【doc】 蜂毒肽C末端片段的反序肽的抗菌活性和溶血活性.doc

蜂毒肽c末端片段的反序肽的抗菌活性和溶血活性v0li262005年12月高等学校化学chemicaljournalofchineseuniversmesno.1222332236蜂毒肽c末端片段的反序肽的抗菌活性和溶血活性陈素霞,孙学军,李顺子,阎虎生(南开大学高分子化学研究所,吸附与分离功能高分子材料国家重点实验室,天津300071)摘要设计并合成了具有不同碱性氨基酸残基数和不同疏水性片段链长的基于mel(1226)的系列反序肽类似物.结果表明,反序肽的正电荷和疏水性对于抑菌活性都很重要,n端至少保留3个碱性氨基酸(正电荷>4)和c端的疏水性片段的链长至少为8个氨基酸残基的类似物具有较高的抑菌活性,具有较大的抑菌活性的最小反序肽类似物为具有11个氨基酸残基的retromel(1323).这些反序肽的溶血活性都很小.关键词蜂毒肽;反序;抑菌活性;溶血活性中图分类号q516文献标识码a文章编号0251-0790(2005)12-2233-04抗生素的广泛使用以及抗菌素的滥用导致病菌对抗菌素产生耐药性,因此,寻找和开发新型抗菌素是一个热点课题.阳离子抗菌肽存在于多种生物体中,在宿主天然免疫中具有抗革兰氏阳性菌和阴性菌,真菌和原虫等广谱作用j.这类抗菌多肽含有较多的碱性氨基酸(在生理条件下带有正电荷)和较多的疏水性氨基酸.由于独特的抗菌机理,细菌不易对其产生耐药性,很有希望作为有临床使用价值的抗菌素-4.目前已有近10个阳离子抗菌肽类似物进入临床或临床前的试验阶段.阳离子抗菌肽的抗菌机理为肽的阳离子部分与细菌细胞膜(磷脂膜)的阴离子发生静电作用,由疏水氨基酸形成的疏水部位与细菌细胞膜的脂链产生疏水作用,从而起到抑菌作用.大部分阳离子抗菌肽除具有抗菌活性外,还具有溶血副作用.目前该领域的研究热点或待解决的问题主要有:抗菌机理的研究;高抗菌活性,低溶血活性的抗菌肽的设计合成,发现的阳离子抗菌肽或其合成类似物的抗菌活性比传统抗菌素的抗菌活性低,因此用量较大;合成链长尽量短的抗菌肽,可以减小肽的抗原性和降低肽的合成成本.在众多的阳离子抗菌肽中,氨基酸残基数小于40个,可形成两亲性-螺旋结构的线性短肽引起人们的重视,如天蚕素(cecropin),马加宁(magainin),蜂毒肽(melittin)等.蜂毒肽是意大利蜂(apismellifera)毒液的主要活性成分,由26个氨基酸组成,一级结构为gigavlkvltyglpaliswikrkrqq-nh,.蜂毒肽能够形成两亲性的.螺旋结构,5个碱性氨基酸中的4个集中在肽链的c端(krkr),是典型的阳离子抗菌肽j.蜂毒肽对革兰氏阳性菌和阴性菌都有很强的抑制作用,还有很强的溶血活性,限制了其临床应用.蜂毒肽对钙调素具有很高的亲和作用,根据我们提出的钙调素可结合多肽结合部位的模型,预测并通过实验证明,蜂毒肽与钙调素的结合部位为1226片段mel(1226).,并发现此片段仍保留一定的抗菌活性,但溶血活性消失j.本文设计合成了蜂毒肽反序肽的片段,研究其链长,碱性氨基酸的数量与抗菌活性和溶血活性的关系.1实验部分1.1试剂和仪器rinkamidembha树脂为南开大学和成公司产品,取代值为0.74mmo|n/g;芴甲氧羰基(fmoc)保护的型氨基酸购自美国advancedchemtech公司,其中set侧保护基团为-bu,lys的侧保护基团收稿日期:200410-25.基金项目:国家”九五”攻关项目(批准号:9690105154)和天津市重点科学基金(批准号:033801811)资助.联系人简介:阎虎生(1959年出生),男,博士,教授,博士生导师,从事固相肽合成和功能高分子材料的研究email:2234高等学校化学为boc,arg的侧保护基团为pbf;蜂毒(beevenom),北京农业科学院四海研究所;苯并三氮唑-,.四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu),1-羟基苯并三氮唑(hobt),二异丙基乙基胺(diea)和苯甲硫醚均为acros公司产品1,2.二巯基乙醇(edt),merck公司;金黄色葡萄球菌(s.auveus),枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和大肠杆菌(e.coli),中国药品生物制品检定所提供;人血红细胞由天津市血液中心提供,于4下保存.其它试剂均为分析纯或生化试剂.美国waters公司的600e高效液相色谱仪,制备型层析柱(-bondspak,c19mm300mm);分析型层析柱(.bondspakc3.9mm300mm),abi公司api3000液相色谱-质谱连用仪,uv-762紫外.可见分光光度计.jasco-j-715型圆二色谱仪.1.2实验方法1.2.1蜂毒肽的纯化参考文献10,用凝胶色谱法对粗蜂毒肽进行分离纯化.1.2.2蜂毒肽片段类似物的合成和纯化采用fmoc保护的氨基酸固相合成法,以rinkamidembha树脂作载体,hbtu/hobt作缩合剂,肽从树脂上的切割试剂为三氟乙酸/苯酚/水/苯甲硫醚/1,2-二巯基乙醇(体积比8:0.5:0.5:0.5:0.25),于室温反应46h,旋转蒸发除去大部分三氟乙酸后,在0oc滴加乙醚得絮状沉淀,离心后得粗肽,用sephadexg-15柱初步分离,柱用5%醋酸平衡,上样后在流速为1ml/min下用5%醋酸洗脱,280nm检测,收集第一个峰,冷冻干燥.用半制备型高效液相色谱仪进行纯化,以28%30%的乙腈水溶液(水和乙腈中各含0.1%三氟乙酸)恒浓度洗脱,流速5ml/min,收集丰度最大峰.多肽的纯度通过分析型高效液相色谱(c)和氨基酸分析确定.1.2.3抗菌活性实验用灭菌生理盐水制成质量浓度为1mg/ml的多肽样品,用菌种分别接种于营养肉汤中,于37培养1824h,用前作1:10稀释至10.cfu/ml,用试管倍半稀释法将多肽溶液稀释到不同的浓度,在含1ml系列浓度多肽液的试管中各加0.2ml菌液,摇匀,于37过夜培养,观察抑制细菌生长的最低样品浓度(mic).1.2.4溶血活性实验将人血红细胞用pbs缓冲液(35mmol/l磷酸盐缓冲液,含150mmol/lnac1,ph=7.4)洗4次后悬浮在pbs缓冲液中,得血红细胞悬浮液(体积分数2.5%).将多肽溶解在pbs缓冲液中,配成储备液,取不同体积的多肽储备液于0.5ml2.5%血红细胞悬浮液中,补加pbs缓冲液至终体积1ml,摇匀,于37保温60min后,以4000r/min离心10min,取上清夜在414nm下比色,以血红细胞悬浮在pbs缓冲液中为空白,以血红细胞悬浮在tritonx-100中为100%溶血.1.2.5圆二色谱测定用1am石英比色皿于室温下测定多肽在tris-hc1(ph=7.5)缓冲溶液和30mmol/lsds溶液中的远紫外圆二色谱(cd),扫描范围为200250nm,每个样品平均扫描4次,扫描速率为50nm/min,多肽浓度为1020txmol/l.圆二色性用平均残基椭圆值0表示,螺旋含量用公式=(0_00)/0计算,其中0是实验观测到的222nm的椭圆值;00:和0分别是螺旋度为0和100%时在222nm处的椭圆值,分别为一2000和一28400_l.2结果与讨论2.1多肽的设计合成与分离纯化我们发现蜂毒肽结合钙调素的结合部位mel(1226)(glpaliswikrkrqq.nh)仍保留一定的抗菌活性,但溶血活性大大降低.由此提出了mel(1226)与细菌细胞膜作用的模型,即n端疏水性片段(19残基)形成.螺旋结构,通过疏水作用与细菌细胞膜磷脂双层的疏水中心结合,碱性氨基酸簇(lys10_arg”-lys12_arg”)通过静电相互作用与磷脂双层的带负电的头基部分结合_1.而c末端的2个亲水性的gln残基未被直接包含在其结合中,当去掉这2个gln残基后(序列为glpaliswikrkr.nh),其抗菌活性不仅没有降低,反而增加了.在生理条件下此多肽含有5个正电荷:其中4个位于c末端的碱性氨基酸残基,1个为n末端氨基.从我们提出的作用模型看,n末端氨基的正电荷对肽与细菌细胞膜的作用没有正的贡献.如果将碱性氨基酸簇放在n端,即上述多肽的反序肽,则5个正电荷集中在一起,n末端氨基也可能对抗菌有贡献.merrifield等报道,蜂毒肽的反序肽保持抗菌活性,但溶血活性大大降低.本文设计合成反序的mel(1224)及类似物(见表1).纯化后的蜂毒肽陈素霞等:蜂毒肽c末端片段的反序肽的抗菌活性和溶血活性及其类似物在分析型高效液相色谱上显示为单峰,纯度>95%,经氨基酸分析与预期值相符.多肽在rp-hplc上的保留时间(t),平均残基疏水性(h)和一螺旋结构的平均疏水矩()根据eisen-berg的方法计算.对于两亲性的多肽,houghten等发现,多肽与疏水性的c.固定相结合时采取二级结构,从而影响了保留时间.表1的数据表明,日和t具有良好的线性相关性.table1sequences,a-helicity(in30mmovlsds),calculatedhydrophobicifies,hydrophobicmomentsandretentiontimesonrp-hplcofmelittinanditsretroanalogs2.2多肽的抗菌活性和溶血活性表2为蜂毒肽及其反序类似物对金黄色葡萄球菌(s.auve1.ls),枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和大肠杆菌(e.coli)的最低抑菌浓度(mic).可以看出,与正序类似物的情况类似,反序类似物去掉2个亲水性的gln残基后其抗菌活性增加比较表2中retromel(1226)和retromel(1224)的抗菌活性.将4个碱性氨基酸减少到3个后retromel(1224)到retromel(1223),其抗菌活性略有降低(如对金黄色葡萄球菌的mic增加1倍).进一步将碱性氨基酸减少到2个retromel(1222)后,其抗菌活性有较显着的降低(对金黄色葡萄球菌的mic由2.60pg/ml增加到25.4g/ml).去掉c末端的gly残基后,将4个碱性氨基酸减少到3个后retromel(1324)到retromel(1323)也有类似的结果,即其抗菌活性略有降低(对金黄色葡萄球菌的mic增加1倍).说明当反序肽含3个碱性氨基酸(4个正电荷)时,仍能保持较高的抗菌活性.再减少碱性氨基酸残基数,其抗菌活性则有较显着的降低table2antimicrobialandhemolyticactivitiesofmelittinanditsretroanalogsmic/(gml一)againhem.lvsmic/(ixgml一)againshem.lysise,e.hc/(/.gml-iau,ve/ubtttcott)脚5c0”/(/.gml-1auveusubttt)5melittin0.720.1811.45retromel(12_22)25.4012.7049.70>2500retromel(12_26)21.20128.00128>2500retromel(13_24)2.601.302.82>2500retromel(12_24)2.601.305.42>2500retromel(14_24)11.505.2021.00>2500retromel(12_23)5.902.886.46>2500retromel(13_23)5.202.6011.40>2500在确定了反序肽的碱性对抗菌活性的影响后,进一步研究反序肽的疏水性片段的链长对其抗菌活性的影响.将retromel(1224)的c末端的gly去掉得retromel(1324),其对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抗菌活性无变化,而对大肠杆菌的抗菌活性有所增加.去掉c末端的leu后,其抗菌活性显着降低.说明保持较高抗菌活性的反序肽的疏水性片段的最少残基数为8.此外,retromel(1324),retromel(1324)和retromel(1424)具有相同的正电荷(+5),其抗菌活性的大小与计算的多肽平均残基疏水性(日)大小相关,即当多肽的正电荷相同时,疏水性增大,则其抗菌活性增强.另外考察了这几个肽的和抗菌活性的关系,发现二者之间没有明显的相关性,与subbalakshmi等的结果不同.subbalakshmi等对蜂毒肽的c.端15肽进行很小的顺序变化,随着的增大,抗菌活性大大增加.多肽的溶血活性也列于表2.当蜂毒肽的浓度为10g/ml时,可达到100%溶血;50%溶血浓度(hc.)是5g/ml,而本文所设计的反序肽在检测浓度范围(2500g/ml)内未达到50%溶血.2.3多肽的二级结构多肽的圆二色谱(cd)表明,蜂毒肽及其类似物在缓冲溶液中没有确定的二级结构形式存在.在较高浓度的sds溶液中,蜂毒肽含有高比例的一螺旋.sds可以形成带负电的囊泡,模拟细菌细胞膜中带负电的疏水性磷脂层.sds囊泡诱导多肽分子形成-螺旋结构可能是这种两亲性的结构有利于多2236高等学校化学vo1.26肽在水膜介质中稳定存在的原因.多肽在222nm处的ot一螺旋度列于表1.结果表明,retromel(1226)比其它反序肽的ot.螺旋度高得多.但几乎所有的其它反序肽的抗菌活性都比retromel(1226)的高,ot.螺旋含量与抑菌活性并没有明显的相关性.我们提出的mel(1226)及其类似物与细菌细胞膜的结合模型表明,肽的疏水性片段采取ot.螺旋结构.这似乎与本文的结果相矛盾.这可能是由于细菌的细胞膜有很强的诱导抗菌肽形成ot.螺旋结构能力引,其诱导能力比sds囊泡的诱导能力强得多,因此用sds囊泡模拟细菌的细胞膜是不合适的.参考文献zasloffm.proc.acad.sci.usaj,1987,84:5449-5453deboraha.s.,malindaa.h.,craiga.t.eta1.antimierob.agentschemother.j,1997,41:17381742blondelles.e.,houghtenr.a.biochemistryj,1991,30:4671_4678blondelles.e.,houghtenr.a.biochemistryj,1992,31:12688-12694zasloffm.naturej,2002,415:389395yanh.s.,heb.l.chinesej.bioehem.biophys.j,1992,24:295-300yanh.s.,nia.g.,liul.p.eta1.sci.china,ser.bj,1996,39:l13122liul.p.,yahh.s.,nia.g.eta1.int.j.peptideproteinres.j,1994,43:107一l12liul.p.,xiez.d.,yanh.s.eta1.peptides:biologyandchemistrym,leiden:escom,1995:2021vogelh.,jahnigf.biophys.j.j,1986,5o:573582cheny.h.,yangj.t.,chauk.h.biochemistryj,1974,30:3350-3359yanh.s.,lis.z.,sunx.j.eta1.febslett.j,2003,554:1oo一1o4sunx.j.,chens.x.,iis.z.eta1.peptidesj,2005,26:369375juvvadip.,vunnams.,merrifieldr.b.j.am.chem.soc.j,1996,118:8989-8997eisenborgd.annu.rev.biochem.j,1984,53:595_623houghtenr.a.,degraws.t.j.chromatogr.j,1987,386:223228subbalakshmic.,nagarajr.,sitaramn.febslettj,1999,448:62_66lishunzi(李顺子),sunxuejun(孙学军),yanhusheng(阎虎生)eta1.chem.j.chineseuniversities(高等学校化学)j,2005,26(1):73_77,antibacterialandhemolyticactivitiesofthereverse-sequenceanalogsofamelittinsc-terminalsegmentchensuxia,sunxuejun,lishunzi,yanhu-sheng(instituteofpolymerchemistry,statekeylaboratoryoffunctionpolymermaterialsforadsorptionandseparation,nankaiuniversity,tianjin300071,china)abstractmelittinisanamphipathicot-helicalpeptidewith26aminoacids.ithashighantimicrobialactivityandtoxicitytoeukaryoticcells.c-terminal15-residuefragmentofmelittin(glpaliswikrkrqqnh2),m(12_26),retainedsomeoftheantimicrobialactivitybutlostmostofthehemolyticactivitiy.aseriesofreverses