质粒抗性.doc

质粒质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了拟核中的DNA外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)（补充：部分质粒为RNA）。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40106以上，较小一类的相对分子质量是10106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对)。名称长度抗性特殊性能PAO8157709bpAmp酵母表达pAxCAwt44741BPAmp腺病毒表达pAxcw42410bpAmp腺病毒表达pAAV-MCS4.7kbpAmp哺乳动物细胞表达pBacPAK85.5kAmp杆状病毒表达PBI12113.0kbpKan植物细胞表达pBV2203665bpAmp原核表达pCAMBIA1300植物细胞表达pCAMBIA130111837bpKan植物细胞表达pCAT3-Basic4047bpAmppcDNA35446bpAmp哺乳动物细胞表达pcDNA3.1(+)5428bpAmp哺乳动物细胞表达pcDNA3.1/mys-HisA5494bpAmp哺乳动物细胞表达pCl-neo5472bpAmp哺乳动物细胞表达pCMV-MCS4.5kbpAmp哺乳动物细胞表达pET-3a4640bpAmp大肠杆菌表达pET-11a5677bpAmp大肠杆菌表达pET-15b(+)5708bpAmp大肠杆菌表达pET-20b(+)3716bpAmp大肠杆菌表达pET-22b(+)5493bpAmp大肠杆菌表达pET-23a(+)3666bpAmp大肠杆菌表达pET-23b(+)3665bpAmp大肠杆菌表达pET-23c(+)3664bpAmp大肠杆菌表达pET-23d(+)3663bpAmp大肠杆菌表达pET-28a(+)5369bpKan大肠杆菌表达pET-28b(+)5368bpKan大肠杆菌表达pET-28c(+)5367bpKan大肠杆菌表达pET-30a(+)5422bpKan大肠杆菌表达pET-30b(+)5421bpKan大肠杆菌表达pET-30c(+)5423bpKan大肠杆菌表达pET-31b(+)5742bpAmp大肠杆菌表达pET-32a(+)5900bpAmp大肠杆菌表达pET-32b(+)5899bpAmp大肠杆菌表达pET-32c(+)5901bpAmp大肠杆菌表达pET-39b6106bpKan大肠杆菌表达pET-42a5930bpKan大肠杆菌表达pGAPZaA3147bpZeo酵母表达pGBKT77.3kbpKan酵母表达pGEM3Zb原核表达pGEM3Zf(+)原核表达pGEM7Zf(+)原核表达pGEX-2T4969bpAmp原核表达pGEX-4T-14969bpAmp原核表达pGFP-N24732bpKan哺乳动物细胞荧光蛋白表达pEGFP-C14731bpKan哺乳动物细胞荧光蛋白表达pEGFP-C34727bpKan哺乳动物细胞荧光蛋白表达pEGFP-N14733bpKan哺乳动物细胞荧光蛋白表达pLEGFP-N16892bpAmp哺乳动物细胞荧光蛋白表达pGL3-Basic4818bpAmppGL36pLNCX6620bpAmp反转录病毒表达pLNHX5.6kbpAmp反转录病毒表达pLXSN5.9kbpAmp反转录病毒表达pLXIN6.1kbpAmp反转录病毒表达pMAL-p2x6721bpAmp原核融合蛋白表达pMAL-c2x6721bpAmp原核融合蛋白表达pPIC3.5K9004bpAmp/Kan酵母表达pPIC98024bpAmp酵母表达pPIC9K9276bpAmp酵母表达pPICZaA3593bpZeo酵母表达pQBIPGK5387bpAmp哺乳动物细胞荧光蛋白表达pQE-303461bpAmp原核表达pQE-93439bpAmp原核表达pRevTRE6487bpAmp反转录病毒表达pSE420L4617bpAmppTacIAmp原核表达pTacI(BamHI)Amp原核表达pTAL-Luc4956bpAmp哺乳动物细胞表达pTWIN17375bpAmppTXB16706bpAmppVAX12999bpKan质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：1）三条带，按照电泳泳动速度（快到慢）排列为：超螺旋、缺口闭环、开环。经常会出现。2）两条带，超螺旋/闭环/开环 任意两种。3）一条带，超螺旋。至于那种情况好，要看我们进一步实验的目的了。1）进行分子克隆的操作，构建载体。这随便那种情况都可以，不会影响你的后续实验。所以在这种情况下，没必要评比谁好谁不好。2）进行细胞转染。因为转染必须要超螺旋，所以它们的质量好坏顺序是： 3）、2）、1）。 还有一种:变性的超螺旋，原因是菌体与溶液 II 接触的时间过长。分子克隆对此现象也有提到。有一个共同点：它们都没有认为这是个问题，因为该条带的存在对后续实验没有任何影响。如果该条带比例过大，适当减少加入溶液 II 后的裂解时间，以得率的少量损失为代价，是可以部分改善的。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(OpencircularDNA,简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(LinearDNA)。当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。所谓穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的