透明质酸交联微球的制备及性质研究.docx

透明质酸交联微球的制备及性质研究新，王韵冰，屠红燕，黄良爱，廖先智徐( 绍兴文理学院 化学化工学院，浙江 绍兴312000)摘要: 以己二酸二酰肼( adh) 为交联剂，通过超声乳化的方式对天然透明质酸( ha) 进行交联修饰，得到粒径均匀的交联微球。通过不断调节交联比、水油比，确定 ha 与 adh 的最佳交联比为 1: 1，水油比为 1: 4，乳化剂的量为油相的 5% ，所得微球的平均粒径 为 5 8m，且生物相容性良好。关键词: 己二酸二酰肼; 透明质酸; 交联微球; 生物相容性中图分类号:文献标识码: a文章编号: 1008 021x( 2013) 08 0031 04the preparation and study of crosslinked hyaluronic acid microspherexu xin，wang yun bing，tu hong yan，huang liang ai，liao xian zhi( college of chemistry and chemical engineering，joural of shaoxing university，shaoxing312000，china)abstract: by using hexanedioic( adh) as a crosslinker，the crosslinked microspheres of hyaluronic acid( ha) with uniform particle size were prepared by ultrasonic emulsifying method by investigation of preparation conditions，the optimum ratios between ha and adh，water and oil phase were 1: 1 and 1: 4; the amount of emulsifier was set as 5% of oil phase volume under the optimum condition，the averagepaadipic dihydrazide rticle size of prepared biocompatible microsphere was 5 8 mkey words: adipic dihydrazide; hyaluronic acid; crosslinked microsphere; biocompatibility透 明 质 酸 ( hyaluronic acid，ha) ，又 称 玻 尿 酸，作为一种大分子酸性粘多糖在人体结缔组织、眼球 玻璃体、关 节 滑 膜 液和细胞外基质中广泛存 在1， 其分子结构如图 1 所示。它可稳定细胞间纤维和膜 蛋白结构，具有良好的粘弹性、润滑性、良好的生物 相容性以及对药物吸收的促进作用。临床上被广泛 应用于眼科手术、骨科手术、骨性关节炎( oa) 和类 风湿性关节炎( a) 、预防术后粘连以及作为眼科和 皮肤外用药物载体2。但由于 ha 存在稳定性差， 对强酸、强碱、热及透明质酸酶敏感，在体内易降解、 存留时间短等缺点，从而限制其作为药物载体的应 用。研 究 者 通 过 对 ha 进 行 交 联、酯 化、接 枝 等 修 饰，开发出能明显改善天然透明质酸稳定性差等缺 点的衍生物。本文以 adh 为交联剂，通过调节交联比、水油比以及乳化剂的用量，制备粒径均匀的 ha adh交联微球，并 对 制备的微球进行结构和性能表征。然后通过对微球的生物相容性测定，为该微球材料 进一步应用于药物载体作基础研究。图 1 透明质酸化学结构1 实验部分1 1 主要仪器与试剂shz 88a 型 水 浴 恒 温 振 荡 器，上 海 浦 东 物 理 化学仪器厂; 85 2 型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪收稿日期: 2013 05 16作者简介: 徐新( 1991) ，男，湖北洪湖人，从事生物药物载体研究。山 东 化 工shandong chemical industy322013 年第 42 卷器有限公司; sk3200hp 可调台式超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司; dzf 6050 真空干燥箱， 上海精宏实验设备有限公司; nexus 型傅里叶变换 红外光谱 仪，美国尼高力仪器公司; jsm 6360ly 系列 sem 扫描电子显微镜，日 本 电 子 公 司; hj 5 多功能搅拌器，常州国华电器有限公司。透明质酸( ha) ，曲阜市广龙生物制品厂; 己二 酸二酰肼( adh) ，上海晶纯试剂有限公司; 1 乙基 ( 3 二甲基氨基丙基) 碳二亚酰胺盐酸盐 ( edchcl) ，上海晶纯试剂有 限 公 司; 液 体 石 蜡 ( a) ， 上海展云化工有限公司; 司班 80 ( span 80，cp) ，上 海展云有限公司; 异丙醇( a) ，上海展云化工有限 公司; 石油醚 。其余试剂均为分析纯试剂。( 对照) 研磨成粉，采用 kbr 压片法制样，分别用于fti 分 析。分 析 条 件: 扫 描 范 围 4000 400cm 1 ， 分辨率 2 cm 1 ，扫描 16 次。对所得红外 谱 图 进 行比较分析。微球在 sem 下的形态表征1 3 2将 ha 空白微球及 ha adh 交联微球的干燥粉末均匀分散于贴有导电板的电镜样品台上，喷金3 次，通过扫描电子显微镜观察其整体局部微球的 表面形态。1 4ha adh 交联微球的生物相容性1 4 1 皮肤过敏试验将受试小鼠随机分组，分别为受试组和空白对 照组( 赋形剂) ，在实验前用脱毛剂将两组小鼠背部 脱毛。将受试的一定量 ha 交联微球用凡士林稀释 后涂在实验组小鼠左侧背部脱毛区，并采用适当方法固定 6h。第 7 天和第 14d 以同样的方法重复一 次。空白 对 照 组 方 法 同 上。 在末次给药致敏后 14d，将与上诉 等 量受试物涂于小鼠背部右侧脱毛 区，6h 后去 掉 受 试 物，即 刻 观 察，然 后 于 24h、48h、72h 再次观察皮肤过敏状况。按表 1 皮肤刺激反应评分标准，对所观察的皮 肤刺激情况进行评分，并按表 2 致敏率分类的分类 判断其致敏率。致敏率的计算: 出现皮肤红斑与水 肿( 不 论 程 度 轻 重 ) 的动物例数除以受试动物总 1 21 2 1实验方法透明质酸溶液的配制将 0 5g 透明质酸溶于 99 5ml 放 冷 的 煮 沸 水中，充分搅拌至完全溶解，于 4 保存，静置一天，备 用。1 2 2 ha adh 交联微球的制备将 40ml 液体石蜡与 5% 的乳化剂司班 80 均匀 混合作为油相。油相在 500r / min 搅拌，中等强度的 超声条件下，取 10ml ha 溶液逐滴加入油相，调节 混合液 ph 值 4 0 5 0，加入适量 edchcl，并按 ha 与 adh 质量比 1: 1 称取一定量 adh 粉末，迅速 加入乳化体系中，适当增大搅拌速度，保持体系 ph 值 4 0 5 0，常温反应 6h。反应结束后，静置半小时，向体系中加入等体积 的异丙醇，搅拌，静置，倒出上清液，继续加异丙醇， 重复上述操作两次，再加入一定量石油醚洗涤，倒出上清液，超声 20min，将固体转移至表面皿，加 少 量 丙酮，在通风橱中静置至干燥。1 2 3 ha 空白微球的制备40ml 液体石蜡与 5% 的乳化剂 span 80 混合 均匀为油相。油相在 500r / min 搅拌，中等强度的超 声条件下，10ml ha 溶液逐滴加入油相，常温反应6h。反应结束后操作与制备 ha adh 微球一样， 得干燥空白微球。1 3 ha adh 微球的性能表征1 3 1 ha adh 微球的红外光谱( fti) 分析 将制得的 ha adh 交联微球及 ha 空白微球3数。表 1皮肤刺激反应评分标准皮肤反应分值红斑行成:无红斑0轻度红斑1中度红斑2重度红斑3水肿型红斑4水肿形成:无水肿0轻度水肿1中度水肿2重度水肿3总积分7第 8 期徐 新，等: 透明质酸交联微球的制备及性质研究331 4 2 静脉注射的血管刺激试验原料与器皿的灭菌: 将制得的微球粉末放于已 灭菌的培养皿中，在无菌操作台的紫外灯照射下灭 菌 40min，备用。静脉注射用的器材等在紫外灯照 射下灭菌 30 40min。浸提液的制备( 在无菌操作台进行) : 取上述已 灭菌的粉末，加入无菌生理盐水中在 37 条件下浸 提 72h，取上清液即为生理盐水浸提液，微孔滤膜过 滤备用4。左耳耳缘静脉给予，观察比较。观察家兔在耳缘静脉注射后血管的刺激反应情况，肉眼观察是否出现 明显的肿胀、充 血 和坏死等刺激症 状5，比 较 两 组 现象的区别。22 1结果与讨论微球的红外图谱分析透明质酸及其交联微球的红外图谱，图 2 为透明质酸微球红外图谱，图 3 为 ha adh 交联微球的红外图谱。由透明质酸 微 球 的 红 外 谱 图 可 见: 在 3361 99 cm 1 处为 ha 的 oh 伸缩振动峰; 在 696 60，140832，1609 25cm 1 处表现出羧酸盐的特征吸收峰，说 明有游离羧基结构存在; 在 1609，1408 cm 1 处出现 c = o 和 c n 伸缩振动峰，说明未交联的透明质酸 中存在乙酰氨基的结构。表 2致敏率分类致敏率 / 反应强度0 10弱致敏性20 30轻度致敏性40 60中度致敏性交 联 图 谱 中 在 3312 86 cm 1 和ha adh70 80高度致敏性3290 05 cm 1 处 出 现 明 显 的 n h 伸 缩 振 动 吸 收峰; 1609 25 cm 1 和 1408 32 cm 1 处羧酸盐特征吸 收峰消失，在 1628 86 cm 1 和 1601 09 cm 1 处表现 出强吸收峰，说明 ha 和 adh 反应生成了新的酰胺 键，标志着交联反应的发生。极度致敏性90 100静脉注射: 在实验前家兔预先饲养，并观察家兔耳缘 静 脉。实 验 分 成 两 组，一组为受试药品组，以1ml / kg 剂量在家兔右耳耳缘静脉给予药物; 另一组 为生理盐水组，与实验组等剂量的生理盐水在家兔图 2 透明质酸微球红外图谱山 东 化 工shandong chemical industy342013 年第 42 卷图 3 ha adh 交联微球的红外图谱2 2微球的 sem 形态表征由图 4ha 空白微球的 sem 形态表征与图 5ha adh 交联微球的 sem 形态表征可知，ha 空白微球多塌陷、黏粘，且微球粒径不均匀，而通过 adh 与 ha 交联后形成的微球粒径饱满且均匀，平 均 粒 径 在 5 8m。图 5 ha adh 交联微球的 sem 形态表征2 3 2 静脉注射的血管刺激试验 实验家兔试验组右耳和对照组左耳经注射后两组静脉均在注射位置附近出现轻微的血管扩张性炎症反应，1d 后消失，说明并非透明质酸对 血 管 刺 激 造成，可能是实验中注射不佳造成。后未观察到明显的肿胀、充血和坏死等症状，表明 ha adh 交联微球对血管无刺激作用。图 4 ha 空白微球的 sem 形态表征ha adh 交联微球的生物相容性2 32 3 1 皮肤过敏试验实验中，供试组和空白对照组小鼠皮肤接触区 域未见水肿、红斑等现象，即皮肤致敏反应总得分为0，表示没有小鼠发生过敏现象，故得到致敏率为 0， 表明 ha adh 交 联 微 球对小鼠皮肤没有致敏作 用。3结论本课题以 adh 为交联剂对 ha 进行交联，制备ha adh 交联微球，通过与 ha 空白微球 fti 及sem 对照，确定质量比 ha: adh = 1: 1、水油体积比1: 4、乳化剂与液体石蜡体积比 1: 20 的交联条件以 乳化交联的方式制备了较好的 ha adh 微球，并通过对其进行生物相容性分析，发现该微球对小鼠( 下转第 38 页)山 东 化 工shandong chemical industy382013 年第 42 卷由于四个样品中，样品 4 的孔隙率较高，孔径尺寸合理，强度也较大。因此，对样品 4 再进一步进行 xd 分析。图 6 是样品 4 ( 壳聚糖加入量为 2 0g) 的 xd 谱 图。 图 中 在 31 87 处 出 现 最 强 峰，与jcpds no 74 0566 一 致，对 应 hap 的 最 强 峰，1 stevens molly m biomaterials for bone tissue engineeringj mater today，2008，11( 5) : 18 202 bran gregor m，stern straeter j，hormann karl，et al apoptosis in bone for tissue engineeringj arch med es，2008，39( 5) : 468 4703 cancedda ，giannoni p，mastrogiacomo m a tissue en- gineering approach to bone repair in large animal models and inclinical practicej biomaterials，2007，28 ( 29 ) :4241 42434 somma p，pettersson s，ness c，et al engineering three dimensional cartilage and bone like tissues using human dermal fibroblasts and macroporous gelatine microcarriersj plast econstr aesthet surg，2010，63 ( 6 ) : 1037 10405 lenaldo b ，giberto g biocompatibility of anionic colla- gen matrix as scaffold for bone healingj biomaterials，2002，23( 2) : 449 4506 guo x y，xiao p，liu j，et al fabrication of nanostruc- tured hydroxyapatite via hydrothermal synthesis and spark plasma sinteringj am ceram soc，2005，88 ( 4 ) : 1026 1029( 211) 晶 面; 次 强 峰 在 11 79，与 jcpds no72 1240 一 致，对 应cah ( po4 ) ( h2 o ) 2的 最 强 峰，( 020) 晶 面。 因 此，样 品 4 主 要 含 有 hap 和 cah( po4 ) ( h2 o) 2 两种磷酸盐。说明在该实验条件下 制备的材料中无机相主要是 hap，同时含有少部分 磷酸氢钙。由于这两种磷酸盐都具有良好的生物活 性，因此，可作为骨修复或替代材料。3小结实验结果表明，采用冷冻干燥法制备的多孔羟基磷灰石 / 壳聚糖复合材料的主 晶 相 为 hap，同 时含有少部 分 的 cah ( po4 ) ( h2 o) 2 。制 备 时 加 入 的 壳聚糖与无机盐的相对含量对材料的成型性、孔道 结构及强度有重要影响。当壳聚糖与氯化钙质量比 大于 1 : 0 9 时，可以得到具有一定强度、成型性较 好、孔道分布较均匀的三维贯通的多孔材料，