2012CB945100 血管发育和稳态维持的遗传及表观遗传机制.doc

项目名称：血管发育和稳态维持的遗传及表观遗传机制首席科学家：杨晓 中国人民解放军军事医学科学院起止年限：2012.1至2016.8依托部门：总后勤部卫生部一、关键科学问题及研究内容关键科学问题脊椎动物的血管发生和血管形成是一个高度保守的涉及多种细胞特化和定向分化以及相互作用的复杂过程。血管内皮细胞如何通过遗传和表观遗传机制对细胞内外的调控信号做出精确的反应并与相邻的不同类型细胞相互作用，历经血管发生和血管形成逐渐发育成具有精细复杂等级结构的功能性血管网络并保持其稳态；这些调控机制的异常和紊乱又如何导致心脑血管疾病的发生是本项目关注的关键科学问题。具体包括：1、血管发生的遗传和表观遗传机制：血管系统形态建成的分子机制；表观遗传修饰的改变（重点关注组蛋白的甲基化修饰以及基因组的甲基化修饰）是否可以在血管形成过程中起到调节作用。2、血管内皮细胞特化和定向分化的分子基础：原始造血系统中成血管母细胞分化成血细胞和血管内皮细胞的谱系关系及其分子机理；定向造血系统中主动脉腹侧内皮细胞如何维持其细胞特异性或转化为造血干细胞的分子机理；冠脉内皮细胞特化的分子机制。3、重要信号通路影响血管重塑的遗传和表观遗传机制：TGF-b和VEGF信号通路及其调控的miRNA调节内皮细胞功能、内皮细胞-壁细胞相互作用、及其对血管重塑和稳态维持的功能和机制。4、血管损伤后重塑的分子机制：血管损伤及重塑过程中凋亡平滑肌细胞的炎症放大作用及其机制；牵拉刺激引起内皮细胞炎症分子的释放；血管损伤及重塑过程中血管平滑肌细胞增生的分子机制和干预措施。主要研究内容1、血管发生是血管发育的早期事件，涉及图式形成、内皮细胞命运决定和分化等发育生物学和细胞生物学基本科学问题。本项目拟利用斑马鱼作为模式生物，通过大规模诱变技术筛选血管发生异常的突变体，寻找血管及相关组织器官发育的重要调控因子与标记基因，进而深入研究它们在血管发生过程中的功能。在血管发生的表观遗传学机制方面，通过表达谱测序来得到斑马鱼中特定时期可能存在的甲基化酶或去甲基化酶，克隆得到这些基因，通过体外合成mRNA后进行注射以验证这些基因在血管发生过程中的作用。通过构建表达甲基化酶或者去甲基化酶的转基因鱼，结合体外生化实验验证这些甲基化酶或者去甲基化酶在血管形成不同时期的生理功能。此外，通过转基因方法在血管内皮细胞中特异性表达绿色或红色荧光蛋白（GFP或RFP），结合长时间在体双光子或共聚焦显微镜成像技术，实时记录和跟踪中脑内的所有血管的三维形态变化。进而，运用图像分析、流体力学模型分析、细胞生物学、分子生物学等手段，研究脑血管网络发生和发育的宏观规律和分子机制。2、探讨血管内皮细胞特化和定向分化的分子基础。利用多种特异性标记血管系统的转基因鱼和大规模诱变技术筛选影响血管发生和造血系统的突变体，通过共聚焦显微镜进行实时观察并比较野生型与突变体中血管发生和造血过程的差异，研究血液血管母细胞分化成血管内皮细胞和血细胞的谱系关系及其调控网络。同时，结合内皮细胞特异性基因敲除技术，研究主动脉腹侧内皮细胞定向分化为造血干细胞的分子调控机理。此外，寻找高等哺乳动物小鼠的冠脉内皮细胞起源，利用Cre-LoxP技术揭示Notch信号通路调控冠脉发生以及内皮细胞生物学活性的分子机制，阐明心外膜促进冠脉发生的重要生理功能和机制。3、在重要信号通路影响血管重塑的遗传和表观遗传机制研究方面，主要利用基于Cre-LoxP系统的小鼠组织特异性条件基因敲除技术，构建血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、脑血管内皮细胞特异性基因敲除小鼠，深入研究不同类型心血管细胞如何对来自自身和环境的TGF-b和VEGF信号做出精确反应，以及这种反应性异常如何导致血管重塑异常以及心血管疾病的发生。同时筛选受TGF-b调控的miRNA，并对这些miRNA调节内皮细胞功能、内皮-壁细胞相互作用、及其在血管重塑过程中的功能和机制进行深入的探讨。4、综合利用基因敲除小鼠和多种血管损伤模型，深入研究血管损伤后重塑的分子机制。主要探索血管损伤后平滑肌细胞凋亡的关键信号通路IGF-1R-SGK1的作用、研究介导血管损伤后凋亡平滑肌细胞的炎症放大作用的关键分子机制、阐明血管损伤及重构过程中炎症细胞的来源、阐明阻断COX-2来源的前列腺素对血管损伤后内膜增生的保护作用及其分子机制。同时明确深海鱼油EPA/DHA是否协同COX通路干预血管重塑、深海鱼油EPA能否调节动脉损伤后血管重塑、以及深海鱼油EPA与阿斯匹林协同调节血管损伤后重塑以及抗血栓作用和机制。二、预期目标总体目标：本项目瞄准血管发育研究领域的前沿，整合国内优秀研究团队，系统深入地开展血管发生和血管形成的遗传和表观遗传机制研究。本项目的总体目标如下：阐明血管发生和血管形成过程中新的遗传和表观遗传机制；揭示血管内皮细胞特化和定向分化的调控机制；明确重要信号通路及其调控因子包括miRNA调节血管重塑稳态维持的功能和机制；探索血管损伤后重塑的分子机制及其干预措施。通过本项目的实施，建立和完善血管发育研究的新的技术体系，实现在血管发生、血管形成及其稳态维持研究方面的理论创新，建立多种人类心血管疾病的遗传修饰动物模型，为心脑血管疾病的风险预警、精确诊断、有效治疗和药物研创提供新思路、新途径和新靶标，并在本项目的实施过程中建立一支具有国际竞争力的研究团队。五年预期目标：1、发现一批新的调控血管发生和血管形成的基因、组蛋白修饰因子或miRNA，阐明这些调控因子影响血管发育的生理功能和分子机制；研制一批模拟人类心血管疾病的新型遗传修饰动物模型；筛选鉴定一批具有潜在临床应用价值的心血管疾病诊断及治疗的新的分子靶标。2、建立一整套血管发生和血管形成研究的技术平台和技术体系。3、培养一批中青年学术带头人和学术骨干；培养研究生（含硕、博）50名以上、博士后12名以上。4、在国际一流杂志（IF10）发表论文8篇以上，在有影响力的杂志（IF5）上发表论文20篇以上。三、研究方案总体研究思路和项目研究的技术路线及可行性本项目分为四个课题，将综合利用遗传修饰斑马鱼和小鼠的不同优势，全面系统地研究血管发生和稳态维持的遗传和表观遗传机制，为理解血管发育异常相关疾病的病理和分子机制提供新的线索。前两个课题着重研究血管发生过程中的遗传和表观遗传机制，课题一侧重于通过高通量测序与诱变筛选影响血管发生的新型调控因子，而课题二重点研究生血内皮特化和冠脉发育的机制。课题三和课题四分别研究生理性血管重塑和病理性血管重塑的遗传和表观遗传机制，研究不同心血管细胞如何对重要信号做出精确反应及其维持心血管稳态的作用和机制。四个课题分别关注血管发育和稳态维持不同阶段主要的科学问题，四个部分各有侧重，又紧密衔接。课题组间通过合作互相促进。课题一：血管发生和调控的分子机制在血管及相关组织的基因表达调控网络方面，本课题拟首先从前期工作中筛选到的转基因库入手，通过FACS分选结合新一代测序技术得到血管及相关组织的全基因组表达谱。通过表达谱分析，辅以文献查阅、生物信息学分析遴选感兴趣的基因，特别是编码甲基化酶、去甲基化酶的基因。随后，综合运用多种手段获得感兴趣基因的瞬时或稳定的过表达或失活突变体，例如利用体外合成mRNA或morpholino（MO）进行单细胞胚胎注射瞬时改变基因的表达，构建基于Hsp、Gal4/UAS等系统的时空特异性转基因鱼系以稳定改变基因的表达，或者通过人工锌指核酸酶（ZFN）介导的基因打靶获得突变体，同时从已有的突变体库中遴选感兴趣的突变体，通过观察胚胎的表型、（通过整体胚胎原位杂交）检测血管特异性标记基因的表达、检测胚胎甲基化水平的改变，在多层次上研究感兴趣的基因及其突变在血管及相关组织器官发育过程中的功能，从中寻找血管及相关组织器官发育的重要调控因子与标记基因，研究这些因子的作用机制及其与其它因子之间的相互作用，研究甲基化跟血管发育的关系，为阐明血管及相关组织器官的发育与分子调控机制提供必要的理论与实验基础。在血管网络的形态发生方面，本课题拟构建在血管内皮细胞中特异性表达GFP或RFP的转基因鱼系，通过双光子或共聚焦显微成像技术，实时、动态观察并记录中脑血管网络的三维构建过程。同时，结合图像分析、流体力学模型分析，并应用细胞生物学与分子生物学实验技术，探索脑血管网络的发育规律与机制，及其与脑发育与脑疾病的关系。总体研究方案如下：课题二：血管内皮细胞特化和分化的调控机制本课题将利用转基因斑马鱼遗传学和胚胎发育的优势以及本课题组筛选到的多个影响造血系统和血管生成的突变体，结合已建立的多种特异性标记血管系统的转基因斑马鱼scl-DsRed和scl-GFP，通过共聚焦显微镜进行实时观察（live image）并比较野生型与突变体中造血及血管生成过程的差异，从而阐明在此过程中起重要调控作用的分子网络。同时利用scl转基因和scl基因敲低的斑马鱼来研究Scl在淋巴管形成中的作用，以及它与其他淋巴管形成调节因子的相互作用。课题组还利用转基因小鼠模型来研究冠脉内皮细胞发育过程及其调控的分子机制。主要通过Cre-LoxP系统的组织特异性条件基因敲除技术，构建冠脉内皮特异性Cre小鼠，同时利用体内组织特异性转录因子标记技术和免疫共沉淀技术及ChIP-Seq技术，深入研究Notch信号通路以及HIF转录因子在调控冠脉内皮细胞的增值和分化过程中的分子机制。总体方案如下：课题三：血管内皮细胞及其微环境在血管重塑中的作用和机制本课题将利用基于Cre-LoxP系统的组织特异性条件基因敲除技术，研制血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、脑血管内皮细胞特异性TGF-bII型受体、Smads以及VEGFR2条件基因敲除小鼠，深入研究血管内皮细胞和平滑肌细胞如何对TGF-b和VEGF信号做出精确反应并调节内皮分泌、血管重塑以及脑血管重塑和稳定性的生理功能和机制。利用高通量芯片、酵母双杂交、免疫共沉淀结合质谱等技术筛选与TGF-、雌激素和缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路相互作用的新型血管调控候选因子，并深入研究这些候选因子对血管生成靶基因的选择性及表达的影响，探索候选因子调控血管生成的分子机制。此外，利用心血管特异性条件基因敲除小鼠筛选受TGF-b信号调节的miRNA，并深入研究这些miRNA调节血管内皮细胞或者血管平滑肌细胞功能和稳态维持的作用和机制。总体研究方案如下：课题四：血管损伤以及重塑的分子机制血管平滑肌细胞腔内迁移与增生导致官腔变窄是血管成形术和自体血管移植失败的主要原因，但其内在分子机制尚不清楚。本课题将在前期工作的基础上以小鼠静脉移植为研究模型，以平滑肌细胞凋亡为切入点，以凋亡平滑肌细胞的炎症放大反应为主轴，利用小鼠静脉移植模型及体外机械拉力系统，深入研究平滑肌细胞凋亡的分子机制（围绕IGF-1R-SGK1信号转导通路）；进一步利用基因缺陷小鼠静脉移植模型明确凋亡平滑肌细胞炎症放大作用的分子机制（如巨噬细胞激活作用）,结合特殊转基因工具小鼠的静脉移植模型研究静脉移植过程中炎症细胞的来源及类型；试图阐明血管损伤后凋亡平滑肌细胞通过放大炎症细胞导致血管损伤后重塑的分子机制。同时，小鼠股动脉损伤（内皮细胞剥脱）为研究模型（模仿动脉成形术），以转基因动物为研究工具，围绕膜磷脂代谢通路，深入研究主要炎性介质（如前列腺素或深海鱼油代谢产物）对动脉损伤后血管重塑的保护作用，并了解其可能信号通路的分子机制，观察阿司匹林（前列腺素抑制剂）与鱼油干预对动脉损伤后血管重塑的协同作用。从而最终为血管损伤及重塑研究提供理论依据，期望优化冠心病、血管成形术后重塑等现有预防和治疗方案、发现新的抗心血管疾病的靶点。总体研究方案如下：创新点1、利用遗传修饰斑马鱼和小鼠作为模式生物，在动物整体水平上研究血管发育和稳态维持的分子机制。2、综合利用遗传修饰斑马鱼和小鼠的优势，采取正向遗传学和反向遗传学策略相结合的策略，高通量筛选和精细突变技术相结合的技术路线，如利用斑马鱼大规模诱变技术筛选血管发生异常的突变体，寻找血管发生的重要调控因子与标记基因并进行功能研究；利用小鼠组织特异性条件基因敲除技术深入剖析重要信号通路在血管重塑和稳态维持中的机制，可能发现血管发生和发育调控的新的机制。3、建立和完善血管发育研究的新的研究方法和技术体系。4、实现在血管发生、血管形成及其稳态维持研究方面的理论创新。5、建立新型人类心血管疾病的遗传修饰动物模型，为心脑血管疾病的预防和治疗提供新靶标。课题设置课题1、血管发生和调控的分子机制主要研究内容：以斑马鱼为主要的研究模式，充分利用本课题独有的转基因与突变鱼系资源，综合应用morpholino knock down、人工锌指核酸酶介导的基因定点突变等各种遗传学手段，结合整体胚胎原位杂交、FACS分选以及深度测序等各种分子生物学与细胞生物学技术，获得血管及相关组织关键发育时期的组织特异性基因组表达谱，在血管起源与前体细胞的诱导、决定与早期分化调控机制、血管新生的关键因子与信号通路，以及血管发育与血细胞生成的相互作用与机制等方面取得新的进展。通过表达谱测序遴选斑马鱼中特定时期可能存在的甲基化酶或去甲基化酶，通过注射mRNA、构建多种形式的转基因鱼（例如时空或组织特异性表达甲基化酶或去甲基化酶或其突变形式），在血管形成的不同时期人为改变整个胚胎中的组蛋白或DNA的甲基化水平，检测这些基因对血管发生的作用。通过转基因方法在血管内皮细胞中特异性表达绿色或红色荧光蛋白（GFP或RFP），结合长时间在体双光子或共聚焦显微镜成像技术，实时记录和跟踪中脑内的所有血管的三维形态变化。进而，运用图像分析、流体力学模型分析、细胞生物学、分子生物学等手段，研究脑血管网络发育的宏观规律和分子机制。预期目标：在个体、组织、细胞及分子等不同的层次上围绕全基因组表达谱、血管网络形态发生以及基因表达调控网络揭示脊椎动物血管系统发生和调控的遗传与表观遗传机制，以及血管与其它相关组织器官的相互作用。在宏观尺度上揭示血管网络构建的时空规律，在微观尺度上阐述血管网络发育的分子机制，从而为阐明脊椎动物血管与血细胞发育调控机制提供新的实验证据，为先天性心血管疾病与肿瘤的预防、诊断与治疗、再生医学等应用提供坚实的理论基础。承担单位：北京大学、中国科学院上海生命科学研究院、清华大学课题负责人：张博学术骨干：杜久林、贾顺姬、于蓬春经费比例：28.8%课题二：血管内皮细胞特化和分化的调控机制主要研究内容：建立斑马鱼转基因动物模型来跟踪血管的动态发展，包括分别用DsRed或GFP来标记scl-或scl-的scl转基因斑马鱼。从单细胞水平观察表达任何一种scl亚型的细胞动态行为以及其它们与其他因子的相互关系和相互作用。利用激光共聚焦显微镜长时程活体动态观察胚胎脉管系统的形成过程。在功能方面，我们首创条件性（可诱导性）scl基因敲除斑马鱼品系，它可以在期望的细胞群和时间点获得任何一种scl亚型失活或恢复。加上利用斑马鱼大规模正向遗传学筛选已经获得的66种不同的造血或血管发育缺陷突变体以研究它们与scl基因之间的相互关系，从而分析在血管新生和血管生成过程中调节血管内皮细胞特化和分化的联合作用机制以及转录因子之间的相互作用。利用上述建立的技术平台研究scl在淋巴管形成中的作用以及它与其它淋巴管形成调节因子的相互作用。本研究将有助于了解淋巴系统起源和早期形成。我们同时利用基于Cre-LoxP系统的组织特异性基因表达或基因敲除技术，通过系统的动物整体和组织学表型分析，构建体内组织特异性转录因子标记技术平台，探索与Notch信号通路相互作用的新型血管调控因子和下游调控血管内皮细胞生物学特性的靶基因。预期目标：阐明斑马鱼原始造血系统中成血管母细胞分化成血细胞和血管内皮细胞的谱系关系及其分子机理。发现斑马鱼定向造血系统中主动脉腹侧内皮细胞如何维持其细胞特异性或转化为造血干细胞的分子机理。寻找到高等哺乳动物小鼠的冠脉内皮细胞起源，利用Cre-LoxP技术研究Notch信号通路如何调控冠脉发生，揭示Notch调控内皮细胞生物学活性的机制，阐明心外膜促进冠脉发生的重要作用。以上工作为先天性冠脉发育畸形病理生理过程提供理论基础，并为缺血性心肌病提供新的治疗靶点。承担单位：中国科学院上海生命科学研究院、南方医科大学课题负责人：周斌学术骨干：温子龙、张文清、张跃波、廖旺军、廖禹林经费比例：19.4%课题三：血管内皮细胞及其微环境在血管重塑中的作用和机制主要研究内容：利用基于Cre-LoxP系统的组织特异性基因表达或基因敲除技术，通过系统的动物整体和组织学表型分析、体外细胞功能检测和体外生化实验深入研究TGF-b和VEGF信号在生理性血管重塑或者损伤后内皮分泌炎症分子以及血管重塑过程中的功能和机制。利用高通量芯片、酵母双杂交、免疫共沉淀结合质谱等技术筛选与TGF-、雌激素和HIF-1信号通路相互作用的新型血管形成调控候选因子以及受TGF-b信号通路调节的miRNA。利用各种蛋白质间相互作用技术验证新型候选因子与上述信号通路中核心蛋白的相互作用。利用基因过量表达和敲低/敲除技术、实时定量RT-PCR、染色质免疫沉淀（ChIP）、ChIP-seq、Western blot等方法检测这些候选因子和miRNA对血管生成靶基因的选择性及表达的影响，包括对已知血管生成相关的重要调节因子如血管内皮细胞生长因子（VEGF）等表达的影响，探索候选因子和miRNA调控血管形成的分子机制；在体外细胞水平和体内小鼠模型中检测候选因子和miRNA对血管内皮细胞增殖、迁移和血管形成的影响。预期目标：阐明TGF-b和VEGF信号调节内皮细胞及其微环境的遗传和表观遗传机制及其调控血管重塑和稳态维持的生理功能和机制。发现一批新的与TGF-b、VEGF和雌激素信号通路相互作用的新型血管形成调控候选因子以及受TGF-b信号通路调节的miRNA，阐明这些新型调控因子在血管形成中的功能，为相关心血管疾病研究提供新的实验模型和候选治疗靶标。承担单位：军事医学科学院、北京大学课题负责人：杨晓学术骨干：叶棋浓、罗金才、兰雨、王剑、姜怡经费比例：32.4%课题四：血管损伤以及重塑的分子机制主要研究内容：由血管内膜高度增生为特征的血管重塑导致血管阻塞性疾病的主要原因如脑梗塞、冠心病，支架后和动静脉搭桥后复发。动脉和静脉损伤后血管重塑的病理学机制不完全相同。本课题将从静脉移植后重塑与动脉机械损伤后重塑入手分别研究其内在机制及其可能干预效果。静脉移植后重塑机制：将围绕IGF-1R-SGK1信号通路，利用机械拉力装置、三维培养模型体外模型和IGF-1R基因敲除小鼠、SGK1基因敲除小鼠静脉移植模型模拟静脉移植后的损伤及重塑过程，深入研究血管损伤后平滑肌细胞凋亡的分子机制。同时从巨噬细胞表面介导凋亡平滑肌细胞清除的关键受体入手，利用纳米胶3维共培养模型，研究凋亡平滑肌细胞的清除机制及炎症放大作用。最后利用CX3CR1-GFP转基因小鼠的静脉移植模型，结合传统的分子生物学方法阐明血管损伤及重构过程中炎症细胞的来源。最终深入了解静脉移植后重塑的始动机制。动脉机械损伤后重塑：将瞄准血管急性炎症分子COX-2及其脂质代谢通路的关键酶与受体，利用小鼠的动脉内皮损伤模型，寻找COX代谢的关键前列腺素、受体、介导血管平滑肌细胞迁移、增生的信号转导通路；同时，深海鱼油（EPA/DHA）也通过COX代谢，产生具有血管保护作用的前列腺素样产物，我们将分析其对血管重塑的影响，分析其可能机制；最后，研究深海鱼油结合COX抑制剂如阿司匹林，分析其对动脉损伤后血管重塑的协同保护作用及其新的机制（如阿司匹林介导的Resolvin产物）。预期目标：血管内膜增生、管腔变窄是支架植入以及静脉移植搭桥失败的主要病理特征，是冠心病的复发的病理基础。早期平滑肌细胞凋亡诱发这一事件和炎性介质如前列腺素参与了这一病理过程。本课题总的目标：1）利用静脉移植模型，验证血管损伤后平滑肌细胞凋亡的关键信号通路；阐明介导血管损伤后凋亡平滑肌细胞的炎症放大作用的关键分子机制；明了血管损伤及重构过程中炎症细胞的来源。2）利用动脉损伤模型，明确炎症因子诱导表达基因COX-2在血管损伤后重塑的作用，了解其代谢的前列腺素及其相应受体介导的信号通路在血管重塑变化，期望找到潜在的预防和抑制血管内膜增生的靶点；明了EPA在抗血管重塑的中作用及其分子机制；阿司匹林能否协同使用抗血管损伤后血管内膜增生以及抗血栓形式，以及其可能协同作用机制。为下一步确定心血管预防和治疗提供理论依据。承担单位：中国科学院上海生命科学研究院、首都医科大学附属北京安贞医院课题负责人：余鹰学术骨干：杜杰、申毓军、顾云经费比例：19.4%各课题间相互关系根据上述的目标和主要研究内容，结合国内外在这一领域的发展趋势和临床需求，设置四个子课题，总体情况如下：四个课题之间既相对独立、又紧密连接。四个课题分别关注血管发育不同发育阶段重要的科学问题，采取斑马鱼和小鼠相结合、高通量诱变筛选和组织特异性遗传修饰技术相结合、动物整体与分子生物学技术相结合、模式动物和临床样本相结合的策略，全面系统地研究血管发育、重塑和损伤修复过程中的遗传和表观遗传调控机制。四、年度计划研究内容预期目标第一年1、利用遗传修饰斑马鱼模型分析血管发育相关候选基因及表观遗传修饰调节蛋白的时空表达谱。2、建立脑血管三维网络定量分析方法。研究脑血管三维网络发育的规律。3、研究scl-的表达和主动脉内皮细胞形成造血干细胞过程的相互关系。4、研制一系列在特定心血管系统细胞特异性转基因或条件基因敲除小鼠。5、筛选受血管发育重要信号通路调节或相互作用的新型调控分子或miRNA。6、利用小鼠静脉移植模型和股动脉损伤模型，检测炎症因素候选基因的表达、细胞定位以及对血管重塑的作用。1、筛选得到一系列与斑马鱼血管生成相关的候选基因以及表观遗传修饰蛋白。2、初步揭示脑血管网络发育的宏观规律。3、初步阐明斑马鱼研究其原始造血系统中成血管母细胞分化成血细胞和血管内皮细胞的谱系关系及其分子机理。4、获得一系列表达或敲除效率明确的特定心血管细胞类型特异性转基因或条件基因敲除小鼠。5、获得新型血管调控候选因子以及在不同类型心血管细胞中受重要信号通路调控的候选miRNA。6、建立完善小鼠静脉移植模型、股动脉损伤模型，明确炎症因素候选基因的表达、细胞定位以及对血管重塑的作用。7、发表SCI研究论文3-4篇。培养研究生8-10名。第二年1、遴选感兴趣的基因，利用基于ZFN或其它方法的基因定点突变技术制备斑马鱼突变体。筛选与血管内皮细胞发育相关的甲基化调节蛋白。2、研究血管新生和血管修剪在脑血管三维网络发育过程中的作用，建立基于G-CaMP的脑血管内皮细胞钙成像技术。3、研究scl-的表达和主动脉内皮细胞形成造血干细胞过程的相互关系。4、继续研制新型在特定心血管系统细胞特异性条件基因敲除小鼠。对突变小鼠进行系统的动物整体和组织学表型分析。5，利用各种蛋白质间相互作用技术验证新型候选因子与相关信号通路中核心蛋白的相互作用。6，利用体外细胞模型，检测候选基因或miRNA对心血管系统细胞增殖、迁移、血管生成、内皮细胞-周细胞相互作用等功能的影响。7、建立机械牵张力刺激下的三维细胞培养模型，研究候选基因对静脉移植后新生内膜形成、炎性细胞浸润、巨噬细胞表型分化的作用。研究COX下游的前列腺素产物的相应受体在动脉损伤后重塑的作用及其分子机制。1、初步建立血管及相关组织器官的全基因组时空表达谱。制备3个候选基因的突变体，确认2-3个新的血管生成相关候选基因的功能。2、揭示脑血管三维网络形成的细胞生物学机制。3、明确斑马鱼定向造血系统中主动脉腹侧内皮细胞如何维持其细胞特异性或转化为造血干细胞的分子机理。4，明确构建的新型心血管细胞特异性条件基因敲除小鼠的血管相关表型。5，证明新型血管调控候选因子与相关信号通路中核心蛋白存在相互作用。6，明确候选基因或miRNA对心血管系统细胞体外功能的影响。7、阐明IGF-1R、AMPK在机械牵张力引起的静脉平滑肌细胞凋亡中的作用；明确CARD9、cathepsin S、CD73在静脉移植后血管重构中的作用。明确前列腺素E受体在动脉损伤后重塑的作用和可能介导信号转导通路。8、发表SCI研究论文5-6篇。培养研究生8-10名。第三年1、选择具有血管及相关组织器官发育缺陷的突变体，深入分析表型。遴选感兴趣的基因，继续制备突变体。2、通过单细胞活体示踪技术和变色荧光蛋白方法，分析脑血管内皮细胞的来源和它们进入脑部后的迁移方式。研究Ca2+在血管内皮细胞迁移中的作用。3、研究参与EHT过程转录因子如scl-、runx1和c-myb之间的分子机制框架。4、研究胚胎发育过程中冠脉内皮细胞的起源。构建冠脉特异性基因敲除或心外膜特异性基因敲除小鼠模型，进行胚胎发育过程中内皮细胞的表型鉴定。5、体外研究重要信号通路分子在不同类型心血管细胞缺失以及过表达对细胞增殖、迁移、血管生成、细胞分泌、胞外基质合成等功能的影响。6、检测新型重要信号通路相互作用蛋白对血管生成靶基因的选择性及表达的影响。7、TGF-信号通路调节miRNA靶分子的鉴定和验证。8、研究条件性敲除候选基因对移植静脉中细胞凋亡的作用及静脉移植后新生内膜形成的改变。观察EPA/DHA对血管损伤后重塑的影响，同时明确EPA/DHA是否同COX通路干预血管重塑，或者还是其他分子机制。1、完善血管及相关组织器官的全基因组时空表达谱分析。获得6个新的斑马鱼基因突变体。确认2-3个新的血管生成相关候选基因的功能。2、揭示脑血管内皮细胞的来源及其进入脑部的途径。3、明确scl-在造血干细胞从血源性内皮起始的过程。4、鉴定新构建的基因敲除的小鼠内皮细胞表型，发现在胚胎发育过程中血管形成缺陷。5、明确TGF-、VEGF信号通路特定分子对不同类型心血管细胞体外功能的影响。6、确定新型候选因子对血管生成靶基因的选择性及表达的影响。7、明确TGF-信号通路调节miRNA在心血管系统细胞中的靶分子。8、验证IGF-1R、AMPK通过调节静脉平滑肌细胞凋亡调控静脉移植后新生内膜形成；明确静脉移植过程中CARD9、CD73的激活；验证巨噬细胞活化后cathepsin S对于静脉平滑肌的调控作用。了解EPA/DHA对动脉损伤后重塑的作用，及其分子机制。9、发表SCI研究论文6-7篇。培养研究生10-12名。第四年1、继续筛选突变体库，选择具有血管及相关组织器官发育缺陷的突变体，深入分析表型与作用机制。2、研究血脑屏障形成的相关分子机制。以及Ca2+在血管生长和修剪中的作用。3、继续研究参与EHT过程转录因子如scl-、runx1和c-myb之间的分子机制框架。4、通过芯片比对结合体外生化实验，筛选重要信号通路分子（TGF-信号、VEGF信号、Notch信号等）在不同类型心血管细胞的靶基因。5、确定与重要信号通路相互作用的候选因子调控血管生成的分子机制。6、心血管系统组织特异性过表达miRNA转基因小鼠的研制。7、研究候选基因参与机械