利用SRAP分子标记分析种质资源 实验方案.doc

利用SRAP分子标记分析种质资源1 SRAP分子标记相关序列扩增多态性（SRAP）是由美国加州大学Li和Quiros于2001年发展的一种基于PCR反应的新型标记。该技术是基于正向和反向引物对模板DNA的PCR扩增，引物具有3个明显不同的序列框(motif)：5端存在的10-11个随机碱基序列，紧跟着CCGG（正向引物）或AATT（反向引物）的碱基序列，最后是位于3端的3个选择性碱基。从技术的可操作性来看，每个引物5端的10个随机碱基序列可以促进任意序列的扩增，即类似于RAPD标记的结果。正向引物的CCGG序列可以优先与具有丰富GC碱基的外显子序列退火结合，而反向引物的AATT序列可优先与具有丰富AT碱基的内含子和启动子序列退火结合，引物3端的3个选择性碱基可以对模板DNA进行选择。SRAP标记自开发以来，已在多种植物的遗传多样性分析、指纹图谱构建和物种亲缘关系分析研究等领域得到广泛应用。该标记具有操作简便、快速，多态性丰富，重复性好，不需预知物种序列信息以及成本较低等优点，具有RAPD简单快捷之优点，同时还具有AFIP的稳定性和多态性，是简单又经济、有效又可靠的分子标记系统。2.1 材料和试剂2.1.1 材料从各种中各随机选取5-15株个体采集叶片用于提取基因组DNA。2.1.2 仪器与试剂研钵、冷冻高速离心机、水浴锅、紫外分光光度计、电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统、PCR仪液氮、离心管（1.5 mL、10mL）、PCR管、烧杯、容量瓶、试剂瓶、量筒氯化钠、EDTA二钠盐、醋酸钠、Tris、CTAB、盐酸、-巯基乙醇、氯仿、异戊醇、异丙醇、冰醋酸、无水乙醇、PCR试剂、琼脂糖（1）2CTAB提取液配制2CTAB提取液配制2CTAB提取液终浓度母液5ml10ml15ml20ml1.4 mM NaCl5M NaCl1.42.84.25.620 mM EDTA0.5M EDTA0.20.40.60.8100 mM Tris-HCl (pH8.0)1M Tris-HCL, pH 8.00.51.01.52.02% (w/v) CTAB10% (w/v) CTAB1.02.03.04.00.2% (v/v) -mercaptoethanol-mercaptoethanol0.010.020.030.04H2OH2O1.893.785.677.56（2）5 M NaCl（3）0.5 M EDTA-Na2（pH 8.0）（4）1M Tris-HCL（pH 8.0）（5）10% (w/v)CTAB（6）0.2% (v/v) -mercaptoethanol（7）氯仿、异戊醇混合液（24:1）（8）3M NaAc（9）TE：10mM Tris-HCl，1mM EDTA, pH7.4（10）50TAE电泳缓冲液（1L）：Tris 242g冰醋酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 100 ml工作液为1TAE（40 mmol/L Tris-HAc, 1 mmol/L EDTA）2.2 基因组DNA的提取(CTAB法)和检测采用改良CTAB法提取基因组DNA，具体步骤如下：（1）取干燥叶片0.1 g左右于研钵中，加液氮研磨成粉末，待液氮挥发完毕，将粉末迅速转移至离心管中；（2）加入65 C预热的3 mL 2CTAB提取液，65 C水浴30 min，期间稍加混匀；（3）加入等体积氯仿、异戊醇混合液（24:1，4 mL），摇匀静止3 min后室温离心10 min（10000 rmin-1）；（4）取上清液转移至新的离心管，用0.8 V冷异丙醇（或2V预冷的无水乙醇）/ 0.1V 3M NaAc沉淀DNA，-20下放置30 min以上；（5）4 C离心15 min（12000 rmin-1）；（6）弃上清，沉淀用70%预冷乙醇洗涤两次，自然风干，加适量TE溶解；（7）加RNase A至终浓度10 g/ml，37 C消化30 min；（8）加等体积氯仿、异戊醇混合液（24:1），翻转充分摇匀，室温离心10 min（12000 rmin-1）；（13）取上清液转移至1.5 mL离心管，加入.8 V冷异丙醇（或2V预冷的无水乙醇）/ 0.1V 3M NaAc沉淀DNA，轻轻翻转摇匀，-20 C冰箱过夜；（14）4 C离心15 min（12000 rmin-1），弃上清，70%预冷乙醇洗涤沉淀两次，无水乙醇洗涤一次，并自然风干；（15）加入100 l TE 溶液，冷冻备用。基因组DNA浓度检测用紫外分光光度计（日本岛津UV-2401PC）测定260 nm/280 nm处的光吸收值，根据A260/A280确定DNA的纯度，根据260nm处的光吸收值估测样品DNA的浓度；用1.0%琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的纯度和浓度来检测其纯度和浓度，根据电泳条带的整齐度、点样孔中荧光的有无估计DNA的纯度，根据条带的亮度估测DNA的浓度。2.3 PCR反应体系及程序用于PCR扩增的DNA模板的浓度稀释至20 ng/l，用于SRAP分析。在0.2ml RCR管内配置20ul反应体系H2O12.4 l 10 PCR Buffer 2.0 l 50 dNTP Mix (10 mM each) 0.4 l （0.2 mM each）PCR Primer 1 (10 M) 1.0 l （0.5 M）PCR Primer 1 (10 M) 1.0 l （0.5 M）DNA Template (10 ng/l) 3.0 l （30 ng）Taq DNA Polymerase（10U/l） 0.2 l （2 U）Final volume20.0 lMg2+浓度为2.0mM，混匀后略为离心，将内容物收集到管底。按照以下程序执行PCR反应。 94C 1 min 5 cycles: 94C 1 min33C 1 min72C 1 min 35 cycles: 94C 1 min55C 1 min72C 1 min 72C 7 min 4C 保温反应结束后取 5 l 在1.1% agarose/EtBr 胶 1 TAE 中电泳，用DL2000作为标准相对分子量对照。2.4 引物筛选试验随机挑选1个DNA样品，参照2.3的原始反应体系进行引物初步筛选。SRAP引物见表1和表2，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，从正向引物和反向引物随机组合中，筛选出适于金银花遗传分析的引物8对，并从中中选取条带适中且清晰的引物组合，进行SRAP-PCR反应体系优化实验。表1 SRAP正向引物及其序列引物代号Primer code序列（5-3）Sequence(5-3)引物代号Primer code序列（5-3）Sequence(5-3)Me1TGAGTCCAAACCGGATAMe6TGAGTCCAAACCGGTAAMe2TGAGTCCAAACCGGAGCMe7TGAGTCCAAACCGGTCCMe3TGAGTCCAAACCGGAATMe8TGAGTCCAAACCGGTGCMe4TGAGTCCAAACCGGACCMe9TGAGTCCAAACCGGTCAMe5TGAGTCCAAACCGGAAGMe10TGAGTCCAAACCGGTAG表2 SRAP反向引物及其序列引物代号Primer code序列（5-3）Sequence（5-3）引物代号Primer code序列（5-3）Sequence（5-3）Em1GACTGCGTACGAATTAATEm12GACTGCGTACGAATTATTEm2GACTGCGTACGAATTTGCEm13GACTGCGTACGAATTACGEm3GACTGCGTACGAATTGACEm14GACTGCGTACGAATTATGEm4GACTGCGTACGAATTTGAEm15GACTGCGTACGAATTCGGEm5GACTGCGTACGAATTAACEm16GACTGCGTACGAATTGATEm6GACTGCGTACGAATTGCAEm17GACTGCGTACGAATTAGCEm7GACTGCGTACGAATTCAAEm18GACTGCGTACGAATTTAGEm8GACTGCGTACGAATTCTGEm19GACTGCGTACGAATTTCGEm9GACTGCGTACGAATTCGAEm20GACTGCGTACGAATTGTCEm10GACTGCGTACGAATTCAGEm21GACTGCGTACGAATTGGTEm11GACTGCGTACGAATTCCAEm22GACTGCGTACGAATTTCC2.5 PCR反应体系的优化为了确定PCR反应中5个因素的最佳水平，采用正交设计L16（45）在 4个水平上进行试验。参与PCR反应的因素水平见表3，L16（45）正交设计方案见表4。表3 SRAP-PCR反应因素水平因素Factors水平（20L体系终浓度）Level（final concentration）1234Taq酶Taq polymerase（U20L-1）0.51.01.52.0Mg2+（mM）0.51.01.52.0模板DNA Template DNA（ng20L-1）204080100dNTPs（mM）0.10.250.51.0引物Primer（uM）0.250.50.751.0表4 SRAP-PCR反应因素水平L16(45)正交设计编号No.Taq酶Taq polymerase （U20L-1）Mg2+（mM）模板DNATemplate DNA （ng20L-1）dNTPs（mM）引物Primer（uM）10.50.5200.10.2520.51400.250.530.51.5800.50.7540.52.01001.01.051.00.5400.51.061.01201.00.7571.01.51000.10.581.02.0800.250.2591.50.5801.00.5101.511000.50.25111.51.5200.251.0121.52.0400.10.75132.00.51000.250.75142.01600.11.0152.01.5401.00.25162.02.0200.50.52.6 SRAP-PCR扩增及产物检测根据筛选的引物对所有样本进行扩增。SRAP标记每条带记录为1个位点，以有带记为“1”，无带记为“0”，形成0/1矩阵。数据统计利用POPGENE version 1.32 和 NTSYS-pc2.1等软件计算：多态带数NP、多态位点百分率PPL；等位基因平均数Na