植物组织培养.doc

绪 论第一节 植物组织培养的概念与类型植物组织培养是二十世纪发展起来的一门新技术。特别是近30多年来由于组织培养基础理论研究的深入，发展更为迅速，应用范围也越来越大，几乎以植物为研究对象的各个分支学科都在广泛地进行组织培养。它所涉及的学科有细胞学、细胞生物学、分子生物学、遗传学、育种学、生物化学、植物学、植物生理学、植物病理学、微生物学等等。通过植物组织培养，从单细胞都可人为产生结构复杂而完整的植株，因此作为生物学的一个根本问题分化的研究，植物组织培养也占着越来越重要的位置。从60年代开始，植物组织培养除了在基础理论的研究上有重要价值外，在实际应用中也日益显示出它的巨大价值。在农学、园艺、森林、药物等应用学科上，组织培养得到了广泛的利用。目前，植物组织培养已日益广泛地应用于植物的良种繁育与脱毒，种质资源的储存，细胞次生代谢物质的生产，细胞工程和基因工程的生物技术育种，以及遗传学和生物学基础的研究。植物组织培养是农业生物技术的重要组成部分，它是研究植物离体培养的原理和方法的科学。组织培养技术的进一步研究和应用，必将大大提高植物生产水平与技术水平，加速植物科学现代化的进程。一、植物组织培养的概念植物组织培养是指通过无菌操作，把植物的外植体接种于人工配置的培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其成为完整植株的方法。外植体是指用于植物组织培养的接种材料，它包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质体等。从理论上说，所有的植物细胞与组织材料都能培养成功。但实际上接种的外植体不同，培养的难易程度也不同。二、植物组织培养的类型植物组织培养的类型：根据接种的外植体不同分为五类。1胚胎培养指把原胚或成熟胚、胚乳、胚珠或子房分离出来，在人工合成的培养基上培养，使其成为正常的植株。2器官培养指分离茎尖、茎段、根尖、根、叶片、叶原基、子叶、花瓣、花药或花粉、果实等作为外植体，在人工合成的培养基上培养，使其发育成完整的植株。3组织培养指分离植物体的各部分组织，如分生组织、形成层组织或其它组织来进行培养，或采用从植物器官培养产生的愈伤组织来培养，通过分化诱导再生最后形成植株。这是狭义的组织培养。4细胞培养包括单细胞、多细胞或悬浮细胞和细胞的遗传转化体的培养等。5原生质体培养包括原生质体、原生质融合体和原生质体的遗传转化体的培养等。根据培养的过程分：1初代培养（第一代培养）指将从植物体上分离下来外植体作第一次培养。2继代培养指第一次培养以后将培养物转移到新的培养基上进行培养。 根据培养基态相不同分：1固体培养指在培养基中加凝固剂（多为琼脂）的组织培养。2液体培养指在培养基中不加凝固剂的组织培养。培养基中加入一定量的凝固剂，加热溶解后，分别装入培养用的容器中，冷却后即得到固体培养基。凡不加凝固剂的即是液体培养基。琼脂是常用的凝固剂，适宜浓度为0.61.0%（即610 g / L）。固体培养基所需设备简单，使用方便，只需一般化学实验室的玻璃器皿和可供调控温度与光照的培养室。但固体培养基，培养物固定在一个位置上，只有部分材料表面与培养基接触，不能充分利用培养容器中的养分，而且培养物生长过程中，排出的有害物质的积累，而造成自我毒害，必须及时转移。液体培养基则需要转床、摇床之类的设备，但通过振荡培养，给培养物提供良好的通气条件，有利于外植体的生长，避免了固体培养基的缺点。第二节 植物组织培养的生理依据 一、植物细胞的全能性所谓植物细胞的全能性，就是指植物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。一切植物都是由细胞构成的。在植物的生长发育中，一个受精卵可以成为具有完整形态和结构机能的植株，这就是全能性，就是该受精卵具有该物种全部遗传信息的表现。同样，植物的体细胞是从合子的有丝分裂产生的，也具有全能性，具备着遗传信息的传递、转录和翻译的能力。在一个完整的植株上某部分的体细胞只表现一定的形态，承受一定的功能，这是由于它们受到具体器官或组织所在环境的束缚，而其遗传潜力并没有丧失。一旦它脱离原来所在的器官或组织，成为离体状态，在一定的营养、激素和外界条件的作用下，就可能表现出全能性而生长发育成完整的植株。 植物组织培养的历史就是植物细胞全能性理论提出、证明和得到广泛应用的历史。二、植物细胞的再生性 在植物中很多是靠种子生长来产生完整的植株，但也有不少可通过根、茎、叶等器官再生而成为完整的植株，这种特性叫细胞的再生性。从植株分离出根、茎、叶的一部分器官，其切口处组织是受到了损伤，但这些受伤的部位往往会产生新的器官，长出不定芽和不定根，人们利用这一特点来进行营养繁殖。新器官产生的原因是由于受伤的组织产生了创伤激素，促进了周围组织的生长而形成愈伤组织，凭借内源激素和储藏营养的作用，于是就产生了新的器官。为什么在自然条件下，一些植物的营养器官和细胞难以再生呢？这主要是由于内源激素调整缓慢或不完全，外界条件不易控制等因素所致。在人工控制的条件下，通过对培养基的调整，特别是对激素成分的调整，就有可能顺利地再生。三、植物激素在细胞分化中的作用 植物生长调节物质对愈伤组织诱导、器官分化及植株再生具有重要的作用，是培养基中的关键物质。植物生长调节物质主要有生长素和激动素。1生长素它作为组织培养中外源激素的重要来源，对外植体的生长是十分重要的。常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)等。IAA的活力较低，可能是最弱的激素，对器官形成的副作用小。高温高压时易被细胞中的IAA分解酶降解，遇光也易分解。NAA在组织培养中的起动能力要比IAA高3.7倍，且由于它可人工大量生产，在高温高压下也比较稳定，不易被破坏、分解，所以在组织培养中使用十分广泛。 2,4-D在组织培养中的起动能力要比IAA高10倍以上，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。生长素对发根有作用，对愈伤组织的产生和再分化有诱导作用，还能促进细胞的分裂、分化和新陈代谢。细胞分裂素 常用的有玉米素（ZT）、6-苄基腺嘌呤（BA）、激动素（KT）。细胞分裂素不仅能促进细胞分裂，诱导细胞扩大，解除顶端优势，促进侧芽生长，而且还有减少叶绿素的分解，延缓叶片衰老的作用。但是，细胞分裂素对根的生长一般起抑制作用。 注意：通常当生长素 /细胞分裂素的比例高时有利于生根；生长素 /细胞分裂素的比例低时则有利于产生芽；若两者浓度相当时，既不利于生根，也不利于生芽，愈伤组织的产生则占优势。关于激素控制器官形成的这一模式，在许多植物组织培养中得到了验证。但在一些情况下，不是生长素 /细胞分裂素的比值决定器官的发生，而是绝对浓度。此外，赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）等也在组织培养中不同程度地发挥作用。因此，究竟采用哪些生长调节物质，采用什么样的细胞分裂素与生长素比例，要根据培养的目的、植物的种类和细胞分裂素与生长素的种类而定。第三节 植物组织培养的历史与应用一、植物组织培养的历史植物组织培养是本世纪初开始，以植物生理学为基础发展起来的。1902年德国植物学家Haberlandt提出了细胞全能性概念。1939年White报道了烟草组培成功。并提出植物细胞全能性学说。同年，Gautheret与Nobecourt 培养胡萝卜成功。此三人被誉为植物组织培养奠基人。40年代末50年代初Skoog等人进行烟草髓培养诱导根、芽器官，获得成功。1957年Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念。1958年美国Steward等和德国Reinert等分别由培养的胡萝卜根细胞诱导形成了胚状体，形成新植株，有力地证明了细胞的全能性。我国李继侗等曾作银杏离体胚培养，发现其胚乳提取物能促进离体胚生长。罗士韦是我国植物组织和细胞培养研究的开拓者和奠基人之一。在30年代即开创离体根培养，随着又进行胚和茎尖培养。解放后，特别在前70年代以后，身体力行，指导植物组织培养技术的推广工作，取得了很大的成效。近二三十年，我国植物组织培养研究工作取得很大的成就，例如，从花药诱导出许多优良的水稻、小麦、烟草等品种，在花药培养和单倍体育种上，一直处于国际领先水平。例如，应用快速繁殖技术，繁殖出在量优良的甘蔗、香蕉、菠萝、杨树、桉树和花卉种苗，对农业、林业生产做出了较大的贡献。 二、组织培养的应用1无性系快速繁殖 无性系快速繁殖是指应用组织培养和细胞培养技术，快速繁殖珍稀濒危植物，使物种得以保存；以及快速繁殖名优特新品种，使其在一定时间内繁衍为一定数量的植株。2花药培养和花粉单倍体育种 离体花药花药培养的单倍体育种法，与常规方法相比，可以在短时间内得到植物的纯系，从而加快育种进程。3药用植物的工厂化生产 当前采用组织培养来加速药用植物（如人参、紫草、贝母、甘草等）的繁殖生长已获得成功，并投入工厂化生产。4培育无病毒苗以解决病毒危害问题 对于无药可治的病毒病，可通过茎尖培养脱毒，这对解决马铃薯退化问题能发挥重要的作用，在其他很多植物中也可用以建立无毒原种。5种质的保存和基因库的建立 目前种质的保存和基因库的建立在育种工作中是十分重要的。由于组织培养材料的体积小，利于在低温（如低温冰箱）或超低温（如一1960C液态氮）中长期保存。6制造人工种子 通过用人工种皮包被体细胞胚制造人工种子，为某些稀有和珍贵物种的繁殖提供了一种高效的手段。7突变体的筛选培育 在细胞和组织培养进程中，基因型易发生变异，因此人们可采用射线对培养物照射让其产生变异，从中选择理想的突变体，育成新品种。如：用基因枪将目的基因嵌入要改良的品种中去，最后育成优良品种。主要参考书目1中国科学院上海植物生理研究所细胞室编，植物组织和细胞培养，上海科学技术出版社，19782张丕方等编著，植物组织培养与繁殖上的应用，上海科技教育出版社，19873李浚明编译，植物组织培养教程，北京农业大学出版社，19924胡道芬主编，植物花培育种进展，中国农业出版社，19965潘瑞炽主编， 植物组织培养，广东高等教育出版社，20006颜昌敬主编，农作物组织培养，上海科学技术出版社，19917颜昌敬编著，植物组织培养手册，上海科学技术出版社，19908杨增海编著,园艺植物组织培养,农业出版社，19879谭文澄 戴策刚主编,观赏植物组织培养,中国林业出版社，199110许智宏主编，植物生物技术，上海科学技术出版社，1998 11程广有编著，名优花卉组织培养技术，科学技术文献出版社2001第一章 实验室设备和一般技术第一节 实验室设计和常用设备一、实验室设计植物组织培养要在严格无菌的条件下进行操作，因此实验室的设计首先要有无菌操作室。其次，被培养的器官、组织、细胞等外植体的生长、发育必须要有适宜的温度、湿度、光照等条件，所以必须具备有一定设备和条件的培养室。还要有配置培养基的化学实验室和检查培养情况并作记录的细胞实验室。此外，进行高压消毒，器皿洗涤、显微摄影等也需要一定的场所及设备，还需建立灭菌室、洗涤室和摄影室等。无菌操作室 植物组织培养操作过程中，较长时间的分离接种和培养体转移均需在无菌条件下进行。无菌操作可以在无菌室、无菌箱或超净工作台中进行。（1）无菌室 无菌室要求墙壁光滑平整，地面平坦无缝，便于清洗和消毒。门窗要密闭，一般用移动门窗。室内应安装紫外灯，以便灭菌。室内有操作台，放置组织培养的操作器具。为避免进出时带进杂菌，无菌室外应设置预备室。预备室可放置工作服、拖鞋、帽子等，也需要安装紫外灯。（2）无菌箱 条件不足时可用最简单的无菌箱来代替，前面装玻璃，操作中便于观察，左右两侧有两个孔，孔内侧有布质袖罩，无菌箱上方安装紫外灯和日光灯，箱内放置工作所需的物品。无菌箱比较简易，容易办到，但操作不方便，比较费工。（3）超净工作台 超净工作台原系工业上用于半导体元件与精密仪器的装配，如今已成为组织培养上的一种最通用的无菌操作装置。它占地小，效果好，操作方便。超净工作台的空气通过细菌过滤装置，以固定不变的速率从工作台面上流出，在操作人员与操作台之间形成风幕，由于进入台面的空气的净化，保证了台面的无菌状况。2化学实验室 植物组织培养时所使用的各种器具的洗涤、干燥、保存，培养基的制备、分装，植物材料的预处理、重蒸馏水的制备以及进行生理、生化因素的分析等各种操作都要在化学实验室中进行。化学实验室应备有各种培养基所需的各种化学药剂，各种玻璃器皿，烘箱、冰箱、天平、酸度计、蒸馏器等。 3培养室 培养室是将接种到培养瓶等器皿中的材料进行培养的场所。为了满足外植体的生长和发育，要具备适宜的温度、湿度、光照、通风等条件。空调机可以保证室内温度均匀、恒定。室内湿度也要求恒定。湿度过高时，可采用小型室内除湿机除湿。培养室一般装置日光灯作为光源，照明时间的控制可安装定时器，根据需要自动控制照明时间。4细胞学实验室 要观察、记录培养材料的生长情况和结果，就要有细胞学实验室。细胞学实验室应有各种显微镜、解剖镜，描绘和照相设备以及切片染色设备等。室内要求干燥、整洁、明亮，使光学仪器不受潮湿。5灭菌室 器皿和培养基的消毒灭菌，最好在一个专用的小灭菌室内进行，室内装有水、电、煤气等设备，墙壁和地面能防潮湿和耐高温，墙壁上要设置换气窗。若无设置灭菌室的条件，也可在化学实验室中进行。6洗涤室 由于组织培养对玻璃用具清洁程度要求极为严格，所以最好能有专门设备的洗涤室。洗涤室需有高压水龙头，便于冲洗。洗涤室中最好有电热干燥箱，以便将器皿及时烘干。7摄影室 试验材料的摄影记录，一般可用能安装照相机或带有照相设备的显微镜、解剖镜以及电子显微镜等进行。有时也可用照相机直接拍摄外植体，因此需要有一定的光照条件的摄影室。另外，还应有冲洗、印相、放大用的暗室设备等。以上是植物组织培养实验室的理想设计。实际工作中可以根据工作要求和具体条件，因陋就简地设置，不必全部具备，以满足组织培养工作的开展为准。其中主要的是要保证无菌培养的顺利进行。二、常用设备（一）仪器设备 1恒温箱 又称培养箱，可用于组织培养材料的保存、培养等。 2烘箱 可以用80100C的温度，迅速干燥洗净后的玻璃器皿。也可以用160180C的温度，进行13小时的高温干燥灭菌。还可用80C的温度烘干组织培养植物材料，以测定干物质。3空气调节器 接种室的温度控制，培养室的控温培养，均需要用空气调节器。4高压灭菌器 高压灭菌器是一种密闭良好又可承受高压的金属锅，其上有显示灭菌器内压力和温度的表头。灭菌器上还有排气孔和安全阀。5冰箱 有普通冰箱、低温冰箱等。用于试剂和母液的储藏，细胞组织和试验材料的冷冻保藏，以及某些材料的预处理。6 天平 包括药物天平、扭力天平、分析天平等。大量元素、糖、琼脂等的称量可采用感量为0.1克的普通天平，微量元素、维生素、激素等的称量则应采用感量为0.1毫克的分析天平。有条件的，最好配用电子天平。7 酸度计 用于校正培养基和酶制剂的pH值。半导体小型酸度测定仪，既可在配制培养基时使用，又可在培养过程中测定pH值的变化。8 离心机 用于分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原生质体。一般每分钟30004000转即可。9 显微镜 包括双目实体显微镜（解剖镜）、生物显微镜、倒置显微镜，还有相差显微镜、干涉显微镜和电子显微镜。显微镜上要求能安装或带有照相装置，以对所需材料进行摄影记录。（1）双目实体显微镜 双目实体显微镜下可进行培养材料（如茎尖分生组织、胚等）的分离，解剖和观察植物的器官、组织，也可以从培养器皿的外部观察细胞和组织的生长情况。（2）生物显微镜 生物显微镜可用于观察花粉发育时期以及培养过程中细胞核的变化。（3）倒置显微镜 倒置显微镜物镜在镜台下面，可以从培养皿的底部观察培养物。10水浴锅 水浴锅可用于溶解难溶药品和熔化琼脂。11摇床与转床 在液体培养中，为了改善浸于液体培养基中的培养材料的通气状况，可用摇床（振荡培养机）来振动培养容器。振动速率每分钟60120次为低速，每分钟120250次为高速，植物组织培养可用每分钟100次左右。摇床冲程应在3厘米左右。冲程过大或转速过高，会使细胞震破。转床（旋转培养机）同样用于液体培养。由于旋转培养使植物材料交替地处于培养液和空气中，所以氧气的供应和对营养的利用更好。通常植物组织培养用1分钟1转的慢速转床，悬浮培养需用80100转/分钟的快速转床。12电力除湿机 在霉雨季节，为了降低植物组织培养实验室内的空气湿度，使用电力除湿机是十分必要的。13蒸馏水制造装置 得到的蒸馏水，再经过无离子制造装置，就可以成为纯度很高的蒸馏水，供试验应用。（二）玻璃器皿 配制培养基和进行培养都需要大量的不同类型的玻璃器皿，这种玻璃器皿需用碱性溶解度小的优质硬质玻璃制成，以保证长期储藏药品与培养的效果；培养用的器皿还要求透光度好，能耐高压灭菌。1培养器皿 是指用于放入培养基和培养材料进行培养的器皿。主要有试管、三角瓶、培养皿、圆形培养瓶；也有进行转动培养并使液体流动时用的L型管和T型管；还有在瓶外用显微镜观察细胞的分裂和生长情况，并便于摄影记录的长方形扁瓶、圆形扁瓶、平型有角试管和无角试管等。2 分注器 分注器可以把配置好的培养基按一定量注入到培养器皿中。一般由46厘米的大型滴管、漏斗、橡皮管及铁夹组成。还有量筒式的分注器，上有刻度，便于控制。微量分注还可采用注射器。3 离心管 离心管用于离心，将培养的细胞或制备的原生质体从培养基中分离出来，并进行收集。4 实验器皿 主要是量筒、量杯、烧杯、吸管、滴管、容量瓶、称量瓶、试剂瓶、玻璃缸、酒精灯等用于配制培养基、储藏母液、材料消毒等的各种化学实验玻璃器皿。（三）器械用具 主要有镊子、剪刀、解剖刀、接种针等。另外，还有细菌过滤器等。第二节 器皿的选择与清洗一、器皿的选择（一）培养器皿的选择 目前，用于接种外植体的培养器皿种类有许多。1按材料分：有玻璃的培养器皿与塑料的培养器皿两种。现在在很多实验室内，玻璃培养容器和制备培养基所需的其他玻璃器皿都以被塑料器皿所取代。有些塑料容器可以进行高压灭菌。另外有些塑料容器，特别是那些用于原生质体、细胞、组织和器官培养的容器，在出厂时即是无菌的。这种塑料容器在国外已得到普遍应用，在国内也已生产并使用的。在培养中如果使用塑料容器或带螺丝帽的玻璃瓶，方便之处是无须另外配盖。若使用试管或细口瓶，传统的封口办法是用棉塞，有时在棉塞外层再包上一层沙布。不过，若觉得这种封口办法费时费事，还可以有很多别的办法，如可从市场上购买塑料（聚丙烯）或金属（铝或不锈钢）瓶盖或试管帽，其中有些是可以阻止试管内水分的丢失，但不影响内外的空气交换。此外，利用耐高温高压的透明塑料封口，以橡皮圈箍扎，也不失为一种经济有效的办法。不过，重要的是必须保证瓶盖不致于抑制培养物的正常生长。2按形状分：有试管、L形管、T形管、三角瓶和培养皿等。这些不同类型的容器都可用来培养植物材料。但具体采用哪一种，有时取决于实验性质；有时取决于容器使用是否方便；有时还取决于研究工作者的爱好与资金实力等。在一般的组织和细胞培养工作中，玻璃试管和三角瓶是广泛应用的容器。当然，在条件不许可的情况下，各种大小的广口玻璃瓶，有时甚至牛奶瓶和罐头瓶也都可以利用，特别在快速繁殖时更是如此。不过在组织培养中只应用硼硅酸盐玻璃器皿，钠玻璃对某些组织可能是有毒的，重复使用时毒害会更明显。下面就试验性质而言，举例说明培养器皿的选择方法。试管特别适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用，在茎尖培养及花药和单子叶植物分化长苗培养时更显方便。有圆底的和平底的两种。三角瓶是植物组织培养中最常用的培养容器，适合于各种培养，固体或液体、大规模或小规模都行。常用的是50、100、150和300ml的三角瓶。其优点是：采光好、瓶口较小不易失水和污染；缺点是：价格较贵。L形管和T形管为专用的旋转式液体培养试管。培养皿适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。常用规格为直径40、60、90和120mm的培养皿。角形培养瓶和圆形培养瓶适于液体培养用果酱瓶常用作为试管苗大量繁殖用的培养瓶，一般用200500ml的规格。（二）其它器皿的选择制备培养基所需的其它玻璃器皿主要有以下这些：三角瓶或烧杯（100ml、250ml、500ml和1L）容量瓶（100ml、250ml、500ml和1L）量筒（25 ml、50ml、100ml、500ml和1L）刻度移液管（1ml、2 ml、5ml、10ml）吸管和上面的橡皮头各种大小的塑料瓶等二、器皿的清洗植物组织培养除了要对待培养的实验材料和接种用具进行严格消毒外，各种培养器皿也要求洗涤清洁，以防止带入一些有毒的或影响培养效果的化学物质或一些微生物等，对那些常用的玻璃器皿的清洁程度要求更为严格。（一） 洗涤剂清洗玻璃器皿用的洗涤剂主要有肥皂、洗洁精、洗衣粉和铬酸洗涤液（由重铬酸钾和浓硫酸混合而成）。配制铬酸洗涤液的注意事项：（1）在配制时重铬酸钾一定要冷却后才能加浓硫酸，且只能把浓硫酸缓慢加入重铬酸钾溶液中，决不能将重铬酸钾溶液或蒸馏水倒入浓硫酸中。（2）由于铬酸洗涤液具有极强的氧化能力和腐蚀作用，故不要用手直接接触洗涤液。（二） 洗涤方法1使用前先用1%稀盐酸浸泡1夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲淋1遍，干后备用。2已用过的玻璃器皿洗涤方法。去残渣水洗热肥皂水（或洗洁精）水洗蒸馏水冲洗1次。3较脏的玻璃器皿的洗涤。洗衣粉或洗洁精刷洗几次并冲净浸入洗涤液中流水中冲洗蒸馏水冲洗。4已被霉菌等杂菌污染的玻璃器皿的洗涤。1210C高温高压蒸汽灭菌30min趁热倒去残渣清水中冲洗浸泡在浓的重铬酸钾洗涤液中2h后取出水洗数次蒸馏水冲淋1次。5用过的吸管和滴管的清洗.。洗涤液中浸泡2h以上取出在流水中冲洗半小时蒸馏水冲淋1次。6用过的载玻片和盖玻片的清洗。洗涤液中浸泡数小时水洗绸布擦干放在95%的洒精中备用。总之，要求洗净的玻璃器皿应透明发亮，内外壁水膜均匀，不持水珠。第二章 培养基及其配制先向大家介绍一下培养基的种类：1培养基根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。固体培养基是指加凝固剂（多为琼脂）的培养基；液体培养基是指不加凝固剂的培养基。培养基中加入一定量的凝固剂，加热溶解后，分别装入培养用的容器中，冷却后即得到固体培养基。凡不加凝固剂的即是液体培养基。固体培养基所需设备简单，使用方便，只需一般化学实验室的玻璃器皿和可供调控温度与光照的培养室。但固体培养基，培养物固定在一个位置上，只有部分材料表面与培养基接触，不能充分利用培养容器中的养分，而且培养物生长过程中，排出的有害物质的积累，而造成自我毒害，必须及时转移。液体培养基则需要转床、摇床之类的设备，但通过振荡培养，给培养物提供良好的通气条件，有利于外植体的生长，避免了固体培养基的缺点。2培养基根据培养物的培养过程分为初代培养基与继代培养基。初代培养基是指用来第一次接种从植物体上分离下来的外植体的培养基。继代培养基是指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。培养基根据其作用不同分为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。培养基根据其营养水平不同分为基本培养基和完全培养基。基本培养基主要有MS、White、B5、N6、改良MS、Heller、Nitsh、Miller、SH等；完全培养基就是在基本培养基的基础上，根据试验的不同需要，附加一些物质，如植物生长调节物质和其它复杂有机附加物等。下面介绍培养基的几种成分。第一节 培养基的成分培养基的成分主要包括：无机营养（即无机盐类）、维生素类、氨基酸、有机附加物、植物生长调节物质、糖类和琼脂等。一、无机营养 无机营养又分为大量元素和微量元素。（一）大量元素 大量元素根据国际植物生理学会建议，植物所需元素的浓度大于0.5m mol/l(每升毫摩尔)的称大量元素。主要有：氧（O）、碳（C）、氢（H）、氮（N）、钾（K）、磷（P）、镁（Mg）、硫（S）和钙（Ca）等，占植物体干重的百分之几十至万分之几（表11），其中氮又有硝态氮（ NO3-）和铵态氮（NH4+）之分，这两种状态的氮对离体组织都是需要的，但是两者应保持适当的比例。表11植物所需大量元素占植物体干重的百分数(%)元素名称氧碳氢氮钾磷镁硫钙含 量7018100.30.30.070.070.050.03（二）微量元素 微量元素根据国际植物生理学会建议，植物所需元素的浓度小于0.5m mol/l的称微量元素。主要有：铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）、锰（Mn）、钼（Mo）、硼（B）、碘（I）、钴（Co）、氯（Cl）、钠（Na）等。这两类元素在培养基中的含量虽然相差悬殊，但都是离体组织生长和发育必不可少的基本的营养成分。如果缺少这些元素，组培苗则会造成缺素症。如：氮 枝叶生长需要氮素，缺氮老叶先发黄；氮过量，枝叶过度茂盛，若磷肥又不足，则不开花或花期延迟。磷 为开花结实不可缺少的元素。缺磷，植株生长缓慢，老叶暗紫色。钾 促进花卉生长健壮，增强抗性，茎秆挺拔。缺钾，叶尖、叶缘枯焦，叶片呈皱曲状，老叶发黄或火烧状。镁 镁是构成叶绿素的成分。缺镁，叶片边缘及中央部分失绿而变白，叶脉出现色斑。硫 缺硫，变为淡绿，进而变白。铁 缺铁，细胞分裂停止，绿叶变黄，进而变白。锰 缺锰，叶片上出现缺绿斑点或条纹。锌 缺锌，叶子变黄，或出现白斑，叶子小。钙 钙促进幼根生长。缺钙，嫩叶失绿，叶缘向上卷曲，出现白色条纹。硼 缺硼，叶失绿，叶缘向上卷曲，顶芽死亡。钴 缺钴，叶片失绿而卷曲，整个叶片向上弯曲凋枯。二、氨基酸 氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮化合物。常用的有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、半胱氨酸以及酰胺类物质（如天门冬酰胺）和多种氨基酸的混合物（如水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。有机氮作为培养基中的唯一氮源时，离体组织生长不良，只有在含有无机氮的情况下，氨基酸类物质才有较好的效果。三、有机附加物复杂有机附加物包括有些成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酵母提取液、麦芽糖等。四、维生素类它能明显地促进离体组织的生长。培养基中的维生素主要是B族维生素，如硫胺素（维生素B1）、吡哆醇（维生素B6）、烟酸（维生素B3，又称维生素PP）和泛酸钙（维生素B5）、生物素（维生素H）、钴胺素（维生素B12）、叶酸（维生素Bc）、抗坏血酸（维生素C）等。五、糖类糖在植物组织培养中是不可缺少的，它不但作为离体组织赖以生长的碳源，而且还能使培养基维持一定的渗透压（一般在1.54.1MPa）。一般多用蔗糖，其浓度为1%5%,也可用砂糖、葡萄糖或果糖等。六、琼脂 在固体培养时，琼脂是使用最方便、最好的凝固剂和支持物，一般用量为即610g/L。琼脂以色白、透明、洁净的为佳。目前生产的琼脂粉比条状的使用更方便。同一厂家的产品，往往粉状的比条状的用量要少。琼脂本身并不提供任何营养，它是一种高分子的碳水化合物，从红藻等海藻中提取，仅溶解于热水，成为溶胶，冷后（400C以下）即凝固为固体状成凝胶。通常所说的“煮”培养基，就是使琼脂溶解于热水（900C以上）中。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式等有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，而丧失凝固能力。存放时间过久，琼脂变褐，也会逐渐失去凝固能力。七、植物生长调节物质植物生长调节物质对愈伤组织诱导、器官分化及植株再生具有重要的作用，常常是培养基中不可缺少的组成成分，是培养基中的关键物质，它主要包括生长素和细胞分裂素。 （一）生长素 生长素是指能引起完整组织中的细胞扩展的化合物。它包括内源的（存在于植物体内的）和人工合成的，对外植体的生长十分重要。在组织培养中，生长素的主要作用是：诱导愈伤组织的产生，促进细胞脱分化；促进细胞的伸长生长；诱导受伤的组织表面形成愈伤组织；促进生根。常用的生长素有吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、吲哚丙酸（IPA）、萘氧乙酸（NOA）和ABT生根粉等。1吲哚乙酸（IAA）是从植物中提取出来的，它在高等植物中普遍存在，在幼嫩的生长旺盛的部位含量更高。虽然IAA对器官形成的副作用较小，但是，这种天然的生长素易受体内酶的分解，而且也易受光的氧化作用，在高温高压的灭菌中热稳定性较差，并且其药剂的活性也较低，可能是最弱的激素；而人工合成的生长素则不会受到酶的分解，高温高压下表现也比较稳定。所以在组织培养中通常使用人工合成的类似物，主要有IBA、NAA和2,4-D等。2吲哚丁酸（IBA）在组培快速繁殖中，最普遍的应用是代替IAA。IBA的分子结构与IAA非常相似，但它比IAA更稳定，具有抗氧化性，能诱导许多植物生根，并且在组织培养中的起动能力要比IAA高34倍，因而作为一种生长素，IBA具有更好的效果。3萘乙酸（NAA）也是IAA的类似物，但它比IAA更稳定，具有抗氧化性，在组织培养中的起动能力也要比IAA高34倍，而且最适宜诱导愈伤组织或诱导某些外植体物生根，所以在组织培养中使用十分广泛。42,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)在组织培养中的起动能力要比IAA高10倍以上，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它会强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。因而，其适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应，一般用于细胞启动脱分化阶段（使已分化了的停止分裂的细胞失去分化特性，回复到未分化的幼龄状态，恢复细胞分裂的能力，叫做脱分化），而诱导分化阶段（使脱分化形成的处于幼龄状态的细胞团或组织，再产生根、芽、胚状体等有高层次组织结构的特化细胞，叫分化阶段）往往不用2,4-D，而用NAA或IAA、IBA等。5ABT生根粉是中国林科院林业研究所王涛研究员研制的一种广谱高效的生根促进剂。是一种复合型的植物生长调节剂，共有10个型号。主要作用是：能提供插条生根所需的生长促进物质；能促进插条内源激素的合成；能促进一个根源基分化形成多个根尖，以诱导插条不定根的形态建成。此外，在组培中，还有一些具有类似生长素性质的其它化合物已被应用，如吲哚丙酸（IPA）、萘氧乙酸（NOA）、2,3,5-三氯苯氧乙酸（2,3,5-T）、对氯苯氧乙酸（p-CPA）等,其中2,3,5-T的作用类似2,4,- D。生长素一般溶于95%洒精或0.1mol/L的NaOH中，以后者的溶解效果为好。常配成浓度为0.1mg-1.0mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。（二）细胞分裂素 细胞分裂素也有天然的和人工合成的。常用的有玉米素（ZT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、激动素（KT）等。细胞分裂素的主要生理作用是：第1，促进细胞分裂和扩大（与生长素促进细胞伸长的作用不同），可使茎增粗，而抑制茎伸长；第2，诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长；第3，抑制衰老，细胞分裂素能减少叶绿素的分解，延缓离体组织或器官的衰老过程，有保鲜的效果。但是，细胞分裂素对根的生长一般起抑制作用。1激动素（KT）又叫动力精，其规范的化学名称叫6-糠基腺嘌呤。主要用途是诱导生芽，但是低水平的KT或KT添加生长素，能诱导一些植物生根。26-苄基嘌呤（6-BA）在结构上与KT接近，但是其功效却比KT强得多。由于它具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点，因而被广泛采用，并且是组织培养者最喜爱的细胞分裂素。BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织的发生。3玉米素（ZT）是一种天然激素，在诱导愈伤组织和芽的分化过程中具有较强的功能。但是它的价格昂贵，因此，常常让使用者望而却步。在大多数植物培养中ZT的作用稍差于BA，而在某些植物的培养中，使用ZT却能取得更好的效果。此外，还有异戊烯基腺嘌呤（2-ip）、6-甲基氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤等。细胞分裂素一般溶于0.5mol1.0mol/L的HCl中。常配成浓度为0.5mg-1.0mg/ml的溶液贮于冰箱中备用。注意：组培中决定愈伤组织生根还是生芽的关键取决于细胞分裂素与生长素之间的比率。当配制的培养基中生长素 /细胞分裂素的比例高时则有利于生根；生长素 /细胞分裂素的比例低时则有利于生芽；若两者浓度相当时，既不利于生根，也不利于生芽，而是愈伤组织的产生占优势。关于激素控制器官形成的这一模式，在许多植物组织培养中得到了验证。但在一些情况下，不是生长素 /细胞分裂素的比值决定器官的发生，而是绝对浓度。此外，赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）等也在组织培养中不同程度地发挥作用。因此，究竟采用哪些生长调节物质，采用什么样的细胞分裂素与生长素比例，要根据培养的目的、植物的种类和细胞分裂素与生长素的种类而定。八、活性炭活性炭加入培养基中的目的主要是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，例如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡。这在兰花组织培养中效果更明显。另外，活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根。但活性炭对物质吸附无选择性，既吸附有害物质，也吸附有利物质，因此使用时应慎重考虑。活性炭对形态发生和器官形成有良好的效应。在失去胚状体发生能力的胡萝卜悬浮培养细胞中加入1%4%活性炭可使胚状体的发生能力得以恢复。九、pH值在灭菌之前培养基的pH值一般都是调节到5.06.0。一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。pH值对不同植物的影响会有差异，如玉米胚乳愈伤组织在pH值7.0时鲜重增加最快，在pH值6.1时干重增长最快。第二节 培养基的配制配制培养基的准备工作包括水和药品的准备、器皿和用具的准备等。一、水和药品的准备配制培养基用的水最好用纯水，一般用蒸馏水即可，但精细的试验须用重蒸馏水。化学药品须用分析纯或化学纯，称量要准确，每称一种药品都必须准确记载，以便事后查对。二、器皿和用具的准备 种类：不同型号的烧杯、容量瓶、移液管、滴管、玻璃棒、三角瓶、试管、培养瓶、培养基分装器等。洗涤：三角瓶、试管、培养瓶先用清水清洗，然后用碱洗（即泡入热的洗衣粉水液中，洗刷玻璃器皿的内外壁），再用清水反复冲洗干净，直至冲水后瓶壁不挂水珠，最后用蒸馏水淋一遍，晾干或烘干备用。移液管、容量瓶等由于口小，不便碱洗，需用酸洗，较脏的其它玻璃器皿液要用酸洗，酸洗可用40g工业用重铬酸钾经少量水溶化，然后缓缓加入粗制浓硫酸至1000ml，制成铬酸硫酸混合液，来清洗。酸洗的洗法是把器皿放入酸液中1天，然后放在流水中冲洗干净，再用蒸馏水洗一遍，放入烘箱中烘干备用。三、母液的配制和保存经常使用的培养基，可先将各种药品配成浓缩一定倍数的母液，放入冰箱内保存，用时再按比例稀释。母液要根据药剂的化学性质分别配制。一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素、氨基酸等母液，其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。配制成的母液，放入冰箱内保存。大量元素原则上可以混在一起，但硫酸镁（MgSO42H2O）和氯化钙（CaCl22 H2O）要分别单独配制，因为高浓度的Ca+和Mg+与磷酸盐混合，会产生不溶性沉淀。Ca+和PO4-一起混合易发生沉淀。但定容后，沉淀即会消失。铁盐也容易发生沉淀，需要单独配制。一般硫酸亚铁（FeSO47H2O）和乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)配成100倍浓度的铁盐螯合剂比较稳定，不易沉淀。微量元素可配成50或100倍浓度的混合母液。KI可以单独配成母液。氨基酸可以和维生素一起配成100或200倍液，也可将它们中的几种有机成分分别配制，以便配制不同培养基时使用方便。一般配制浓度为甘氨酸12mg/ml，维生素B10.51 mg/ml，维生素B60.51 mg/ml，烟酸0.51 mg/ml，肌醇20mg/l。植物生长调节物质也可以分别配制成溶液，储存于冰箱。一般浓度为0.51 mg/ml。IAA、NAA、IBA、2,4-D之类生长素，可先用少量0.1N氢氧化钠或乙醇溶解，然后再定容到所需要的体积。KT、BA等细胞分裂素则可用少量0.1N盐酸加热溶解，然后加水定容。四、培养基的配制及其灭菌1培养基的配制方法 将配制好的母液按顺序排列，并逐一检查是否沉淀或变色，避免使用已失效的母液。先取适量的蒸馏水放入容器，然后依次用专用的移液管按需要量吸取预先配制好的各种母液及生长调节剂等，并混合在一起。再将琼脂和糖加入其中，最后加蒸馏水定容至所需体积。随即用0.1N1.0N的氢氧化钠（NaOH）和盐酸（HCl）将pH调至所需的数值（一般通过高压灭菌，pH值会向酸性一则偏移0.10.3），然后分装到培养瓶中。培养基的pH值因培养材料的来源而异，大多数植物都要求在pH5.65.8的条件下进行组织培养。2培养基的灭菌 培养基一般采用湿热灭菌法，即把分注培养基后的培养器皿置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌。用1.1公斤/厘米2（15磅/英寸2)，121C的温度，灭菌 1520min，即可达到灭菌的目的。若灭菌时间过长，会使培养基中的某些成分变性失效。进行高压蒸汽灭菌时，要注意排出空气，一般是待水沸腾后蒸汽连续排出时，维持半分钟；或一开始就关闭排气阀，待压力达到5磅时，然后排气。灭菌后应尽快地转移培养瓶使其冷却。一般应将培养基储藏于30C以下的室内。应当注意的是，某些生长调节物质如IAA、ZT、ABA等以及某些维生素遇热是不稳定的，不能和其它培养基一起高压消毒，而要进行过滤消毒。液体培养基的配制方法，除不加琼脂外，其它与固体培养基相同。 3玻璃器皿的灭菌 玻璃器皿可采用湿热灭菌法，即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达2530分钟；也可以用干热灭菌法，即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌；还可以把玻璃器皿放入水中煮沸灭菌。4金属器械的灭菌 金属器械一般用火焰灭菌法，即把金属器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上燃烧灭菌。这一步骤应当在无菌操作过程中反复进行。金属器械也可以用干热灭菌法灭菌，即将拭净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。第三节常用培养基的配方及其特点一、几种常用培养基的配方组织培养中常用的培养基主要有MS、White、N6、B5、Heller、Nitsh、Miller、SH等。它们的配方如下（表1-2）。二、几种常用培养基配方的特点（一）MS培养基 MS培养基是1962年Murashige和Skoog为培养烟草材料而设计的。它的特点是无机盐的浓度高，具有高含量的氮、钾，尤其硝酸盐的用量很大，同时还含有一定数量的表1-2几种常用培养基的配方 单位：mg/L化合物名称MS(1962)White(1943)N6(1974)B5(1968)Heller(1953)Nitsh(1972)Miller(1967)SH(1972)NH4NO31650 7201000 KNO319008028302527.5 95010002500(NH4)2SO4 463134 NaNO3 600 KCl 65 750 65 CaCl22 H2O440 16615075166 200Ca(NO3)24H2O 300 347 MgSO47H2O370720185246.525018535400Na2SO4 200 KH2PO4170 400 68300 K2HPO4 300FeSO47 H2O27.8 27.8 27.85 15Na2-EDTA37.3 37.3 37.75 20Na-Fe-EDTA 28 32 FeCl36H2O 1 Fe(SO4) 3 2.5 MnSO44 H2O22.374.4100.01254.4 ZnSO47 H2O8.631.521101.5 Zn (螯合体) 0.