微生态制剂的质量鉴别与选择.doc

微生态制剂的质量鉴别与选择、检测指标和标准张日俊（中国农业大学饲料生物技术实验室，动物营养学国家重点实验室，北京海淀，100193）微生态制剂（农业部官方称为“微生物饲料添加剂”）在20世纪70年代兴起时，被认为只有活的微生物才能起到微生态的平衡作用，因此认定微生态制剂是活菌制剂，甚至有一段时间，把微生态制剂就称为“活菌制剂”。但随着科学研究的不断深入，大量资料证明，死菌体、菌体成分、代谢产物也具有调整微生态失调的功效。因此，在1994年德国海德堡召开的国际微生态学术讨论会上，修改了微生态制剂（益生菌）定义：“益生菌是含活菌和（或）死菌，包括其组分和产物的活菌制品，经口或经由其它粘膜途径投入，旨在改善黏膜表面处微生物或酶的平衡，或者刺激特异性或非特异性免疫机制”。人们对活菌的作用比较容易理解，而对死菌的作用了解甚少，有资料证明，从电镜也能直接观察到死菌体也可黏附在肠壁，排斥有害菌，从而调节微生态平衡；菌体的细胞壁成分脂磷壁酸（LTA）及胞壁肽聚糖（PG），二者都能抑制腐败菌的致癌作用，并有很强的免疫激活作用。死菌体的特点是质量较稳定，比活菌更安全，并可以与抗生素同时使用。代谢产物是指细菌在生命活动过程中产生的代谢产物（排泄物），如酸性物质及细菌素对有害菌有拮抗、杀灭作用，细菌分解食物后的氨基酸以及合成的维生素、酶具有营养作用，菌体碎片对动物体也有免疫促进作用。代谢产物的特点是对动物体的作用较快。按照最新的益生菌概念内涵来理解，则给微生态制剂的质量评定增加了不少困难。即从成分上至少包括三个方面：活菌数量、死菌体含量、代射产物的种类及含量。FAO/WHO对益生菌也作了定义：益生菌是活的微生物，当摄入足够数量时，对宿主起有益健康作用。大家公认的观点是：益生菌首先在销售过程中要保持活性（存活），而且在动物饲用后还要抵抗胃液胆汁的强酸性消化作用。在国标微生物饲料添加剂技术通则（NY/T144-2007）（以下简称通则）中指出，微生物饲料添加剂是指在饲料中添加或直接饲喂给动物的微生物或微生物及其培养物，参与肠内微生态平衡或者刺激特异性或非特异性免疫功能、具有促进动物生长和提高饲料转化效率的微生物制剂。在此处的定义中，显然忽略了“死菌”成分和“改善肠道酶的平衡”的功能。作为官方规定，以“严格”为好，由于死菌会给质量评定带来许多困难。由于除微生物饲料添加剂技术通则外，微生物饲料添加剂还没有统一的标准，因此，目前还要根据执法部门农业部的微生物饲料添加剂技术通则来进行质量评定。1微生态制剂产品最常见的质量问题有哪些，如何快速鉴别1.1微生态制剂最常见的质量问题1.1.1菌种成分标示不明、扩大功能、使用技术不明确有些微生态制剂不标明菌种和主要成分，难以进行质量监督和检验；还有些企业任意扩大微生态制剂的作用和用途，用法与用量含糊不清或千篇一律，导致目前市场上微生态制剂产品参差不齐，用法与用量等技术内容不完善，难以确保使用的有效性。1.1.2活菌量标示值与实际值不相符、甚至活菌很少微生态制剂中的活菌数是阐明其质量的重要指标之一。活菌制剂在饲料加工、运输、贮存过程中容易失去活性。一些厂家的微生态产品的标示值与实际含量不符，通常表现为标示值远大于保证值，即微生态制剂中能添加到饲料的中有效活菌数（指每克成品当中所含有的有效活菌数量）。在国外产品也有类似的问题，如南非的Elliot和Teversham（2004）评价了9个从美国和欧洲进口的益生素产品，结果发现仅有5/9产品的标示值与实测值相符，3/9的产品标示的菌种与实际相符。1.1.3杂菌污染生产微生态制剂的最佳工艺是液体发酵，但一些企业由于缺乏液态发酵和后加工设备以及技术人员而采用投资少、工艺简单的固体发酵法来生产微生态制剂，此法生产的产品有效微生物的含量低，易受杂菌污染，质量难以控制。这是目前大部分微生态制剂生产厂家所采用的方法，也是目前影响微生态制剂推广应用的主要因素，也直接导致低价竞争，不利于微生态制剂产业的可持续发展。1.1.4效果稳定性菌种的遗传性（优良性）和保藏、生产工艺、储存时间和条件、使用方法都会影响到产品应用效果的稳定性。一般来说，只有优秀的菌种，配合科学稳定的生产工艺参数才能生产出优质、稳定的微生态制剂。1.2微生态制剂质量的快速鉴别关于微生态制剂质量的鉴别方法，一般采用微生物学检验和显微镜检测（镜检法）来检测功能微生物活菌含量和杂菌含量，前者主要通过平板培养计数法。虽然有一些快速测定微生物总菌数和有害菌的方法，如ATP法（生物化学发光检测方法）、免疫法、阻抗法、分子生物学法和显色培养基法在国外应用相当成功，但在我国由于仪器设备和检测条件的限制，还没有普及。显微镜检测法有许多缺点，只能大概了解微生物的数量和霉菌含量的多少，而无法区分活菌与死菌、功能微生物与杂菌。一般的用户没有专业仪器设备，可用发酵法来作初步的快速鉴别，方法是：取500g玉米面、500g麸皮或次粉混合均匀，再将微生态制剂与500g水混合均匀，然后拌入玉米面与麸皮（或次粉）的混合物中，再松散地装入塑料袋或容器中，封口后，置2037的环境中短时问发酵24h到36h，然后打开口，依靠嗅觉闻味道，同时肉眼观察有无霉菌生长。如果闻到酸香味浓、没有发霉味的，可初步判断该微生态制剂存在较充足的活菌，而霉菌量少，质量较好。如果没有闻到浓厚的酸香味或有发霉味，表明该微生态制剂质量差或有霉素污染。2采购微生态制剂产品时应该注意哪些问题2.1了解产品的技术背景选择正规厂家生产、技术实力雄厚，特别是与资深微生态专家合作、或与科研院所合作的企业生产的微生态制剂产品。2.2了解其菌种组成成分、特性、主要生产工艺微生态制剂的质量与菌种、生产工艺有密切的关系。相同种属下的不同菌株可能存在很大差异，虽然有些菌种名称相同，如都是乳酸菌或酵母菌或芽孢杆菌或双歧杆菌，但是由于同名菌种的不同菌株的生理特性（如生长快慢、最佳生长温度、所需生长环境或条件、世代间隔、代谢产物等）和功效性存在较大差异，最终表现的功效也会有明显不同，这如同不同人与人之间的能力、本领、财富等方面有天壤之别一样。因此，在采购微生态制剂产品时，首先需要了解其组成成分，由哪些微生物组成，含量多少；这些微生物抵抗胃酸的能力、抵抗胆汁酸盐和耐受一定加工温度（7090）的能力如何；其次，要了解这些微生物各有什么样的功能，对不同动物有什么样的功效？产酸、产酶、产生抗菌物质的能力如何；最后，还要了解生产商的生产条件或大概工艺，如有无发酵罐、技术来源或背景、工艺路线等。2.3了解产品的功能和应用情况在采购微生态制剂时，不能盲目。第一，要明确使用的动物对象，想要解决什么问题，然后有针对性地选择微生态制剂，要了解哪类微生态制剂能解决你所面临的问题；第二，了解微生态制剂的功效和实际应用效果，包括：微生态制剂对免疫的调控作用、对肠道菌群的调控、对腹泻的防治能力、对宿主生理功能、生产性能及饲料转化率的影响。2.4观察微生态制剂产品的性状，即观其色、闻其味、查其粒在确定购买之前，一要观其色，即观察微生态制剂的色泽，比较理想的粉状微生态制剂应该是白色或黄白色；二要闻其味，应该有发酵制品的典型味道，即酸味或酸香味；三要查其粒，就是观察粉状微生态制剂的颗粒细度，因为粒度大的不容易与饲料混合均匀，原则上应达到80目（接近食用玉米面的细度）。3微生态制剂产品的品质检测的指标和标准与微生态制剂产品品质密切相关的指标有两大类：有效活菌数；卫生指标。3.1有效活菌数的检测目前微生态制剂中常用的微生物主要有酵母菌乳酸菌、芽孢杆菌和光合细菌等，检测活菌含量的方法，主要是平板培养计数法，虽然有一些快速测定微生物总菌数和有害菌的方法，如ATP法（生物化学发光检测方法）、免疫法、阻抗法和显色培养基法在国外应用相当成功，但在我国由于仪器设备和检测条件的限制，还没有普及。因此，主要还是使用显微镜检测（镜检法）和平板计数法。3.1.1样品细菌总数测定方法可参照国标饲料中细菌总数的测定方法（GB13093-91），也可参照采用国际标准食品和动物饲料中微生物学检验方法（IS04833-1978）进行测定。活菌数测定是重要的指标，根据不同菌种的培养要求，选择厌氧、微需氧、需氧条件培养，必须规定培养方法及条件。一般来说，细菌总数测定，无论用GB13093-9或IS04833-1978都会低估总菌数，因为用同一条件来培养不同生长特性的微生物，总有一种或几种微生物生长不良或不能生长。因此，为获得准确的总菌数结果，最好采用分类计数法，即分别用乳酸菌、酵母（包括真菌）、芽孢杆菌专用培养基，并选择适合各类菌的培养条件进行分类计数，最后将各种菌数求即为总菌数。3.1.2酵母菌数的检测将样品经水适当稀释后可通过血球板计数法得酵母细胞的数量；而检测酵母死与活的方法主要是通过用美蓝染色制成水浸片，由于美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。为了准确测量活酵母的数量，还可采用平板计数法，可参照食品卫生微生物学检验霉菌和酵母计数（GB/T4789.15-2003）进行。两种计数方法相比，显微镜直接计数法随机性大，所以对菌体数量不能做出较为宏观，全面的反应。但其优点是快速，观察到马上可以计数。平板菌落计数法最大的缺点是速度慢，需要平板上长出菌落一段时间后才能计数，但是由于平板菌落计数法通常做梯度稀释，所以计数的线性范围大，由于是菌悬液涂布，所以比较均匀，能较好地反应菌落的疏密程度，重复性、平行性很好，是经典的计数方法，一般情况下，可在2436h内获得检验结果。3.1.3芽孢杆菌的检测主要参照国标食品卫生微生物学检验菌落总数测定（GB/T4789.2-2003），使用NAMn培养基（蛋白胨0.5、葡萄糖0.5、牛肉膏0.5、磷酸二氢钾0.3、琼脂3，pH值7.57.6，121灭菌30min备用）。测定时，将固体样品作适当倍数稀释，同时在摇瓶中加入玻璃珠粒30粒，130r/min速度摇30min（液体样品可省去此步前处理），主要是让细菌从固体颗粒上分离到溶液中来；或用灭菌的研钵将样品加无菌水研磨一下，这两种样品前处理，测出来的结果更准确。为排除非芽孢杆菌的干扰，将样品加水稀释后置8090水浴1015min，使菌体或营养体死亡，从而可进行芽孢杆菌计数，这种方法测定的是芽孢杆菌和少量的耐高温的其他细菌，并不能判断就是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。当然，如果确定产品中只有枯草或其他芽孢杆菌，那么此方法测定的基本就是目标菌。如果再配合显微镜下染色观察形态，这样做出来的结果会比较客观。3.1.4乳酸菌的检测乳酸菌是指能利用葡萄糖或乳糖发酵产生乳酸菌的细菌的统称。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。当然也包括饲料添加剂常用的双歧杆菌。检测方法可参照国标食品卫生微生物学检验乳酸菌饮料中乳酸菌检验（GB/T4789.35-2003）进行检测，常用MRS培养基；双歧杆菌的检验参照国标食品卫生微生物学检验（GB/T4789.34-2003）。3.1.5光合细菌的检测可参照“沼泽红假单胞菌（光合细菌）水剂产品质量暂行标准”进行。对微生态制剂的微生物学检测，除了检测上述功能微生物外，还要检测卫生指标，包括有害微生物和有害化学物质指标。3.2卫生指标的检测卫生指标是指微生物饲料添加剂（微生态制剂）产品中有害物质及有害或致病微生物的允许量。卫生指标（见表1）包括两大类，一类是有害化学物质指标，即黄曲霉素B、砷（总砷）、铅（Pb）、汞（Hg）、镉（Cd）的允许量；二是指有害或致病微生物指标，包括杂菌、大肠菌群、霉菌、沙门氏菌的允许量以及不得检出的致病菌（肠道致病菌及致病性球菌）。其中，致病菌（肠道致病菌及致病性球菌）主要指致病性大肠杆菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等。杂菌是指微生态制剂中除功能微生物（目标菌）以外的微生物，包括细菌和霉菌。杂菌率是指杂菌占总菌数的百分率，即杂菌率（）=杂菌数/（功能微生物的有效活菌数+杂菌数）l00。此外，大肠杆菌还可依据国标食品卫生微生物学检验大肠菌群的快速检测（GB/T 4789.32-2002）进行快速检测。从上述可以看出，我国微生物饲料添加剂的法规不健全，只有微生物饲料添加剂技术通则（见表1），关于有效活菌数的检测也没有国家标准，卫生指标的检测要么使用饲料卫生指标检测方法，这都放宽的检测指标的范围；要么是使用食品卫生指标微生物学检测方法。我国卫生部虽然颁布了中国益生菌类保健食品的法规管理，但也没有质量检测标准，但指出“活菌类益生菌保健食品在其保质期内活菌数不得少于106cfu/ml（g）”，这值得微生物饲料添加剂质量标准的借鉴。此外，国际益生菌产品协会（IPA）正在为争论不休的益生菌产品标签计划制定标准。表1 通则中提出的微生物添加剂的卫生指标要求和检测方法项目指标检验方法黄曲霉素B110.0 uk/kgGB/T 17480-1998饲料中黄曲霉毒素B1