清洁生产_日本某公司液相色谱基础知识

液相色谱基础知识 一 色谱起源 液相色谱 以液体作为流动相的色谱分离方法适用于高沸点 大分子 强极性和热稳定性差的化合物的分析流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用气相色谱 以气体作为流动相的色谱分离方法适用于沸点较低 热稳定性好的中小分子化合物的分析流动相只起运载样品分子的能力 液相色谱基础知识 HPLC的分离类型 正相色谱 NP HPLC 反相色谱 RP HPLC 反相离子对色谱 RPIC 离子交换色谱 IEC 空间排阻色谱 SEC 手性化合物分离模式 Chiralseparationmode 液相色谱按两相极性不同分为 正相色谱反相色谱化合物保留时间随流动相配比的变化不同极性的化合物出峰顺序 正相HPLC色谱柱 硅胶型氰基型氨基型糖类分析二醇基型蛋白质分析 Silicagel Si Si Si CH2CH2CH2CN Si CH2CH2CH2NH2 Si CH2CH2CH2OCH OH CH2 OH ModifiedSi 反相HPLC色谱柱 C18 ODS typeC8 octyl typeC4 butyl typePhenyltypeTMStypeCyanotype Si C18H37 Si Non polarproperty 色谱柱 非极性溶剂 极性水 甲醇 乙腈 反相色谱 液相色谱流程图 输液泵 进样器 色谱柱 柱温箱 检测器 溶剂 数据处理 流动相 流动相选择注意事项 纯度 采用 HPLC 级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相配制时的顺序 溶剂等级 水的等级纯化水蒸馏水去离子水 波长 nm 纯化水 去离子水 因为不纯物的存在 去离子的吸光率较高 纯化水中去除了无机和有机的污染物 吸光率 水 MeOH梯度ODS柱 鬼峰 GradientCurve 1ml min 0 100 MeOHover10minsandholdfor15mins 溶剂等级 鬼峰的出现 溶剂等级 溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯 都经过蒸馏和0 45um的过滤 除纤维毛 未溶解的机械颗粒 优级纯的纯度比分析纯大 但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0 22um的过滤 且除去有紫外吸收的杂质 微量分析 梯度洗脱 甲醇乙睛正己烷 分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图 溶剂等级 溶剂前处理 过滤 0 45um或更小孔径滤膜目的 除去溶剂中的微小颗粒 避免堵塞色谱柱 尤其是使用无机盐配制的缓冲液 过滤膜种类水系过滤膜有机系过滤膜 30mm内径 适用于大进样量的过滤 由0 22 m和0 45 m两种规格 材料有纤维素 醋酸纤维 聚四氟乙烯 处理样品体积少于50 l 13mm内径 适用于范围广的过滤 由0 22 m和0 45 m两种规格 材料为纤维素 3mm内径 适用于小进样量的过滤 由0 22 m和0 45 m两种规格 处理样品体积为7 l 样品过滤头的类型 滤膜类型 聚四氟乙烯滤膜 适用于所有溶剂 酸和盐 并无任何可溶物 醋酸纤维滤膜 不适用于有机溶剂 特别适用于水基溶液 推荐用于蛋白质和其相关样品 尼龙66滤膜 适用于绝大多数有机溶剂和水溶液 可用于强酸 70 乙醇 二氯甲烷 不适用于二甲基甲酰胺 再生纤维素滤膜 具有蛋白吸收低 同样适用水溶性样品和有机溶剂 溶剂前处理 脱气目的 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡一般混合溶剂中能容纳的空气量往往要比单个溶剂所能容纳的空气总量要小气泡对测定的影响 1 柱压波动 流量偏小2 基线波动 返回 流路中形成气泡引起的问题 改变保留时间和峰面积流动相中形成气泡对液流的不良影响泵中形成气泡使液流波动峰变形柱中气泡形成和累积使流动相绕流尖峰或锯齿状噪声检测池中气泡形成和累积产生基线噪声 输液泵 输液泵控制方式 恒流控制恒压控制 输液泵类型 注射泵柱塞往复泵隔膜泵 柱塞往复泵 柱塞往复泵 优点压力脉动小易于更换溶剂缺点需要更换柱塞杆密封圈 岛津VP系列输液泵 目的单元流速范围特性和应用 分析LC 10ADVP0 001 9 999无脉动 适于半微量LC和LC MS LC 10ATVP0 001 9 999非凡的耐用性 适于常量分析 所有单元都既可做高压梯度又可做低压梯度 等度洗脱 梯度洗脱 分析时间长 分离度差 MeOH H2O 6 4 MeOH H2O 8 2 column ODStype 等度洗脱 95 30 MeOH浓度 梯度洗脱 梯度洗脱 优点 可提高分离度 缩短分离时间 降低最小检测量和提高分离精度注意事项 溶剂的纯度要高 否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器 如紫外吸收检测器或荧光检测器 而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器 如示差折光检测器 混合器 低压梯度比例阀 高压梯度 低压梯度 脱气机 高压 低压梯度系统 返回 高压梯度系统梯度准确度好系统复杂 需两台或三台泵 低压梯度系统系统简单需在线脱气机存在时间滞后效应 高压 低压梯度系统 进样器 自动进样器手动进样器原理 六通阀 注入方式 1 全量注入2 部分注入 返回 手动进样器的原理图 装填状态 进样状态 返回 进样体积 检测器响应值 定量管体积的一半 3倍定量管体积 全量注入 部分注入 进样体积与响应值关系 返回 柱温箱 分析结果重现性好提高柱效降低柱压保证检测稳定性 柱温控制的优点 色谱柱 1 柱压低于150kgf cm2 15cm色谱柱 2 柱温在40 左右 最高使用温度为50 3 流动相PH使用范围为2 7 5 返回 ODS柱的使用注意点 流动相注意点 离子对试剂的使用具有缓冲盐流动相的使用分析结束及开始流动相平衡加快平衡时间异丙醇的使用 LC检测器 紫外可见检测器 UV VIS 二极管阵列检测器 PDA 示差检测器 RID 电导检测器 CDD 荧光检测器 RF 电化学检测器 L ECD 质谱检测器 MS 蒸发光散射检测器 ELSD 紫外可见检测器 原理 基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础 Lambert Beer定律 A KCL优点 1 对温度和流速变化不敏感2 可用于梯度分析缺点 仅适用于测定有紫外吸收的物质 紫外可见检测器 紫外可见检测器 岛津VP系列紫外检测器功能 1 设定时间程序 波长切换等 2 双波长检测3 比例色谱 初步判断峰的纯度4 停泵扫描 确定组分最大吸收波长 NEXT 波长切换 返回 双波长检测 返回 比例色谱 280nm 220nm ratio280 220 返回 波长扫描 返回 二极管阵列检测器 SPD M10AVP 二十一世纪标准紫外检测器色谱信息 保留时间常规紫外检测器紫外光谱二极管阵列检测器 样品池 二极管阵列 512个单元 光栅 D2 W灯 每一单元可检测一个波长下的吸光度 二极管阵列检测器 三维谱图 二极管阵列检测器的优点 1 采集三维谱图2 峰纯度检验3 光谱库检索 NEXT 峰纯度检验 3点光谱图比较 Initialdetectionpoint Finaldetectionpoint T1 T3 T2 peaktop upslope downslope 1 2 1 3 乙酰水杨酸 下降点 上升点 顶点 峰纯度检验 3点光谱图比较 返回 光谱库检索 返回 检测器 原理 连续测定流通池中溶液折射率变化以测定试样各组分浓度 优点 通用型检测器缺点 1 对温度和压力变化敏感2 不能用于梯度分析 示差折光检测器 返回 糖的色谱图 AnalyticalConditionsColumn Shim packCLC NH2Mobilephase Acetonitrile water 7 3Flowrate 1 0mL minTemperature AmbientPeaks1 甘油2 木糖3 果糖4 葡萄糖5 蔗糖6 甘露糖7 乳糖 荧光检测器 原理 基于被分析组分发射的荧光强度进行检测缺点 仅适用于测定可产生荧光的物质优点 1 灵敏度极高 是最灵敏的检测器之一