75海藻卤代成分的快速识别、分离鉴定及生物活性研究季乃云.doc

海藻卤代成分的快速识别、分离鉴定及生物活性研究+国家高技术研究计划（863计划）资助项目（2007aa09z403）。*通讯联系人。email: 季乃云，李可，段小娟，王斌贵，李晓明*中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室，山东 青岛 266071摘要：卤代化合物是一类分布较窄、在其它资源中较为少见的化学成分。我们通过反复实验，探索、改进了海藻卤代化合物的tlc显色剂，与hplc-uv、hplc-ms联用技术结合，建立了高效快速检测、鉴定海藻卤代化合物的研究体系与研究方法；对5种海藻的化学成分进行了研究，综合运用各种现代分离技术从中获得了100余种单体成分，采用现代波谱技术鉴定了所有化合物的结构，发现新结构成分22个，主要包括卤代萜类、卤代酚类、卤代聚醚类、卤代c15-多聚乙酰类化合物；通过系统的活性筛选，发现若干成分具有显著的自由基清除活性、抗肿瘤活性和昆虫杀虫、拒食活性。研究结果丰富了海洋天然产物化学的研究内容，为海藻资源的有效利用提供了一定的科学依据。关键词：海藻，卤代成分，化学结构，生物活性。1、引言海洋是一个各种生物共存的复杂生态系统。丰富多样的海洋生物能在高压、高盐、低氧、竞争激烈的海洋环境中长期共存，相互适应、相互制约、协同进化，形成了一个独特复杂的生态环境系统，并由此产生各种新颖独特的药用化合物，为海洋药物研究提供了巨大的资源宝库，是研究发现创新药物先导结构或目标分子的重要来源。海藻是海洋生物中的一大类生物物种，是海洋的初级生产力，在海洋生物食物链中处于被捕食的地位。为了防御其它海洋生物的捕食，海藻具有产生特殊化学防御物质的能力，并因此为海洋天然药物化学研究提供了有价值的研究对象。卤代化合物是最具特色的海藻次生代谢产物之一。我们经过反复探索与实践，建立了一套完整、有效的海藻卤代化合物研究体系与研究方法，通过系统的资源调查、样品采集与实验筛选，从若干样品中选择了5种海藻开展了系统的化学成分研究，从中分离获得了100余种单体成分，采用现代波谱技术鉴定了所有化合物的结构，发现新结构成分22个，主要包括多卤素取代的萜类、酚类、聚醚类、c15-多聚乙酰类化合物；通过系统的活性筛选，发现若干成分具有显著的自由基清除活性、抗肿瘤活性和昆虫杀虫、拒食活性。本文对我们在该领域的最新进展做一简要报道。2、材料与方法2.1 生物样品海藻样品主要采集于我国近海海域，包括了由南往北我国主要的典型海区，涵盖了热带、亚热带、暖温带、温带等主要的海藻样品，具有较为丰富的多样性和一定的代表性，主要包括凹顶藻、蜈蚣藻、多管藻和鸭毛藻等。2.2 仪器和试剂nmr用bruker avance 500 mhz核磁共振仪测定；紫外光谱用spectrumlab 54 紫外分光光度计测定；hplc采用戴安（dionex）高压液相色谱仪系统 dionex p680输液泵、asi-100自动进样器、uvd340u二极管阵列检测器、c18柱（5 mm, 8.0 250 mm）；hplc使用溶剂为色谱纯有机溶剂；柱层析硅胶（200300目）和薄层层析硅胶板均为青岛海洋化工厂生产；凝胶sephadex lh-20为amersham pharmacia biotech ab 生产；活性测试所需的试剂如二苯代苦味酰自由基（dpph）、2, 6-二叔丁基甲苯（butylated hydroxytoluene , bht）等购自sigma公司。2.3 提取与分离采用统一、标准的提取分离程序开展化学成分的提取、分离工作。主要流程如下：常温阴干的海藻样品用95乙醇室温浸泡提取3次，然后再用甲醇-氯仿（1:1）混合溶剂浸泡提取3次，每次3天，将提取液合并后低温减压浓缩得浸膏。将浸膏悬浮于蒸馏水中，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相。各相进一步经正、反相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱、制备薄层色谱以及半制备hplc分离纯化得到单体化合物。2.4 活性测试2.4.1抗氧化活性测试采用我们课题组建立的改进文献的方法测定13。于2 ml样品中加入2 ml dpph（甲醇溶液，0.16 mmol/l），混合均匀后室温暗处放置30 min，于517nm处测定吸光度asample；2 ml样品中加入2 ml甲醇溶液于517 nm处测定吸光度asample blank；2 ml dpph中加入2 ml溶剂于517nm处测定吸光度acontrol；2 ml甲醇中加入2 ml 溶剂于517 nm处测定吸光度ablank。 清除率 100 (asample asample blank) 100acontrol ablank) 每个样品平行测定三次，计算平均值，阳性对照为bht。 计算各浓度下的抑制率后，用 sigma plot 8.0 软件计算 ic50，换算为摩尔浓度。2.4.2拒食杀虫活性测试取灰翅夜蛾一日龄幼虫10 只，以含有一定浓度的单体化合物的饵料进行喂食，以不含单体化合物的饵料的为空白对照，在控制条件下实验室培育，6天后计数存活的幼虫的数量和重量，并计算存活率和生长率，以此来初步评价测试单体化合物的拒食杀虫活性4。3、结果与讨论3.1 海藻卤代成分研究方法的建立卤素是药物中一类重要的药效官能团，但卤代天然产物在自然界中分布较窄。除海洋生物中的次生代谢产物外，卤代化合物在其它资源中极为少见。这类化合物在常规的薄层层析板上难以形成明显的斑点、对通用显色剂不显色或难显色，因而给识别、检测、分离工作带来很大困难；另外，由于许多卤代化合物的分子中含卤、含氧取代度高、质子少，因而在1h-nmr、1h-1h cosy、hsqc、hmbc等图谱中提供的信息较少，给这类化合物的结构鉴定造成了很大困难。我们经过反复探索与实践，形成了一套完整、有效的卤代化合物研究体系与研究方法，主要包括：1)结合卤代化合物的同位素鉴别技术，通过对hplc-esims中分子离子区域的卤代同位素离子簇及其强度特征的分析，可以有效地分析、判断卤代化合物的存在与否，可灵敏、快速地从大量的海洋生物资源中发现、锁定含卤代成分的资源分布；2）改进了传统的tlc薄层板和显色剂，解决了卤代化合物在传统tlc板上难分离、对通用显色剂不显色或难显色的问题并获得了理想的效果，不仅斑点清晰、显色明显，而且分离效果好（见图1），为海藻卤代化合物的灵敏检测与快速分离提供了技术上的保障； 图1、海藻卤代成分的tlc分离与显色效果（以分类获得的卤代新化合物1、2为例）3）系统总结了卤代化合物的波谱学特征特别是卤素取代基效应、取代规律等，形成了一套规范、实用的快速鉴定卤代化合物分子结构的技术体系并成功地应用到质子少、取代度高的海藻卤代化合物结构测定工作中（部分化合物的结构如图2-5中所示）。3.2 海藻卤代成分研究应用上述研究方法，我们从采集的若干海藻样品中发现了一系列可能含卤代化合物的海洋生物资源，综合各方面的因素考虑，选择了凹顶藻、蜈蚣藻、多管藻和鸭毛藻等5种海藻开展了化学成分研究，从中分离鉴定了100余种单体化学成分，其中22种为首次报道的新结构成分，这些成分大多含有多卤素取代，主要包括以下几种结构类型：3.2.1卤代酚类化合物：图2、3是从上述海藻中鉴定的部分卤代酚类化合物，这些化合物大多含有多羟基、多溴取代单元，有些化合物还含有特殊的取代基团如吡咯烷酮、砜或亚砜等。3.2.2卤代萜类化合物：图4是从上述海藻中鉴定的部分卤代萜类化合物，这些化合物的主要结构特点是分子中大都含有1-氯-2-溴-甲基环己烷结构单元（见图4中的化合物5-11），这种取代类型的倍半萜类化合物在自然界中也是比较少见的。3.2.3卤代c15-acetogenin类和卤代聚醚类化合物：图5是从上述海藻中鉴定的部分卤代c15-acetogenin类和卤代聚醚类化合物，这些化合物的主要结构特点是分子中含有烯炔、丙二烯、环醚或过氧基等比较特殊的结构单元。由于篇幅所限，本文略去有关提取分离、波谱鉴定等相关的内容。3.3 海藻卤代成分的生物活性研究根据我们的研究进展和实验结果，本文摘要报道海藻卤代化合物的自由基清除活性和杀虫、拒食活性的相关结果。3.3.1 海藻卤代成分的dpph自由基清除活性自由基是生物体中生化反应的普遍中间介质。自由基是带有未成对电子的原子、原子团或分子，具有很高的抢夺电子的反应活性，包括超氧化物、氢过氧化物自由基、单线态氧、羟基自由基和过氧化氢。这些活性氧是在生物体正常代谢中形成的，并进一步影响着各种生理活动5。当人体内自由基产生过多或清除过慢，就会引发生物膜损伤、蛋白质变性、酶失活及dna 复制出现错误等6，这些势必导致一系列疾病，如血管粥样硬化、高血压、糖尿病、癌症、帕金森病、老年痴呆症、老化等多种疾病7。这时抗氧化剂就起到非常重要的作用。由于化学合成的抗氧化剂大多具有毒性,故筛选天然抗氧化剂成为当前国内外研究的热点。溴酚类天然产物多属于多酚类物质，具有抗氧化作用。具有显著生物活性的海藻卤代化合物。对分离得到的部分化合物进行了dpph自由基清除活性筛选（表1），发现若干化合物具有显著的dpph自由基清除活性 (表 4-1)，其中活性最强的化合物（p3）其 ic50 值为6.1m，活性强度是阳性对照bht (83.8 m) 的十三倍。进一步的构效关系研究仍在进行中。表 1 部分化合物的dpph 自由基的清除活性acomp.ic50 sd (m)comp.ic50 sd (m)comp.ic50 sd (m)p1*7.9 0.02p1343.5 0.2p2574.6 0.22p2*6.8 0.01p1435.8 0.15p2669.3 0.25p3*6.1 0.02p1525.1 0.13p2716.1 0.16p4*8.1 0.01p1630.2 0.14p2880.3 0.30p5*21.9 0.1p1730.6 0.11p29100.2 0.41p6*9.6 0.04p1850.3 0.21p30140.8 0.17p7*16.1 0.06p1960.2 0.31p3199.3 0.12p815.1 0.02p2051.2 0.27p32146.8 0.20p918.2 0.07p2147.6 0.19p33200p108.3 0.04p2250.6 0.21p34200p1115.3 0.03p2358.9 0.20p35200p1219.6 0.09p2432.0 0.19bht83.8 0.09a each value is presented as the means sd (n = 3)。3.3.2 海藻卤代成分的杀虫拒食活性拒食杀虫剂是一种间接杀虫剂，是指能使昆虫接触后丧失饲食能力，直至饿死，而非直接将其毒杀的化合物。近年来，由于人们对环境质量的要求越来越高，而且一些常用杀虫剂因残留问题而出现副作用以及不断产生的昆虫抗药性等，环境友好的杀虫剂越来越受到人们的重视，其中植物源昆虫拒食杀虫剂具有高效、低毒和易降解等优点，显示出良好的生态效益、经济效益和社会效益，展现出广阔的发展前景。灰翅夜蛾(spodoptera littoralis)是一种破坏力极大的植物害虫，对44科112种植物具有严重侵害作用，而且具有繁殖力强、生长周期短等特点。我们通过控制条件下实验室培育的该昆虫评价了部分化合物的拒食杀虫活性。实验结果表明（表2），卤代倍半萜类化合物lo5具有较强的杀虫活性（存活率只有20%）和明显的抑制灰翅夜蛾幼虫的生长（生长率仅为对照组的14.3%）。与之相比，化合物lm2虽然对昆虫的杀灭活性不是太强，但具有明显的生长抑制活性。进一步的结果评价与构效关系研究仍在进行中。表2 拒食杀虫活性筛选结果化合物存活率生长率化合物存活率生长率lm1100.049.0ls2100.0204.3lm270.07.0ls5100.0129.0lm337.574.9lm10 (ld3)80.089.6lm4100.073.8lm1250.055.5lm7 90.096.3lm2650.048.3lm875.065.3lm14 (ld6)87.5101.5lo1/lo280.093.8lm15 (ld7)20.089.6lo370.0212.7lm1650.040.6lo4 100.0107.7ld560.0140.7lo520.014.3ld1137.573.7lo6 (lc10)100.0113.6ld1287.534.6lc487.589.6ld1350.045.4lq750.0104.3ld14/ld15100.0160.0lt6100.056.0lo790.096.3lt787.592.9ls980.051.2lt950.058.9ls1080.0360.6lt1162.5152.4ls1150.044.6lt1387.5169.6lm21 (ld17)30.040.2ls180.0127.5ls1370.030.4参考文献：1. duan x j, zhang w w, li x m, wang b g, evaluation of antioxidant property of extracts and fractions obtained from a red alga, polysiphonia urceolate, food chem, 2006, 95(1), 37-43.2. li k, li x m, ji n y, gloer j b, wang b g, urceolatin, a structurally unique bromophenol from polysiphonia urceolata j, org lett, 2008, 10(7), 14291432.3. li k, li x m, ji n y, wang b g, bromophenols from the marine red alga polysiphonia urceolata (rhodomelaceae) with dpph rad