液体配制及实验方法.doc

（一）液体配制1. 完全培养基DMEM+10%FBS+1%双抗+（1%HAPS液）若放置时间长于2周 加1%谷氨酰胺2. PBS1000ml去离子水中溶解 8.0gNaCl、 0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO43. 胰酶用之前调节PH值至7.64. CaCl2将0.165gCaCl2粉末溶于10ml去离子水中配制成50X的溶液每5ml胶原酶中加入100l CaCl2溶液（终浓度3mol/L） 用于激活胶原酶的活性5. 双抗终浓度：青霉素 100万U/100ml 链霉素 100万U/100ml青霉素 0.6g为1个单位 链霉素 1.2195g为一个单位称取青、链霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中 再定容至100ml6. 两性霉素B100mg两性霉素B粉末溶于40mlPBS中，制成浓度为2.5mg/ml(1000X)的浓缩液每100ml完全培养基中加入100l 浓缩液，稀释为终浓度2.5g/ml7. 细胞冻存液20%DMSO+80%FBS(1mlDMSO+4mlFBS)8 STZ溶液STZ溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中称取柠檬酸0.105g溶于5mlPBS 称取柠檬酸三钠0.145g溶于5mlPBS中 混合两者制成10毫升的溶解液. 再将100mgSTZ粉末溶于该溶解液中 制成浓度1%的STZ溶液，调节PH值至4.5，4避光保存，由于STZ水溶性不稳定，溶液最好在半小时内使用完毕.9 油红O原液：油红 O 0.6g溶于异丙醇（ 99% ） 100ml 。稀释液：油红 O 原液 20ml ，蒸馏水 20ml ，过滤后使用。10 茜素红称取0.1g茜素红粉溶于100mlPBS，调节PH值到7.2，过滤后使用.11 成骨诱导液配方：DMEM(H)+10%FBS+10mmol/L-甘油磷酸钠+0.1mol/L地塞米松+50mg/LVitC1）-甘油磷酸钠分子量：216 溶于水10mmol/L=216mg/100ml称取216mg-甘油磷酸钠粉末溶于100ml低糖完全培养基中2）地塞米松分子量：392.5 在无水乙醇中的溶解度为1mg/ml.0.1mol/L=0.04mg/L将100mg地塞米松溶于100ml无水乙醇中 制成25000X的浓缩液每100ml低糖完全培养基中加入4l地塞米松浓缩液3）VitC分子量176.1 溶于水 称取5mgVitC粉末溶于100ml低糖完全培养基中12 成脂诱导液配方：DMEM(L)+10%FBS+10mol/L地塞米松+200mol/L吲哚美辛+0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）+10mg/L胰岛素1） 每100ml高糖完全培养基中400l地塞米松浓缩液2）吲哚美辛分子量：357.79 在无水乙醇中的溶解度为1g/50ml PH 7.4以下 0.2mmol/L=7.16mg/100ml 称取720mg吲哚美辛粉末溶于50ml无水乙醇 制成200X的浓缩液 每100ml高糖完全培养基中加入500l吲哚美辛浓缩液3）IBMX分子量：222.25 在DMSO中的溶解度为1M(222.25mg/ml)0.5mmol/L=1.1mg/100ml 将100mgIBMX粉末溶于1mlDMSO 制成100mg/ml(9100X)浓缩液 每100ml高糖完全培养基中加入11lIBMX浓缩液4）Insulin浓缩液浓度为10mg/ml(1000X) 每100ml高糖完全培养基中加入Insulin浓缩液100l.溶解粉末时均需先用少量液体溶解，再定容。（二）细胞培养1.骨髓基质干细胞（BMSC）、脂肪基质干细胞（ADSC）的原代培养1）准备工作所需液体：培养基，血清（FBS），胶原酶消毒（器械、烧杯、滤纸、离心管等）（PBS,枪头，青瓶和塞子，5套器械+34个烧杯+滤纸，离心管50+15ml）水浴锅调节温度至37预热配制BMSC清洗液 将PBS倒入50ml的烧杯中加2%双抗和200ul两性霉素配制ADSC清洗液 由于脂肪组织易污染，故将清洗液装入青瓶中，每100mlPBS加2%双抗和2040ul两性霉素配制骨髓冲洗液（PBS+3%FBS）即300ul血清 BMSC冲洗液及胶原酶可放入37度水浴锅或温箱中预热 2） 取组织 将SD大鼠（4周 60-80g）引颈处死，用75%酒精浸泡5-10分钟 取大鼠内脏脂肪，取脂肪时剪开皮肤及剪取脂肪分别用两套器械减少污染，将取好的腹部脂肪放入事先配制好的青瓶清洗液中取大鼠长骨，尽量将附着的肌肉剔除干净，若骨头断裂髓腔暴露，污染可能性大，弃之。将取出的脂肪及骨头分别在清洗液中清洗3-5次 3） 收集细胞 ADSC: 将清洗后的脂肪组织在广口小青瓶中剪碎，加入适量II型胶原酶（每1ml脂肪组织加1ml胶原酶）以及CaCl2（200X），将混合物移至15ml离心管中37C水浴30分钟（每间隔十分钟震荡15秒）,30分钟后将混悬液用细胞筛网滤过，并用终止夜（10%FBS的PBS）2ml终止消化，收集液体至离心管，1500rpm离心5-6分钟，弃上清重悬细胞，细胞计数并种入培养瓶中，加适量培养基，在培养瓶上标记动物种属、细胞类别、原代、日期. BMSC：用器械剪去长骨两端，暴露骨髓腔，5ml注射器冲洗骨髓腔，收集液体至离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清重悬细胞，细胞计数并种入培养瓶中，加适量培养基，在培养瓶上标记动物种属、细胞类别、原代、日期. 2.换液每2-3天一次，具体时间和频率根据细胞状态及培养基的颜色而定.准备物品：PBS、试管吸管步骤：吸出培养基，PBS清洗2遍，再加入培养基. 原代细胞首次换液时无需PBS清洗.3.传代原代细胞7天后传代，之后每2-7天传代，依据细胞密度及状态而定传代时根据细胞密度选择所传的瓶数，一般1瓶90%融合的细胞可传2-4瓶.准备物品：15ml离心管、试管吸管、培养瓶、PBS、培养基、胰酶（ph调至7.4-7.6）步骤：1）吸出培养基，用PBS清洗2遍（应彻底清除培养基，否则血清会影响胰酶的消化作用）2) 加3-5ml（75cm规格培养瓶）胰酶至培养瓶中，放入37C水浴锅或培养箱中消化2-3分钟，此过程中，显微镜下观察细胞形态由梭形变为圆形，立即加入3-5ml培养基终止消化.3）用吸管轻柔吹打内壁数次帮助细胞脱落，也可用手轻拍瓶壁数下，将细胞悬液收集至离心管中，1000rpm离心6-8分钟4）沿细胞沉淀方向缓慢倾倒液体，加1ml培养基重悬，将重悬液分配至各培养瓶中，再加入适量培养基，标记日期、代数.4.冻存准备物品：15ml离心管、试管吸管、冻存管、PBS、培养基、胰酶、冻存液、冰步骤：1）将冻存液及培养基冰浴，保持低温,2) 如传代步骤中的1-3将细胞离心后，加入冰浴的培养基500l重悬，移至冻存管中3）在冻存管中加入等量冻存液，约550l（一滴一滴地加入），混匀4）直接放入-80C冰箱（梯度降温效果不理想），过夜转入液氮罐5.复苏准备物品：37C水浴锅、15ml 离心管、培养瓶、培养基步骤：1）预热水浴锅（37C），在离心管中事先加入7-8ml培养基2）将冻存的细胞在37C水浴锅中迅速地摇晃，使其快速溶解3）将1ml培养基加入冻存管中（一滴一滴地加入），混匀4）将冻存管中混匀的细胞悬液加入有培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟5）弃上清，用1ml培养基重悬细胞，种入培养瓶，加适量培养基，标记6.细胞计数步骤：1）细胞悬液的制备同前2）取细胞悬液15l与等量0.08%胎盘蓝染液混合，将30l混合液注入细胞计数板3）数出四个象限（各16小格）的细胞总数后除以4，再乘以稀释倍数（一般细胞悬液与染液是1：1混合，故乘以2），最后乘以104，即为细胞数量7.流式细胞检测前的样品制备准备物品：15ml离心管、1.5mlEP管、PBS、洗涤液（PBS+1%FBS）步骤：1）将细胞消化、离心、去上清2）用洗涤液洗涤一次，加1ml洗涤液重悬，将细胞悬液分装至数个EP管中（数量依据上机管数而定）3）继续用洗涤液将EP管中的细胞洗涤2遍，最后每管中加适量PBS重悬4）将所需抗体与PBS进行1：1稀释，每EP管细胞悬液中加3-5l相应抗体，保留1管空白对照，4C保存，待上机8.流式细胞检测的抗体选择设置同型对照，也可设置双标（FITC/PE）1)CD29-FITC hamster IgG control2)CD45-FITC mouse IgG1 control3)CD44-FITC mouse IgG2a control4)CD34-FITC rabbit IgG control9.细胞爬片的制备准备物品：六孔板、盖玻片、离心管、PBS、胰酶、培养基步骤：1）将第三代ADSC（数量约为2x104）制成细胞悬液1.8ml2）将消毒好的盖玻片放入六孔板中，每孔取300l细胞悬液平铺在盖玻片上3）待细胞贴壁后（约30分钟），每孔加入约3ml 培养基10.干细胞的诱导分化1）成骨诱导：ADSC(P3-P5)制细胞爬片，待细胞70%融合后，将培养基换成成骨诱导液诱导，每3天换液，共诱导21天，之后进行茜素红染色2）成脂诱导: ADSC(P3-P5)制细胞爬片，待细胞70%融合后，将培养基换成成脂诱导液诱导，每3天换液，诱导21天，之后进行油红O染色11.染色方法茜素红法作用原理：利用沉积的钙于茜素红发生显色反应，得到红色的染色效果。步骤：1） 吸去诱导液，再PBS洗一到两次； 2） 加入10中性甲醛，固定30min-60min； 3） 吸去固定液，加入0.1%的茜素红染色液，染色6-10min； 4） 用PBS洗两次，去处残留的染色液；结果：染料品种的不同，矿化结节呈现不同的红色。油红O染色法作用原理：细胞在胞浆中不断有油滴的累积，并不断的增加变大，利用Oil Red O的油溶性对油滴染色。步骤：1） 吸去诱导液，再PBS洗一到两次；2） 加入10中性甲醛，固定60min；3） 吸去固定液，加入现配和过滤后的Oil Red O染色液，染色60min；4） 用PBS洗2-5次，去处残留的染色液和残渣结果：分化的脂肪细胞呈红色（三）动物模型的建立免疫炎性1型糖尿病小鼠模型的建立采用小剂量多次STZ腹腔注射Balb/c小鼠（6-8周，22-25g）、1%STZ、 40-60mg/Kg剂量连续五天注射步骤：1）小鼠禁食过夜2）次日清晨，甲紫溶液标记小鼠，测空腹血糖，称体重，计算所需药物剂量3）配制1%STZ溶液（方法件上文）4）1ml注射器抽取STZ对小鼠进行腹腔注射（注意注射器内因残留而损失的药物）重复上述步骤共五天在造模第三天进行第一次干细胞注射步骤：1）制细胞悬液，每只小鼠1X106细胞2）注射器抽取细胞悬液，用5#或4.5#头皮针对小鼠进行尾静脉注