片段越大，克隆数越小。42、 cDNA文库的构建：以某种生物总的mRNA为模板逆转录出的DNA称cDNA。用Oligo dT纤维柱分离mRNA43、 cDNA的合成过程： cDNA第一链合成（逆转录酶）； 降解mRNA模板（碱处理或用RNaseH降解）； cDNA第二链合成（DNA聚合酶）；去掉发卡结构（核酸酶S1）。44、 DNA片段的体外连接：粘性末端的连接；齐平末端的连接； PCR产物的连接 平端的连接方法：1. 直接连接 ；2. 人工加尾形成 “粘性末端” 。45、 DNA体外连接应注意的事项：插入片断与载体的酶切位点互补；DNA插入的方向正确；插入基因的开放阅读框（ORF）正确；防止载体自身环化连接防止载体自身环化连接的方法：（1）提高插入片断的用量（2）用碱性磷酸酶处理载体46、 转化：大肠杆菌捕获质粒DNA的过程 转染：大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。转导：借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 判断题47、 感受态细胞：经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细胞。例如：用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌、冰冷的条件下制备、CaCl2处理、储存感受态菌要在-70以下、使用感受态菌时必须迅速融化，融化后一般不能再次冻存使用。48、 体外包装的过程49、 四环素抗性插入失活的原理:Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。四环素：抑制细菌生长，但不杀死细菌。环丝氨酸：杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。50、 -半乳糖苷酶筛选原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。51、 原位杂交筛选原理：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。52、 原核生物基因表达的特点: 原核生物基因表达的特点; 以操纵子为单位 转录和翻译偶联、连续进行。4. 不含内含子，缺乏转录后的加工系统。5. 调控主要在转录水平上。6. mRNA的核糖体结合位点.mRNA 5AGGAGGU原核启动子的保守序列-35区（RNA聚合酶亚基的识别位点 ）和-10区（转录起始位点和核糖体结合位点）。53、 SD序列的保守序列（核心序列): 16SrRNA 3 UCCUCCA 54、 包涵体：是存在于细胞质中的一种不溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。55、 融合蛋白表达载体系统-pGEX系列 优点：便于融合蛋白的分离和纯化 分离提纯：亲和层析柱分离纯化。 结构：启动子：tac 操纵基因：lacO 调节基因：lacI S-D序列ori 融合肽56、 影响外源基因表达效率的因素1. 启动子的结构对表达效率的影响：2. 转译起始序列对表达效率的影响3. 启动子与外源基因之间的距离4. 转录终止区对表达效率的影响5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响57、 转基因植物是通过DNA重组技术，从生物体(动物、植物、微生物）中鉴定和分离特定的基因，经精心设计后导入并使其稳定整合于受体植物的基因组，表达后实现对植物的定向遗传改造而获得的植物。58、 愈伤组织-外植体在适宜的培养基中生长出未分化的细胞团，称为愈伤组织.59、 Ti质粒T-DNA：转移DNA，编码冠瘿碱的合成毒性基因（vir）:帮助T-DNA的转移， 进入和整合。冠瘿碱代谢基因：章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因（分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶）不相容性基因：控制Ti质粒的不相容性60、 冠瘿碱的作用：冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。61、 双元载体的结构：菌选择标记、农杆菌ori、左边界、右边界、大肠杆菌ori62、 三亲融合法 含双元载体的大肠杆菌：含有外源基因和左右边界。 含有帮助质粒的辅助细菌：含vir基因。 受体农杆菌（空）：63、植物表达抗感染的病毒外壳蛋白产生抗病毒植物植物表达微生物毒素产生抗虫植物植物表达5-稀醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶EPSPS产生抗除草剂植物64、转基因动物的制作方法：原核期胚胎的显微注射、逆转录病毒载体感染发育早期的动 物胚胎、精子载体法、胚胎干细胞(ES)技术。65、 注射了大鼠生长激素基因，形成了巨型小鼠事件66、 pSV2载体以SV40病毒基因组为基础构建的Poly A、ori、Ampr、外源基因插入区、起始增强区等5个基本元件。67、 将基因转入动物细胞的方法：磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、脂质转染法、显微注射法68、 二氢叶酸还原酶基因(dhfr)的原理：将含dhfr基因的载体转dhfr缺陷型细胞，细胞则能合成四氢叶酸，进而使细胞的核酸合成能够进行，所以转入dhfr基因的细胞就能在无胸腺嘧啶的选择培养基中存活，而未转入dhfr基因的细胞则被选择淘汰。69、 通过显微注射产生转基因小鼠的步骤：DNA的制备与纯化、超排卵、交配、卵的收集和培养、显微注射、假孕鼠的产生、卵的重新植入假孕鼠体内70、 质粒提取的原理：是基于染色体DNA与质粒DNA的变性 与复性的差异而达到分离目的.当PH12.6时，染色体DNA与质粒 DNA的变性.当PH7时，质粒DNA复性，溶解在溶液中.而染色体DNA不能复性，形成缠 连的网状结构，离心后沉淀下来.71、 作用 溶菌酶：能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的b-1，4糖苷键。在碱性条件（pH8）下有活性。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。EDTA：Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SDS：NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。 NaAc-HAc缓冲液：用来中和NaOH变性液，使DNA复性。 乙醇：用于沉淀DNA。 RNase A降解RNA渣滓。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE缓冲液：DNA保存液。 酚-氯仿:蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。 72、 提取细菌基因组DNA的一般步骤：（1）细胞裂解（2）DNA纯化（3）沉淀DNA73、 紫外光谱法：DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。 并且吸收强度与系统中的DNA或RNA的浓度成正比。（蛋白质在280nm处有吸收峰）74、 纯度： OD260 / OD280 1.8, DNA OD260 / OD280 1.8, DNA 被RNA污染 OD260 / O