慢性阻塞性肺病患者肺内细胞增殖与凋亡的研究.doc

细胞凋亡研究慢性阻塞性肺病患者肺内细胞增殖与凋亡的研究陶清国张珍祥徐永健【摘要】 目的 研究细胞增殖 、凋亡及其调节基因在慢性阻塞性肺病 ( CO PD) 继发肺动脉高压中的作用 。方法 应用免疫组化及原位缺口末端 DNA 碎片标记技术检测 CO PD 患者肺内细胞增殖 及凋亡 ,并用 Nort hern 杂交检测 CO PD 患者肺内 c2myc 、bcl22 及 p53 基因表达 。结果 CO PD 患者及 对照组肺内 (包括肺小血管壁) 均存在着一定比率的增殖及凋亡细胞 。两组相比 , CO PD 组增殖指数增高而凋亡指数减少 ,增殖与凋亡比值显著增高 ,约为对照组 4 倍 。在 CO PD 患者肺内 ,增殖细胞绝大部分位于肺小血管壁 , 而凋亡细胞在肺小血管壁上较对照组少见 。c2myc 、bcl22 及蛋白表达在CO PD 肺内比对照组明显增高 ,主要在肺小血管壁 。c2myc mRNA 表达量约为对照组 3 倍 ,bcl22 mR2NA 三条带表达量约为对照组 215315 倍 ,p53 基因 mRNA 表达量比对照组显著减少 ,约为 1/ 3 倍 。 结论 可能由于 c2myc 、bcl22 及 p53 基因异常表达所致的细胞增殖与凋亡异常参与了 CO PD 时的肺 血管结构改建的调节 ,亦即参与了 CO PD 继发的肺动脉高压过程 。【关键词】 肺疾病 ,阻塞性脱噬作用基因表达Apoptosis versus prol if eration activities and relative mechan ism in chron ic obstructive pul monary diseaseT ao Q i n gg uo , Zhan g Zen x i an g , X u Yon gji an . Res pi ratory Disease Resea rch L aboratory , Ton gji Hos2pi t al , Tongji M edical U ni versi ty , W u han 430030【Abstract】 Objective To st udy t he roles of apop tosis and p roliferatio n and relative genes exp ressio n in chro nic obst ructive p ulmo nary disease ( CO PD) and p ulmo nary hypertensio n. Methods Immuno his2 tochemical technique was used for t he detectio n of cell p roliferatio n and exp ressio n of relative genes. In sit u end labeling technique was used for t he detectio n of nucleoso mal DNA f ragmentatio n of apop totic cells , and Nort hern blot for t he detectio n of exp ressio n of c2myc , bcl22 and p53 genes in t he lungs wit h CO PD. Re2 sults Bot h p roliferative cells and apop totic cells were found in t he lungs wit h CO PD or wit hout CO PD. In lung tissue wit h CO PD. The p roliferatio n index was increased significantly , whereas t he apop tosis index was decreased significantly. Co mpared wit h co nt rols , t he ratio of p roliferatio n to apop tosis in lungs wit h CO PD was increased by 4 folds , and t he exp ressio n of c2myc or bcl22 mRNA was significantly increased by2 . 53 folds in lungs tissue wit h CO PD. The exp ressio n of c2myc and bcl22 p rotein was also increased sig2nificantly in lungs wit h CO PD , t he t wo antigen were p redo minantly localized in small p ulmo nary vessels. The exp ressio n of p53 mRNA was significantly decreased by 3 folds in lung tissue wit h CO PD. Conclusion The abnormality of apop tosis versus p roliferatio n activities induced by c2myc , bcl22 and p53 genes mayco nt ribute to p ulmo nary vascular st ruct ural remodeling in CO PD.【Key words】 L ung disease ,Obst ructiveApop tosisGene exp ressio n( N at l M ed J Chi n a , 1998 , 78 :574 2577)肺血管结构改建是慢性阻塞性肺病 ( CO PD) 继发肺动脉高压的最重要环节之一 ,它给肺动脉高压 治疗带来了极大困难 ,已被引起高度重视 。肺血管 结构改建的病理特征是肺小血管壁细胞 ( 平滑肌及 纤维细胞) 增殖及合成胞外基质增多1 , 对其发生的细胞及分子机理的认识还很不清楚 。Cho 等2 研 究认为 ,新生羊出生后体内动脉发育 ( 改建) 过程受细胞增殖与凋亡双重调节 。为探讨细胞增殖与凋亡机制是否亦参与 CO PD 时的肺血管结构改建的调 节 ,本研究对 CO PD 患者肺内细胞进行增殖与凋亡 综合分析 ,同时研究与细胞增殖 、凋亡密切相关的 c2 myc 、bcl22 及 p 53 基因表达 ,以进一步明确肺血管结 构改建的发生机制 。对象与方法一 、对象14 例在武汉同济医院胸外科因肺部肿瘤行肺作者单位 :430030 武汉 ,同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室叶切除术患者 。其中 CO PD 患者 9 例 ,男 6 例 ,女 3例 ,年龄平均 62 岁 。所有患者均有慢性咳嗽咳痰病 史 ,经胸片 、心电图 、超声心动图检查符合 CO PD 、肺心病诊断标准3 ;肺功能检查均有不同程度的阻塞性通气功能障碍 。非 CO PD 患者 5 例为对照组 ,男4 例 ,女 1 例 ,平均年龄 55 岁 。检查除肺部有肿块 外 ,余正常 。二 、方法1 . 免疫组织化学分析 :手术切除肺叶后 ,立即切 取一小块尽量远离肿瘤部位的肺组织 ,放入 PB S 缓 冲液中快速漂洗数次以去掉组织块中的血液 。其中1 块立即置于液氮中快速冷冻 ,用 OC T 包埋后行冰冻切片 ,再置于 10 %中性甲醛液中固定 30 分钟 ,吹 干 ,置冰箱中备用 。另一小块立即固定后行常规石 蜡切片 。2 . 凋亡检测 :采用细胞凋亡原位缺口末端 DNA碎片标记技术 ( TU N EL ) 。原理为凋亡细胞核内DNA 断裂为含 32O H 末端的碎片 ,通过缺口末端转 移酶催化连上带荧光标记的脱氧核苷酸 ,再用过氧 化物酶标记的抗荧光抗体作二抗通过底物显色而检出4。具体步骤 , 石蜡切片脱蜡至水 、37 下蛋白酶 K 消化 15 分钟 ( 浓度 10 g/ ml ,p H714 ) 、013 %H2 O2 甲醇液灭活内源酶 、PB S 洗 、加末端转移酶与荧光标记的核苷酸反应混合液 (37 ,1 小时) 、PB S洗 、过氧化物标记的抗荧光抗体 ( 37 , 30 分钟) 、PB S 洗 、DAB 显色 、苏木素核复染 、脱水透明封片 。3 . 组织化学染色 :c2myc 及 bcl22 抗原分析因石 蜡切片效果差 , 选用冰冻切片 。Ki267 染色选用石 蜡切片 。切片经胰蛋白酶消化或微波抗原修复预处理后 , 按常规 SABC 法进行染色 。c2myc 及 bcl22 、Ki267 鼠或兔抗人单克隆抗体及 SABC 试剂盒购自北京中山生物技术公司 。4 . 阴性对照 :凋亡染色加反应混合液 ,一步混合 液中不含末端转移酶 ,组织化学染色用 PB S 代替一 抗 。5 . 细胞增殖及凋亡指数统计 : 每例标本取 4 张切片 ,每张切片任取 5 个视野进行细胞计数 ,至少计 数 1 000 个细胞 。增殖指标是以与细胞增殖密切相 关的 Ki267 抗原染色表示 。增殖或凋亡指数是以明 显的增殖或凋亡阳性染色细胞占同一视野细胞总数图 1 CO PD 患者肺内凋亡细胞原位末端标记染色 ,示肺小血管壁上凋亡阳性染色细胞 TU N EL 300 图 2 CO PD 患者肺内 Ki267 抗原染色 ,示肺小血管壁上阳性染色细胞 ABC 300 图 3 CO PD 患者肺内 c2myc 抗原染色 ,可见肺内( 主要在肺小血管壁上) 大量阳 性染色细胞( 未复染核) ABC 150 图 4 CO PD 患者肺内 bcl22 抗原染色 ,示肺小血管壁上阳性染色 ABC 300的百分比表示 ,为排除细胞固定不及时造成的早期细胞自溶及非特异着色形成的弱阳性染色 ,凋亡细 胞只计数核深棕色染色者 。61No rt her n 杂交 :取新鲜的肺组织 (尽量远离肿瘤部位) ,用异硫氰酸2酚2氯仿一步提取法提取组织 中总 RNA 。杂交参照“分子克隆”第二版 :取每样品20 g RNA ,在 1 %琼脂糖甲醛凝胶中电泳后转移至硝酸纤维素膜上烤干 。经预杂交后 ,与32 P 标记的 c2 myc 的探针 (114 kb ,人 cDNA 片段 ,内切酶 Eco R I/ CL a I) , 或 bcl22 探 针 ( 018 kb , 人 cDNA 片 段 , Bam H I/ Sac I) ,或 p 53 ( 野生型) 探针 ( 118 kb ,人 cD2NA 片段 ,Bam H I) ,或2actin 探针杂交 ,洗膜后放射 自显影 ,用图像分析系统测定各杂交带总吸光度值 。 实验内参照以同一样品的2actin mRNA 杂交量显 示 。c2myc 、bcl22 或 p 53 mRNA 相对表达量是以每个杂交带总吸光度值除以相应的2actin mRNA 杂 交带的总吸光度值而得 。、71 统计学处理 : 实验数据以 x s 表示 ,采用t 检验分析约为对照组 215315 倍 。p 53 表达检出 212 kb 条带(图 5) ,CO PD 组较对照组表达量显著减少 ,约为 对照组 1/ 3 倍 。结果一 、细胞增殖与凋亡分析CO PD 组及对照组肺内均存在着一定比率的增 殖或凋亡细胞 ,增殖或凋亡阳性染色细胞在肺组织 中呈散在分布 , 有些区域相对集中 。在 CO PD 肺 内 ,增殖阳性细胞绝大部分位于肺小血管壁 ( 图 1) , 凋亡阳性染色细胞肺小血管壁上较对照组少 ( 图2) 。增殖指数 CO PD (513 117) %比对照组 ( 213 018) % , 显 著 增 多 ( P 0101 ) 。凋 亡 指 数 CO PD (116 017) %比对照组 ( 217 017) % ,显著减少 ( P 0105) 。增殖与凋亡比值 CO PD 为对照组的 4 倍 。 二 、c2myc 、bcl22 免疫组织化学染色c2myc 抗原阳性染色为胞核棕黄色 , 对照组肺内仅少许弱阳性表达 , CO PD 组肺内可见大量阳性 或强阳性表达 ,阳性细胞主要定位于肺小血管壁 (图3) 。bcl22 阳性染色为棕黄色 ,主要分布于肺小血管 壁上 , 对照组肺内仅少许弱阳性表达或不表达 , CO PD 肺内可见绕肺小血管壁全层的强阳性或阳性表达 (图 4) 。三 、No rt her n 杂交c2myc mRNA 表达检出 212 kb 条带 ,表达量显 著高于对照组 ,约为对照组 3 倍 ; bcl22 mRNA 检出315 、615 、815 kb 三条带 (因 bcl22 基因转录产物剪切修饰后为三条 mRNA) , 三条带 CO PD 表达量分别图 5 c2myc 、bcl22 和 p53 mRNA 基因表达讨论细胞凋亡即程序性细胞死亡是普遍存在的一种细胞死亡的生理形式 。与坏死不同 ,它不引起机体局部或全身的炎症反应 ,是细胞悄悄进行的“自杀”。与细 胞 增 殖 一 样 , 它 也 可 以 调 节 组 织 结 构 的 改建5。诱导细胞凋亡可作为各种增殖疾病的治疗手段 。CO PD 时发生的肺血管结构改建 ( PV SR) 实质上是肺小血管壁的一种增殖性疾病 。本研究结果 表明 ,在非 CO PD 患者 , 肺血管壁发生较低的增殖 水平可被同时发生的相应的自发性凋亡水平所平衡 ,以保持血管壁细胞数的相对稳定 。而在 CO PD组 ,肺血管壁细胞由于增殖加强而凋亡相应减少 ,造成细胞增殖凋亡失衡 ,无法维持细胞数稳定 ,这种失衡长期进行 ,最终造成细胞累积而形成 PV SR 。 细胞增殖与凋亡的调节与相关基因的表达密切相关 。c2myc 基因产物是决定细胞命运即增殖 、静止 、分化 、凋亡的中心调节子6 ,bcl22 表达产物是细 胞凋亡的强力抑制剂 。p 53 基因产物是一种细胞凋 亡促进剂 。Bisso nnet te 等7 研究发现 , 用 c2myc 及bcl22 基 因 转 染 的 细 胞 表 现 出 极 强 的 增 殖 活 性 。 Bennet t 等8 报道 ,c2myc 基因诱导的大鼠动脉血管 平滑肌细胞发生的凋亡依赖 p 53 基因表达的增强 。 本研究结果显示 ,c2myc 及 bcl22 基因在 CO PD 肺内 表达显著增多 ,而 p 53 基因表达显著减少 。可以推测在 CO PD 患者 , 由于慢性缺氧等刺激 , 引起肺血 管壁细胞 c2myc 基因表达增强 , c2myc 本身都有促 进细胞增殖与凋亡两种互相矛盾的趋势6 ,但由于 同时 bcl22 基因表达增加及 p 53 表达减少 ,凋亡趋势 被抑制 ,细胞生长总体上表现出增殖效应 ,因而促进了肺血管结构改建的进程 。由于 CO PD 缺氧等病理因素刺激 ,肺血管壁细胞 c2myc 、bcl22 及 p 53 基因表达异常 ,细胞增殖与凋亡比增高 ,引起了 PV SR ,促进了肺动脉高压进程 。参 考 文 献1Vender RL . 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